魏士杰，陳文強(qiáng)（1.陜西理工大學(xué)校醫(yī)院，陜西漢中 723000；2.陜西理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，陜西漢中 723000）

云芝多糖對(duì)小鼠黑色素瘤B16細(xì)胞體外增殖和凋亡的影響及其機(jī)制Δ

魏士杰1＊，陳文強(qiáng)2#（1.陜西理工大學(xué)校醫(yī)院，陜西漢中 723000；2.陜西理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，陜西漢中 723000）

目的：研究云芝多糖（CVP）對(duì)小鼠黑色素瘤B16細(xì)胞體外增殖、凋亡的影響及其機(jī)制。方法：采用MTT法測(cè)定以二甲基亞砜（DMSO，陰性對(duì)照）和0（空白對(duì)照）、0.156、0.312 5、0.625、1.25、2.5、5.0、10.0 μg/ml CVP分別培養(yǎng)細(xì)胞48、72 h后的細(xì)胞存活率，計(jì)算半數(shù)抑制濃度（IC50）；流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定以DMSO（陰性對(duì)照）和0（空白對(duì)照）、0.5 μg/ml CVP分別培養(yǎng)細(xì)胞24、48、72 h后的細(xì)胞凋亡率；實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法測(cè)定以DMSO（陰性對(duì)照）、0.5 μg/ml CVP培養(yǎng)細(xì)胞48、72 h后細(xì)胞中凋亡相關(guān)基因P53、Bcl-2、Fas mRNA的表達(dá)。結(jié)果：0.156～10.0 μg/ml CVP對(duì)B16細(xì)胞的生長(zhǎng)均有抑制作用，并在0.156～0.625 μg/ml范圍內(nèi)呈濃度和時(shí)間依賴性，培養(yǎng)48、72 h的IC50分別為（0.32±0.01）、（0.18±0.04）μg/ml。0.5 μg/ml CVP培養(yǎng)細(xì)胞24、48、72 h后，細(xì)胞凋亡率較陰性對(duì)照和空白對(duì)照均明顯升高（P＜0.01）；0.5 μg/ml CVP培養(yǎng)細(xì)胞48、72 h后，細(xì)胞中P53、Bcl-2、Fas mRNA表達(dá)水平較陰性對(duì)照明顯降低（P＜0.01）。結(jié)論：CVP可抑制小鼠B16細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)其凋亡，其機(jī)制可能與下調(diào)細(xì)胞中P53、Bcl-2和Fas基因的表達(dá)有關(guān)。

云芝多糖；黑色素瘤B16細(xì)胞；增殖；凋亡；體外

云芝為多孔菌科真菌彩絨革蓋菌[Coriolus versicolor（L. ex Fr.）Quel]的干燥子實(shí)體，是我國(guó)傳統(tǒng)的藥用真菌，被廣泛用于癌癥和免疫缺陷等疾病的治療[1]。云芝子實(shí)體或菌絲體提取液經(jīng)注射或口服給藥后對(duì)胃癌、結(jié)腸癌、食管癌、乳腺癌、肺癌等多種實(shí)體瘤的生長(zhǎng)均有明顯抑制作用[2-3]。云芝多糖（Coriolus versicolor polysaccharides，CVP），在中國(guó)也稱云芝糖肽（Polysaccharide peptide，PSP），在日本多稱云芝多糖（Polysaccharide krestin，PSK），是從云芝子實(shí)體或培養(yǎng)的菌絲體中提取的具有多種藥理作用的多糖類物質(zhì)[4]。CVP是云芝子實(shí)體中的主要活性成分，也是天然多糖的典型代表，具有直接抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的作用[5]。真菌子實(shí)體和菌絲體代表了真菌的不同發(fā)育階段，兩者體內(nèi)多糖的相對(duì)分子質(zhì)量不同，結(jié)構(gòu)也有差異[6]，推測(cè)其抗腫瘤的作用也有不同。目前報(bào)道的有關(guān)CVP的抗腫瘤研究也多以菌絲體多糖為研究對(duì)象[7]。在中國(guó)傳統(tǒng)中醫(yī)藥中，云芝子實(shí)體是多類中藥產(chǎn)品的原料，子實(shí)體多糖是中藥制劑或產(chǎn)品的主要成分之一，具有廣泛的免疫調(diào)節(jié)和抗腫瘤作用，子實(shí)體多糖有潛力開發(fā)成為抗腫瘤藥物，但目前尚未見其用于抗小鼠黑色素瘤B16細(xì)胞株研究的相關(guān)報(bào)道。鑒于此，本研究以野生云芝子實(shí)體為研究對(duì)象，通過提取并純化制得CVP，考察其對(duì)小鼠黑色素瘤B16細(xì)胞株增殖和凋亡的影響，并初步探討其作用機(jī)制，以期為CVP抗腫瘤機(jī)制的進(jìn)一步研究和臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

