廖 杰，任曉婷，尹宗寧（四川大學(xué)華西藥學(xué)院靶向藥物與釋藥系統(tǒng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 610041）

·制劑與工藝·

載納豆激酶的三甲基殼聚糖納米粒的制備及體外釋放度研究Δ

廖 杰＊，任曉婷，尹宗寧#（四川大學(xué)華西藥學(xué)院靶向藥物與釋藥系統(tǒng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 610041）

目的：制備載納豆激酶（NK）的三甲基殼聚糖（TMC）納米粒（TMC-NK-NPs），并研究其體外釋放度。方法：合成季胺化度分別為15%、20%、25%的TMC（即TMC15、TMC20、TMC25），將其與NK自組裝形成TMC-NK-NPs。測定TMC-NK-NPs的粒徑、多分散系數(shù)（PDI）、Zeta電位，篩選TMC；觀察并測定最優(yōu)處方制備的TMC-NK-NPs的形態(tài)、包封率、載藥量、4℃避光下30 d的穩(wěn)定性、24 h內(nèi)的體外累積釋放度（Q）及NK活性。結(jié)果：采用TMC20所制TMC-NK-NPs的粒徑較小[（161.0±4.8）nm]，PDI最小（0.204），Zeta電位為（19.2±1.5）mV，呈球形或類球形；包封率為（45.4±1.51）%，載藥量為（14.2±0.25）%；30 d內(nèi)相對穩(wěn)定；峰值Q12h為92.3%；NK活性在1 h時(shí)就達(dá)到最大（76.6%），但隨著時(shí)間延長，活性降低。結(jié)論：成功制得形態(tài)圓整、包封率與載藥量較高，且具有較好緩釋作用的TMC-NK-NPs。

三甲基殼聚糖；納豆激酶；納米粒；體外釋放度；制備

血栓的形成是心腦血管疾病發(fā)病的主要原因，溶栓治療是治療血栓病最有效的方法[1]，目前主要治療方法是靜脈溶栓治療。但臨床應(yīng)用的各種溶栓藥物血漿半衰期短、靶向性不強(qiáng)，易引起體內(nèi)出血等并發(fā)癥[2]。納豆激酶（Nattokinase，NK）作為一種新型溶栓藥物，不僅在體內(nèi)外有強(qiáng)烈的溶栓作用，而且還能誘導(dǎo)內(nèi)源性溶栓[3]，但作為蛋白類藥物，其在體內(nèi)易降解失活。殼聚糖（CS）是自然界來源第二大豐富的親水性多糖，生物相容性好，無不良反應(yīng)，是良好的生物相容性材料[4]。其弱酸水溶液具有高黏性，帶正電荷，已被廣泛用于藥物載體和醫(yī)用輔料[5]。CS季胺化修飾后得到三甲基殼聚糖（TMC），其在更廣泛的pH范圍內(nèi)都具有良好的溶解性[6]。目前用于研究自組裝載藥納米粒的蛋白有內(nèi)皮生長因子、卵清蛋白、胰島素等[7-9]。本研究采用NK與TMC自組裝形成納米粒（TMCNK-NPs），通過將NK制備成納米給藥系統(tǒng)，可以提高其穩(wěn)定性、延長其體內(nèi)半衰期、避免出血等副作用，使其更有效地治療血栓類疾病。

1 材料

1.1 儀器

Unity Inova 400核磁共振儀（美國Varian公司）；Cary 100紫外分光光度計(jì)（天美科學(xué)儀器有限公司）；Varioskan Flash化學(xué)發(fā)光儀（美國Thermo Scientific公司）；NanoSizer ZS90激光粒度分析儀（英國馬爾文公司）；H-6001V透射電子顯微鏡（日本Hitachi公司）。

1.2 藥品與試劑

NK原料藥（美國National Enzyme公司，批號：20130524，酶活性：40 000 FU/g）；CS（上海瑞永生物科技有限公司，分子質(zhì)量：150 kDa）；二喹啉甲酸（BCA）蛋白濃度測定試劑盒（江蘇碧云天生物科技有限公司）；對甲基苯磺酰-L-精氨酸甲酯（TAME，阿達(dá)瑪斯試劑有限公司）；其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 TMC的合成與表征

