董永喜，劉星星，董 莉，王 霞，黃 勇，王永林（1.貴州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，貴陽 55005；.貴州醫(yī)科大學(xué)貴州省藥物制劑重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴陽 550004；.貴陽市婦幼保健院，貴陽 55000）

·實(shí)驗(yàn)研究·

白及多糖對(duì)血熱出血模型大鼠的止血作用及機(jī)制研究Δ

董永喜1，2＊，劉星星3，董 莉1，2#，王 霞1，2，黃 勇2，王永林2（1.貴州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，貴陽 550025；2.貴州醫(yī)科大學(xué)貴州省藥物制劑重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴陽 550004；3.貴陽市婦幼保健院，貴陽 550003）

目的：研究白及多糖（BSP）對(duì)血熱出血模型大鼠的止血作用及機(jī)制。方法：將大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型組、云南白藥組（0.50 g/kg）和BSP低、中、高劑量組（0.34、0.68、1.35 g/kg），每組10只。除正常對(duì)照組外，其余各組大鼠均采用干姜水煎液結(jié)合5%乙醇給藥復(fù)制血熱出血模型。造模成功后，除正常對(duì)照組和模型組大鼠ig生理鹽水外，其余各組大鼠ig相應(yīng)藥物，每天1次，連續(xù)14 d。末次給藥1 h后檢測各組大鼠體質(zhì)量、攝食量、飲水量、血小板聚集率、組織型纖溶酶原激活劑（t-PA）和纖溶酶原激活物抑制劑（PAI-1）的含量；檢查肺、胃組織病理學(xué)變化。結(jié)果：與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠體質(zhì)量、攝食量、血小板最大聚集率、PAI-1含量均減少，飲水量、t-PA含量及t-PA/PAI-1比值均增加（P＜0.05或P＜0.01），肺、胃組織均表現(xiàn)出出血和炎癥等病理變化。與模型組比較，云南白藥組和BSP低、中、高劑量組大鼠體質(zhì)量、攝食量均增加，飲水量減少（P＜0.05或P＜0.01）；云南白藥組和BSP中、高劑量組大鼠血小板最大聚集率、PAI-1含量均增加，t-PA/PAI-1比值減少（P＜0.05或P＜0.01），肺、胃組織的病理變化均不同程度減輕。結(jié)論：BSP可能通過升高血小板聚集率、調(diào)節(jié)纖溶系統(tǒng)、改善肺和胃組織的病變，綜合發(fā)揮止血作用。

白及多糖；血熱出血；大鼠；血小板聚集；纖溶系統(tǒng)；組織病理學(xué)檢查

白及是蘭科植物白及[Bletilla striata（Thunb.）Reichb.F.]的干燥塊莖，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，其味苦、甘、澀，性涼，歸肺、胃經(jīng)，具有收斂止血、清熱利濕、涼血解毒、消腫生肌之功效，主治肺胃出血、外傷出血、肺癆吐血、消化道出血等[1-3]。白及主產(chǎn)于貴州、四川、云南、湖南等地，以貴州產(chǎn)量最大、質(zhì)量較好，貴州省正安縣已建有白及種植基地。目前以白及為主藥上市的產(chǎn)品有白百抗癆顆粒、傷痛跌打丸、胃得康片、延胡胃安膠囊等20多個(gè)中藥品種。白及多糖（BSP）是白及的主要活性成分[4]。

干姜溫?zé)嶂匀胙?、傷陰?dòng)血、迫血妄行，從而增加機(jī)體出血傾向，其水煎劑可引起大鼠血液中紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、纖維蛋白原等含量增加，可能與熱入血分、灼傷津液，使得血液濃縮、流動(dòng)性降低，進(jìn)而導(dǎo)致全血高、中、低切黏度及血漿黏度增加有關(guān)。干姜誘導(dǎo)并結(jié)合5%乙醇給藥復(fù)制的大鼠血熱出血模型病理學(xué)研究顯示，其出血面積小且主要為間質(zhì)出血，肺泡結(jié)構(gòu)完整且腔內(nèi)干凈，更符合中醫(yī)內(nèi)傷雜病、灼燒血絡(luò)、血熱妄行之出血證的特點(diǎn)[5]。

本課題組前期對(duì)白及的化學(xué)成分[6]、含量測定[7-8]及止血生物效價(jià)[9]等進(jìn)行了研究。鑒于對(duì)該藥止血作用的機(jī)制研究較少，本研究采用干姜水煎液誘導(dǎo)并結(jié)合5%乙醇給藥復(fù)制大鼠血熱出血模型，進(jìn)一步研究BSP止血作用及機(jī)制，為白及和相關(guān)產(chǎn)品的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