0408-2型臺(tái)式低速離心機(jī)（上海醫(yī)療器械集團(tuán)有限公司手術(shù)器械廠）；ABI 7500 Fast型實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）儀（美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司）；FACS CaliburTM型流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD Biosciences公司）；MultiskanTM型全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo Scientific公司）。

1.2 藥材與試劑

野生云芝子實(shí)體購(gòu)自陜西省漢中市漢臺(tái)區(qū)藥材市場(chǎng)，由陜西省食藥用菌工程技術(shù)研究中心鄧百萬教授鑒定為多孔菌科真菌彩絨革蓋菌[Coriolus versicolor（L.ex Fr.）Quel]的干燥子實(shí)體。胎牛血清（FBS）、RPMI 1640培養(yǎng)基（美國(guó)Gibco公司）；二甲基亞砜（DMSO）、MTT（美國(guó)Sigma公司）；Ezup柱式動(dòng)物基因組DNA抽提試劑盒（上海生工生物工程股份有限公司，批號(hào)：BC28KA1892）；動(dòng)物組織/細(xì)胞RNA提取試劑盒（北京康為世紀(jì)生物科技有限公司，批號(hào)：40134）；寶生物染料法熒光定量試劑盒（上海皓嘉科技發(fā)展有限公司，批號(hào)：AK8006）；引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成；其余試劑均為分析純。

1.3 細(xì)胞株

小鼠黑色素瘤B16細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。

2 方法

2.1 CVP的提取與精制

準(zhǔn)確稱取野生云芝粉末50.0 g，用95%乙醇在80℃條件下水浴40 min脫脂，收集藥渣，風(fēng)干。脫脂后的云芝粉末加入適量蒸餾水，超聲30 min，抽濾，重復(fù)超聲提取1次，棄去藥渣，合并2次提取液。將提取液減壓濃縮至原體積的1/4后，用2倍體積95%乙醇邊攪動(dòng)邊沉淀，即得粗多糖，計(jì)算出多糖得率（多糖沉淀干質(zhì)量/云芝子實(shí)體干質(zhì)量×100%）為7.74%。將粗多糖經(jīng)過Sevage法去除蛋白及利用活性炭脫色后[8]得精制多糖，經(jīng)苯酚-硫酸法[9]測(cè)定其葡聚糖含量為54.69%。

2.2 細(xì)胞培養(yǎng)

將小鼠黑色素瘤B16細(xì)胞培養(yǎng)在含10%熱滅活FBS和100 mg/L鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基中。待細(xì)胞生長(zhǎng)至70%～80%融合時(shí)，吸棄細(xì)胞培養(yǎng)液，加入1～2 ml 0.25%胰酶溶液消化3～5 min，用新鮮培養(yǎng)液收集細(xì)胞懸液，然后轉(zhuǎn)移至離心管中，以1 000×g離心3 min，收集細(xì)胞沉淀，用新鮮RPMI 1640培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。將細(xì)胞懸液與培養(yǎng)液按1∶4的比例混合后轉(zhuǎn)接至3個(gè)100 mm培養(yǎng)皿中，每皿加10 ml培養(yǎng)液，振蕩均勻后，將培養(yǎng)皿放入37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)。

2.3 CVP對(duì)小鼠黑色素瘤B16細(xì)胞體外增殖的影響

采用MTT法測(cè)定細(xì)胞活性。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的小鼠黑色素瘤B16細(xì)胞以1×104個(gè)細(xì)胞/孔的密度種植于含100μl培養(yǎng)液的96孔板中，培養(yǎng)24 h。棄去50μl培養(yǎng)液后再分別加入0（空白對(duì)照）、0.156、0.312 5、0.625、1.25、2.5、5.0、10.0μg/ml CVP和等體積的DMSO溶液（陰性對(duì)照），然后用培養(yǎng)液調(diào)整體積至100μl，每個(gè)質(zhì)量濃度設(shè)置3個(gè)重復(fù)孔。培養(yǎng)48、72 h后于各孔細(xì)胞中分別加入30μl MTT溶液（5 mg/ml），繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸棄各組細(xì)胞的培養(yǎng)液并加入100μl DMSO進(jìn)行溶解，振蕩器上充分振勻后，在570 nm波長(zhǎng)下用全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀測(cè)定光密度（OD）值。細(xì)胞增殖抑制率（%）＝用藥組平均OD值/陰性對(duì)照組平均OD值×100%，細(xì)胞存活率（%）＝1－細(xì)胞增殖抑制率。以細(xì)胞存活率對(duì)CVP對(duì)數(shù)進(jìn)行直線回歸和統(tǒng)計(jì)處理，并采用加權(quán)直線回歸法計(jì)算半數(shù)抑制濃度（IC50）。