采用一步合成法，制備不同季胺化度（DQ）的TMC。稱取CS 2 g和碘化鈉（NaI）4.8 g，加入80 ml N-甲基-2-吡咯烷酮，在避光條件下60℃冷凝回流，反應(yīng)2 h；向反應(yīng)液中加入15%的氫氧化鈉（NaOH）11 ml和碘甲烷（CH3I）11.5 ml，繼續(xù)避光冷凝回流反應(yīng)1～3 h。將反應(yīng)液用乙醇沉淀，4 000 r/min（離心半徑10.0 cm）離心10 min，再乙醚清洗沉淀，同上條件離心分離沉淀后溶于去離子水中，先后在氯化鈉（NaCl）溶液和去離子水中透析3 d，冷凍干燥即得白色海綿狀固體TMC[10]。取少量凍干后的TMC樣品溶于0.5 ml重水（D2O）中，通過1H核磁共振（1H-NMR）進(jìn)行分析，計(jì)算TMC的DQ（%）＝（∫TM/∫H）×1/9×100%，式中∫TM是在3.2～3.4 ppm范圍內(nèi)季胺化氨基的積分；∫H是在4.7～5.7 ppm范圍內(nèi)1H峰的積分[11]，控制DQ分別約為15%、20%、25%的TMC，即TMC15、TMC20、TMC25。TMC15、TMC20和TMC25的1H-NMR圖見圖1。

圖1 TMC15、TMC20和TMC25的1H-NMR圖Fig 1 1H-NMR spectra of TMC15，TMC20 and TMC25

2.2TMC-NK-NPs的制備

通過初步處方篩選，確定了NK溶液的pH為9.0，TMC與NK按相同質(zhì)量濃度、等體積混合，可以得到較好的TMC-NKNPs。將帶負(fù)電荷的NK溶液（pH 9.0）與帶正電荷的不同DQ的TMC（TMC15、TMC20和TMC25）等體積混合后，攪拌20 min，靜置20 min，通過靜電作用自組裝形成穩(wěn)定的TMC-NKNPs，其pH為8.3～8.5。

2.3TMC-NK-NPs的表征

采用激光粒度分析儀分別測定TMC-NK-NPs樣品的粒徑分布、多分散系數(shù)（PDI）、Zeta電位。設(shè)置測定粒徑參數(shù)，溫度為25℃，平衡時(shí)間為1 min，取1 ml樣品加入樣品池，重復(fù)測定樣品3次，取平均值。設(shè)置測定電位參數(shù)，溫度為25℃，取0.1 ml樣品加入1 ml水稀釋后注入電位測定樣品池，確保無氣泡，重復(fù)測定樣品3次，取平均值。不同DQ的TMC所制TMCNK-NPs的粒徑分布、PDI、Zeta電位的測定結(jié)果見表1。

表1 不同DQ的TMC所制TMC-NK-NPs的粒徑、PDI、Zeta電位的測定結(jié)果Tab 1 Particle size，PDI and Zeta potential of TMC-NKNPs prepared by TMC with different degree of quaternization

以粒徑和PDI為指標(biāo)篩選TMC-NK-NPs的處方。由表1可見，按處方5所制備的TMC-NK-NPs的粒徑較小、PDI最小，故選擇處方5為最優(yōu)處方。按最優(yōu)處方制備TMC-NK-NPs，測得其粒徑為（161.0±4.8）nm，Zeta電位為（19.2±1.5）mV。其粒徑和Zeta電位分布見圖2。

圖2 TMC-NK-NPs的粒徑和Zeta電位分布Fig 2 Particle size and Zeta potential distribution of TMCNK-NPs

2.4 TMC-NK-NPs形態(tài)的觀察

采用透射電子顯微鏡觀察最優(yōu)處方制備的TMC-NK-NPs的形態(tài)。將TMC-NK-NPs樣品靜置于銅網(wǎng)上，經(jīng)過1%乙酸鈾染色10 min，再用適量濾紙吸走多余染液，自然晾干后在透射電鏡下觀察。結(jié)果顯示，TMC-NK-NPs呈球形或類球型，分布較均勻。TMC-NK-NPs的透射電鏡圖見圖3。