LG-PABER-Ⅰ型血小板聚集凝血因子分析儀（北京世帝科學(xué)儀器公司）；680型酶標(biāo)儀（美國Bio-Rad公司）；TDL80-2B型低速臺(tái)式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；BI-2000型醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)（成都泰盟軟件有限公司）。

1.2 藥材、藥品與試劑

白及藥材產(chǎn)于貴州正安，經(jīng)貴州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院生藥學(xué)教研室龍慶德教授鑒定為蘭科植物白及Bletilla striata（Thunb.）Reichb.F.的干燥塊莖；云南白藥片（云南白藥股份有限公司，批號(hào)：Z53020798，規(guī)格：0.35 g/片）；干姜飲片（亳州市京皖中藥飲片廠，批號(hào)：140801）；二磷酸腺苷（ADP，北京世帝科學(xué)儀器公司，批號(hào)：STY50202-23）；大鼠組織型纖溶酶原激活劑（t-PA）試劑盒（批號(hào)：20141208）、大鼠纖溶酶原激活物抑制劑（PAI-1）試劑盒（批號(hào)：20141208）均購自上海藍(lán)基生物科技有限公司；其余試劑均為分析純。

1.3 動(dòng)物

清潔級(jí)健康SD大鼠，♂，體質(zhì)量180～200 g，由貴州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)為SCXK（黔）2012-0001。

2 方法

2.1 BSP的制備[9-10]

白及藥材經(jīng)水提取3次，合并濾液后濃縮，通過Savege法除蛋白，加95%乙醇析出沉淀，干燥即得BSP粗提物。采用苯酚-硫酸法[10]測定其多糖含量為93.6%。

2.2 分組、造模與給藥[9，11-13]

取大鼠60只，隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型組、云南白藥組（0.50 g/kg）[13]和BSP低、中、高劑量組（0.34、0.68、1.35 g/kg，給藥劑量根據(jù)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)而定）[9]，每組10只。除正常對(duì)照組大鼠ig生理鹽水并始終給予自由飲水外，其余各組大鼠ig干姜水煎液15 g/kg，并用5%乙醇代替自由飲水，連續(xù)ig 14 d，每天1次，復(fù)制熱血出血模型。造模后，各給藥組大鼠ig相應(yīng)藥物，正常對(duì)照組和模型組大鼠ig生理鹽水，每天1次，連續(xù)14 d。末次給藥1 h后，水合氯醛麻醉各組大鼠，股動(dòng)脈采血，置塑料離心管中，以3.8%枸櫞酸鈉溶液抗凝得血漿備用。

2.3 一般體征考察

分別于給藥第0、7、14天時(shí)測定各組大鼠的體質(zhì)量、攝食量、飲水量。

2.4 血小板聚集率測定

將血漿以600 r/min（離心半徑為10 cm，下同）離心10 min，取上層液，即富血小板血漿（PRP）。將剩余血漿以3 000 r/min離心10 min，取上層液，即乏血小板血漿（PPP）。分別吸取PPP和PRP各300 μl，PPP調(diào)透光率到100%，PRP中加入濃度為0.155 μmol/L的誘導(dǎo)劑ADP溶液10 μl，采用血小板聚集凝血因子分析儀測定5 min內(nèi)的血小板最大聚集率。

2.5 纖溶系統(tǒng)指標(biāo)t-PA和PAI-1測定

采用酶標(biāo)儀按試劑盒說明書操作，以酶聯(lián)免疫吸附法測定各組大鼠血漿中t-PA和PAI-1的含量。

2.6 肺組織和胃組織病理學(xué)檢查

各組大鼠取血后處死，取肺、胃組織，用10%甲醛溶液固定48 h，石蠟包埋、切片，蘇木精-伊紅（HE）染色，光學(xué)顯微鏡下觀察各組大鼠肺、胃組織的病理學(xué)變化。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 大鼠一般體征

與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠體質(zhì)量和攝食量均減少，飲水量增加（P＜0.01）。與模型組比較，云南白藥組和BSP各劑量組大鼠體質(zhì)量和攝食量均增加，飲水量減少（P＜0.05或P＜0.01），其中云南白藥組與BSP高劑量組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。各組大鼠給藥第14天的體質(zhì)量、攝食量、飲水量的測定結(jié)果見表1。

表1 各組大鼠給藥第14天的體質(zhì)量、攝食量、飲水量的測定結(jié)果（±s，n＝10）Tab 1 Body weight，food intake and water intake of rats in each group on the 14th day administration（±s，n＝10）

表1 各組大鼠給藥第14天的體質(zhì)量、攝食量、飲水量的測定結(jié)果（±s，n＝10）Tab 1 Body weight，food intake and water intake of rats in each group on the 14th day administration（±s，n＝10）