2.4 CVP對(duì)小鼠黑色素瘤B16細(xì)胞體外凋亡的影響

采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的小鼠黑色素瘤B16細(xì)胞按1×104個(gè)/孔的密度接種于含100μl培養(yǎng)液的96孔板中，分別加入0（空白對(duì)照）、0.5 μg/ml的CVP和等體積的DMSO溶液（陰性對(duì)照）培養(yǎng)細(xì)胞24、48、72 h后，70%乙醇4℃固定細(xì)胞24 h，然后加入0.1 mg/ml核糖核酸酶A（RNase A）37℃消化30 min，取出放入冰水中，用0.5 ml碘化丙啶（PI，50 μg/ml）4℃避光染色1 h，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析。PI標(biāo)記的流式細(xì)胞技術(shù)分析時(shí)，在G1峰左側(cè)出現(xiàn)亞G1期（Sub-G1）峰或A峰（或稱凋亡峰），其峰值高低反映了細(xì)胞發(fā)生凋亡的比例。

2.5 CVP對(duì)小鼠黑色素瘤B16細(xì)胞中凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響

采用RT-PCR法分析凋亡相關(guān)基因的表達(dá)。按“2.4”項(xiàng)下方法培養(yǎng)細(xì)胞，48 h后收集細(xì)胞，提取細(xì)胞總RNA，采用TIANGEN快速反轉(zhuǎn)錄預(yù)混試劑（KR108）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，RTPCR使用寶生物染料法熒光定量試劑盒進(jìn)行。以1 μg cDNA為模板擴(kuò)增細(xì)胞凋亡相關(guān)基因P53（GenBank登錄號(hào)：NM_ 000546）、Bcl-2（GenBank登錄號(hào)：NM_000633）和Fas（Gen-Bank登錄號(hào)：NM_152876），以β-actin基因（GenBank登錄號(hào)：NM_001101）為內(nèi)參。P53引物序列：上游為5′-GCGCACAGAGGAAGAGAATCTCCGC-3′，下游為5′-GGCCAACTTGTTCAGTGGAGCCCCGG-3′，產(chǎn)物大小為502 bp；Bcl-2引物序列：上游為5′-GCGTCAACCGGGAGATGTCGCCCCTG-3′，下游為5′-TTTCTTAAACAGCCTGCAGCTTTGTTT-3′，產(chǎn)物大小為349 bp；Fas引物序列：上游為5′-AGTACAGAAAACATGCAGAAAGCAC-3′，下游為5′-CTCTGCAAGAGTACAAAGATTGGCT-3′，產(chǎn)物大小為343 bp；β-actin上游為5′-GTGGGGCGCCCCAGGCACCAGGGC-3′，下游為5′-CTCCTTAATGTCACGCACGATTTCCC-3′，產(chǎn)物大小為540 bp。反應(yīng)體系：SYBR premix EX TaqⅡ10 μl，上、下游引物各0.4 μl，染料0.4 μl，cDNA模板2 μl，加水至20 μl。擴(kuò)增條件：95℃、90 s；94℃、10 s；60℃、30 s；40個(gè)循環(huán)?；虻南鄬?duì)表達(dá)量使用2－ΔΔct分析[10]，以DMSO對(duì)照樣品中P53、Bcl-2和Fas基因的表達(dá)量標(biāo)準(zhǔn)化為100%，CVP處理樣品的相對(duì)表達(dá)量即可通過公式計(jì)算。每組數(shù)據(jù)重復(fù)測(cè)定3次，求出標(biāo)準(zhǔn)差。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 CVP對(duì)小鼠黑色素瘤B16細(xì)胞增殖的抑制作用