圖3 TMC-NK-NPs的透射電鏡圖Fig 3 TEM image of TMC-NK-NPs

2.5 TMC-NK-NPs包封率和載藥量的測定

采用超濾法測定TMC-NK-NPs的包封率和載藥量。將TMC-NK-NPs混懸液置于300 kDa的超濾離心管，在4℃下12 000 r/min（離心半徑8.2 cm）離心15 min，取外管中濾過液，采用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定游離NK的含量。按公式計(jì)算包封率和載藥量：包封率（%）＝（NK總量－游離NK的量）/NK總量×100%，載藥量（%）＝（NK總量－游離NK的量）/ TMC-NK-NPs干質(zhì)量×100%。結(jié)果顯示，TMC-NK-NPs的包封率為（45.4±1.51）%，載藥量為（14.2±0.25）%。

2.6TMC-NK-NPs穩(wěn)定性考察

將TMC-NK-NPs混懸液置于具塞西林瓶密封，4℃避光條件下儲存，分別于0、1、2、7、14、30 d取樣，用激光粒度分析儀測定粒徑和PDI。結(jié)果顯示，TMC-NK-NPs在放置過程中粒徑逐漸增大，但PDI始終小于0.3，表明其在30 d內(nèi)相對穩(wěn)定。4℃避光下TMC-NK-NPs的粒徑、PDI隨時(shí)間變化曲線見圖4。

2.7 TMC-NK-NPs體外釋放考察

取8個(gè)5 ml加蓋離心管，每個(gè)試管加入3 ml磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 7.4），全部置于37℃水浴鍋，分別加入0.5 ml TMCNK-NPs混懸液，100 r/min恒溫振蕩[12]。分別在0、0.5、1、2、4、8、12、24 h依次從離心管中取0.5 ml溶液至2.0 ml的超濾離心管內(nèi)，4℃下12 000 r/min（離心半徑8.2 cm）離心15 min，取外管濾過液，用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定游離NK含量。試驗(yàn)重復(fù)3次，獲得上述時(shí)間點(diǎn)所測NK平均值，繪制NK釋放曲線。結(jié)果顯示，TMC-NK-NPs在4 h內(nèi)迅速釋放NK達(dá)到83.8%，在12 h達(dá)到最大釋放度92.3%，在12 h后，NK累積釋放度緩慢減少。其原因可能是NK在釋放條件下放置時(shí)間過長，少量的NK發(fā)生降解；另外，還可能是高分子材料TMC表面帶有一定的正電荷，又將NK吸附回去，導(dǎo)致累積釋放度降低。TMC-NK-NPs的體外釋放曲線見圖5。

圖4 4℃避光下TMC-NK-NPs的粒徑、PDI隨時(shí)間變化曲線圖Fig 4 Change curves for particle size and PDI of TMC-NKNPs at 4℃and dark place

圖5 TMC-NK-NPs的體外釋放曲線Fig 5 Release curve of TMC-NK-NPs in vitro

2.8 體外釋放NK的相對活性測定

采用TAME底物法測定NK的活性。其測定原理是：有活性的NK能催化TAME分解產(chǎn)生甲醇，其分解速度與NK的量成正比；分解產(chǎn)生的甲醇被高錳酸鉀（KMnO4）氧化成甲醛，甲醛與變色酸反應(yīng)生成藍(lán)紫色復(fù)合物，此復(fù)合物在574 nm波長處有最大紫外吸收，可用于定量計(jì)算NK的相對活性。取TMC-NK-NPs混懸液，測定同“2.7”項(xiàng)下釋放條件下釋放出的NK活性。結(jié)果顯示，TMC-NK-NPs在緩慢釋放過程中，1 h內(nèi)NK活性逐漸增加，且達(dá)到最大（76.6%），這是因?yàn)檫@段時(shí)間內(nèi)NK累積釋放度不斷增加；1 h后NK活性逐漸降低，這說明在37℃、100 r/min恒溫振蕩條件下NK在磷酸鹽緩沖液（PBS）中不穩(wěn)定。TMC-NK-NPs的釋放活性曲線見圖6。