CVP對(duì)小鼠黑色素瘤B16細(xì)胞的增殖具有較強(qiáng)的抑制作用，在0.156～0.625μg/ml范圍內(nèi)其抑制作用呈現(xiàn)明顯的濃度和時(shí)間依賴性。當(dāng)CVP質(zhì)量濃度大于0.625 μg/ml時(shí)，其對(duì)細(xì)胞的抑制作用進(jìn)入平臺(tái)期。作用48、72 h的IC50分別為（0.32± 0.01）、（0.18±0.04）μg/ml。CVP對(duì)小鼠黑色素瘤B16細(xì)胞增殖的影響結(jié)果見圖1。

圖1 CVP對(duì)小鼠黑色素瘤B16細(xì)胞增殖的影響結(jié)果Fig 1 Effects of CVP on the proliferation of murine melanoma B16 cell

3.2 CVP對(duì)小鼠黑色素瘤B16細(xì)胞凋亡的抑制作用

與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組比較，0.5μg/ml CVP組細(xì)胞的凋亡率隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而升高，作用48、72 h后細(xì)胞的凋亡率達(dá)到66.95%、75.40%，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。培養(yǎng)不同時(shí)間后各組細(xì)胞凋亡率測(cè)定結(jié)果見表1，流式細(xì)胞圖見圖2。

注：與空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組比較，＊P＜0.01Note：vs.blank control group and negative control group，＊P＜0.01

圖2 培養(yǎng)不同時(shí)間后各組細(xì)胞凋亡的流式細(xì)胞圖Fig 2 Flow cytometry of cell apoptosis after cultured for different time

3.3 CVP對(duì)凋亡相關(guān)基因表達(dá)量的影響

培養(yǎng)48 h后，與陰性對(duì)照組比較，CVP組小鼠細(xì)胞中P53、Bcl-2和Fas mRNA表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05或P＜0.01）；培養(yǎng)72 h后，CVP組小鼠黑色素瘤B16細(xì)胞中P53、Fas mRNA表達(dá)水平較培養(yǎng)48 h后繼續(xù)降低，F(xiàn)as mRNA水平略有升高，但均顯著低于陰性對(duì)照組（P＜0.01）。細(xì)胞中凋亡相關(guān)基因P53、Bcl-2和Fas mRNA表達(dá)水平測(cè)定結(jié)果見圖3。

4 討論

惡性黑色素瘤（Malignant melanoma）是一類起源于神經(jīng)嵴的黑色素細(xì)胞、極易發(fā)生轉(zhuǎn)移的惡性腫瘤，由于其惡性程度高、預(yù)后差，近年來已成為發(fā)病率增長(zhǎng)最快的惡性腫瘤之一[11-12]。因此尋找敏感性強(qiáng)、作用靶點(diǎn)多的有效藥物一直是腫瘤研究學(xué)者關(guān)注的熱點(diǎn)。有研究顯示，云芝菌絲體多糖具有較強(qiáng)的抑制小鼠黑色素瘤細(xì)胞B16的作用，且其對(duì)該細(xì)胞的抑制作用明顯高于其他腫瘤細(xì)胞[12]。因此，從云芝子實(shí)體中提取多糖用于臨床治療黑色素瘤B16的候選藥物具有重要的意義。本研究結(jié)果顯示，CVP作用于B16細(xì)胞48、72 h后的IC50分別為（0.32±0.01）、（0.18±0.04）μg/ml，該結(jié)果說明CVP對(duì)小鼠黑色素瘤B16細(xì)胞具有較強(qiáng)抑制活性。筆者據(jù)CVP的IC50值以及前人的研究結(jié)果[12-13]，選取0.5 μg/ml CVP進(jìn)行細(xì)胞凋亡的檢測(cè)。結(jié)果顯示，在這一質(zhì)量濃度下，作用48 h后凋亡細(xì)胞的比例為66.95%，72 h后為75.4%，與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組比較凋亡率顯著升高。

圖3 各組細(xì)胞中凋亡相關(guān)基因P53、Bcl-2和Fas mRNA表達(dá)測(cè)定結(jié)果注：＊P＜0.05；＊＊P＜0.01Fig 3 The mRNA expression of P53，Bcl-2 and Fas of cells in each group（±s，n＝3）Note：＊P＜0.05；＊＊P＜0.01