圖6 TMC-NK-NPs的釋放活性曲線Fig 6 Release activity curve of TMC-NK-NPs

3 討論

包封率是評價(jià)納米粒的一項(xiàng)重要指標(biāo)，測定包封率的方法包括葡聚糖凝膠過濾法、透析法、離心法、超濾法。由于NK是一種混合物，分子質(zhì)量為20～30 kDa，葡聚糖凝膠分離效果不好。透析法需要較大截留分子質(zhì)量的透析袋，且透析介質(zhì)中游離的NK濃度較低，不便于測定。另外NK分子質(zhì)量較大，直接采用高速離心取上層清液測定游離的NK含量，NK含量會隨著離心時(shí)間的延長而減少，說明NK會因高速離心沉淀到試管底部，導(dǎo)致計(jì)算的包封率偏高。所以，本研究采用超濾離心管測定包封率，測定結(jié)果較為準(zhǔn)確。

采用高分子聚合物和蛋白藥物自組裝，篩選大量處方，成功制備了TMC-NK-NPs。該制備方法簡單，無需復(fù)雜設(shè)備，避免了有機(jī)溶劑、超聲、加熱等對蛋白穩(wěn)定性的影響。制得的納米粒粒徑在納米級，PDI也較小。測定納米粒包封率和體外釋放均采用了超濾管高速離心（12 000 r/min），若降低離心速度至6 000 r/min，則需要較長離心時(shí)間才能過濾完全，但兩種條件下包封率相差不大，故采用時(shí)間較短的高速離心。體外釋放采用透析袋釋放時(shí)，由于高分子材料TMC的吸附作用，在100 kDa的透析袋中NK不能完全釋放，最大釋放度不超過50%，所以釋放方法改為直接在釋放介質(zhì)中釋放藥物。筆者將CS甲基化得到的TMC直接溶于水，避免了加入有機(jī)溶劑對蛋白穩(wěn)定性產(chǎn)生影響。TMC表面正電荷較高，能更好地包裹吸附溶液中帶負(fù)電荷的NK。制備的TMC-NK-NPs可用于iv給藥，相對于po給藥，能避免首關(guān)效應(yīng)；另外由于納米粒載體對NK具有保護(hù)作用，而且粒徑較小，能避免巨噬細(xì)胞的吞噬，提高藥物療效。本研究不足之處是，自組裝方法制備的TMCNK-NPs包封率不高，有待進(jìn)一步改進(jìn)。

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Preparation of Nattokinase-loaded Trimethyl Chitosan Nanoparticles and Study on Its Release Rate in vitro

LIAO Jie，REN Xiaoting，YIN Zongning（Key Lab of Drug Targeting and Drug Delivery，Ministry of Education，West China School of Pharmacy，Sichuan University，Chengdu 610041，China）

OBJECTIVE：To prepare nattokinase（NK）-loaded trimethyl chitosan（TMC）nanoparticles（TMC-NK-NPs），and to study its release rate in vitro.METHODS：TMC with different degree of quaternization（15%，20%，25%）were synthetized，i.e. TMC15，TMC20，TMC25；those were combined with NK to form TMC-NK-NPs by self-assembly.The particle size，polydispersity index（PDI）and Zeta potential were determined and TCM was screened；the morphology，entrapment efficiency（EE），drugloading amount，30 d stability at 4℃ and dark place，24 h accumulative release rate in vitro（Q）and NK activity of TMC-NKNPs by optimal formulation were observed and determined.RESULTS：Using TMC20，TMC-NK-NPs were smaller in particle size [（161.0±4.8）nm]，the lowest in PDI（0.204）；the Zate potential was（19.2±1.5）mV，spherical or spherical-like，EE was（45.4±1.51）%，drug-loading amount was（14.2±0.25）%，stable within 30 d，the peak Q12hwas 92.3%.The maximum released activity of NK was 76.6%at 1 h，but then gradually decreased with time.CONCLUSIONS：TMC-NK-NPs are prepared successfully，round and complete with high EE and drug-loading amount，good sustained-release property.

Trimethyl chitosan；Nattokinase；Nanoparticles；Release rate in vitro；Preparation

R943

A

1001-0408（2016）31-4403-04

2016-01-29

2016-03-25）

（編輯：鄒麗娟）

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（No.81373338）

＊碩士研究生。研究方向：緩控釋給藥系統(tǒng)。電話：028-85503617。E-mail：liaojiemu09@163.com

#通信作者：教授，博士。研究方向：緩控釋給藥系統(tǒng)。電話：028-85502917。E-mail：yzn@scu.edu.cn

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2016.31.25