細(xì)胞凋亡的發(fā)生主要有2條信號(hào)通路介導(dǎo)，一條是通過線粒體的信號(hào)通路，另一條是通過Fas/FasL及TNF/TNFR死亡受體通路。目前研究認(rèn)為腫瘤的發(fā)生、發(fā)展均與細(xì)胞凋亡相關(guān)[14]。在線粒體通路中，Bcl-2家族成員發(fā)揮著重要作用，是目前研究最多的一類細(xì)胞凋亡調(diào)控蛋白因子，屬于一種抗凋亡蛋白；P53是定位于線粒體上的轉(zhuǎn)錄因子，能與促凋亡蛋白Bak等直接作用，解除促凋亡蛋白Bak與抗凋亡蛋白Bcl-2的相互作用，進(jìn)而改變線粒體的通透性，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；Fas基因是凋亡信號(hào)基因，其基因產(chǎn)物Fas蛋白是一種細(xì)胞凋亡信號(hào)受體，屬于死亡受體通路。本實(shí)驗(yàn)通過表達(dá)譜分析發(fā)現(xiàn)，CVP可以下調(diào)小鼠黑色素瘤B16細(xì)胞中Bcl-2和P53基因的表達(dá)，且隨著CVP作用時(shí)間的延長(zhǎng)，其對(duì)P53基因的下調(diào)作用越明顯，而對(duì)Bcl-2基因的下調(diào)則達(dá)到了平衡，這說明CVP可通過調(diào)節(jié)Bcl-2和P53基因的表達(dá)來誘導(dǎo)小鼠黑色素瘤B16細(xì)胞株的凋亡。同時(shí)發(fā)現(xiàn)死亡受體中的Fas基因表達(dá)也被CVP下調(diào)，說明著2條通路都參與CVP所致的小鼠黑色素瘤B16細(xì)胞株的凋亡。

綜上所述，CVP能通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的方式抑制小鼠黑色素瘤B16細(xì)胞的生長(zhǎng)，其作用機(jī)制可能與下調(diào)細(xì)胞中P53、Bcl-2和Fas基因的表達(dá)相關(guān)。

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Effects of Coriolus versicolor Polysaccharides on Proliferation and Apoptosis of Murine Melanoma B16 Cell in vitro and Its Mechanism of Action

WEI Shijie1，CHEN Wenqiang2（1.Center Hospital Affiliated to Shaanxi Sci-Tech University，Shaanxi Hanzhong 723000，China；2.School of Biological Science and Engineering，Shaanxi Sci-Tech University，Shaanxi Hanzhong 723000，China）

OBJECTIVE：To study the effects of Coriolus versicolor polysaccharides（CVP）on in vitro proliferation and apoptosis of murine melanoma B16 cell and its mechanism.METHODS：MTT assay was used to determine the survival rate of murine melanoma B16 cell after cultured with DMSO（negative control），0（blank control），0.156，0.312 5，0.625，1.25，2.5，5.0 and 10.0 μg/ml CVP for 48，72 h，and the IC50was calculated.Flow cytometry was used to determine the apoptotic rate of murine melanoma B16 cell after cultured with DMSO（negative control），0（blank control），0.5 μg/ml CVP for 24，48，72 h.Quantitation Real-time PCR（qRT-PCR）was used to determine the mRNA expression of cell apoptosis-related gene P53，Bcl-2 and Fas in murine melanoma B16 cell after cultured with DMSO（negative control），0.5 μg/ml CVP for 48，72 h.RESULTS：0.156-10.0 μg/ml CVP could inhibit the growth of B16 cells，in concentration and time-dependent manner within 0.156-0.625 μg/ml；IC50of B16 cells after cultured for 48 and 72 h were（0.32±0.01），（0.18±0.04）μg/ml.After cultured with 0.5 μg/ml CVP for 24，48，72 h，apoptotic rates of B16 cells were increased significantly，compared to negative control and blank control（P＜0.01）.After cultured with 0.5 μg/ml CVP for 48，72 h，mRNA expression of P53，Bcl-2 and Fas were decreased significantly，compared to negative control（P＜0.01）.CONCLUSIONS：CVP can inhibit the proliferation and induce the apoptosis of B16 cells，the mechanism of which may be associated with the expression down-regulation of P53，Bcl-2 and Fas gene.

Coriolus versicolor polysaccharides；Murine melanoma B16 cell；Proliferation；Apoptosis；in vitro

R95

A

1001-0408（2016）31-4363-04

2016-01-04

2016-07-22）
（編輯：林 靜）

陜西省“13115”科技創(chuàng)新工程計(jì)劃項(xiàng)目（No.2008 ZDGC-04）

＊主治醫(yī)師。研究方向：藥用真菌對(duì)腫瘤細(xì)胞的影響。E-mail：448347936@qq.com

#通信作者：教授。研究方向：藥用真菌資源的開發(fā)和利用。電話：0916-2642832。E-mail：wenqiangc@126.com

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2016.31.13