注：與正常對(duì)照組比較，＊P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與云南白藥組比較，ΔP＜0.05Note：vs.normal control group，＊P＜0.01；vs.model group，#P＜0.05，##P＜0.01；vs.Yunnan baiyao group，ΔP＜0.05

飲水量，ml/kg 22.05±2.31 25.28±1.14＊23.64±2.45#24.07±1.32#Δ23.81±1.46#22.65±1.19##正常對(duì)照組模型組云南白藥組BSP低劑量組BSP中劑量組BSP高劑量組280.50±4.23 254.37±6.48＊278.62±2.59##267.67±6.60#Δ271.91±2.06#Δ276.15±3.38##107.62±3.16 83.13±5.64＊102.60±1.87##91.41±5.37#Δ95.74±3.87#Δ100.80±6.61##組別 體質(zhì)量，g 攝食量，g/kg

3.2 大鼠血小板最大聚集率

與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠血小板最大聚集率減少（P＜0.01）。與模型組比較，云南白藥組和BSP中、高劑量組大鼠血小板最大聚集率均增加（P＜0.01），增加率分別為42.86%、24.19%和35.62%。與云南白藥組比較，BSP中、高劑量組大鼠的血小板最大聚集率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。各組大鼠血小板最大聚集率的檢測結(jié)果見表2。

表2 各組大鼠血小板最大聚集率的檢測結(jié)果（±s，n＝10）Tab 2 Maximal rate of platelet aggregation in rats of each group（±s，n＝10）

表2 各組大鼠血小板最大聚集率的檢測結(jié)果（±s，n＝10）Tab 2 Maximal rate of platelet aggregation in rats of each group（±s，n＝10）

注：與正常對(duì)照組比較，＊P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.01；與云南白藥組比較，ΔP＜0.05Note：vs.normal control group，＊P＜0.01；vs.model group，#P＜0.01；vs.Yunnan baiyao group，ΔP＜0.05

組別 血小板最大聚集率，%增加率，%正常對(duì)照組40.94±3.02模型組26.25±3.32＊云南白藥組37.50±2.80#42.86 BSP低劑量組29.80±3.00Δ13.52 BSP中劑量組32.60±3.36#24.19 BSP高劑量組35.60±3.93#35.62

3.3 大鼠纖溶系統(tǒng)t-PA和PAI-1含量

與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠血漿中t-PA含量增加、PAI-1含量減小、t-PA/PAI-1比值增加（P＜0.05或P＜0.01）。與模型組比較，云南白藥組和BSP中、高劑量組大鼠血漿中PAI-1含量增加、t-PA/PAI-1比值減少（P＜0.05或P＜0.01），僅云南白藥組大鼠血漿中t-PA含量減少（P＜0.05）。各組大鼠血漿中t-PA、PAI-1含量的測定結(jié)果見表3。

表3 各組大鼠血漿中t-PA、PAI-1含量的測定結(jié)果（±s，n＝10）Tab 3 Contents of t-PA and PAI-1 in plasma of rats in each group（±s，n＝10）

表3 各組大鼠血漿中t-PA、PAI-1含量的測定結(jié)果（±s，n＝10）Tab 3 Contents of t-PA and PAI-1 in plasma of rats in each group（±s，n＝10）

注：與正常對(duì)照組比較，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01Note：vs.normal control group，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；vs.model group，#P＜0.05，##P＜0.01

t -P A / P A I -1 0 . 9 2 ± 0 . 3 9 1 . 6 4 ± 0 . 3 8＊＊1 . 0 3 ± 0 . 4 1##1 . 4 7 ± 0 . 6 9 1 . 2 8 ± 0 . 3 1#1 . 1 0 ± 0 . 4 0##組別正常對(duì)照組模型組云南白藥組B S P低劑量組B S P中劑量組B S P高劑量組t -P A，n g / m l 0 . 6 5 ± 0 . 2 3 0 . 8 8 ± 0 . 2 1＊0 . 6 9 ± 0 . 2 7#0 . 8 2 ± 0 . 3 2 0 . 7 7 ± 0 . 2 7 0 . 7 4 ± 0 . 2 0 P A I -1，n g / m l 0 . 7 2 ± 0 . 0 6 0 . 5 4 ± 0 . 0 7＊＊0 . 6 9 ± 0 . 1 3##0 . 5 8 ± 0 . 0 8 0 . 6 5 ± 0 . 1 6#0 . 7 0 ± 0 . 1 2#

3.4 大鼠肺組織和胃組織病理學(xué)變化

與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠表現(xiàn)出部分肺泡結(jié)構(gòu)被破壞、肺纖維組織增生、肺間質(zhì)出血、肺泡壁毛細(xì)血管擴(kuò)張出血、肺泡腔內(nèi)有紅細(xì)胞浸潤及局部炎細(xì)胞浸潤現(xiàn)象；胃黏膜水腫、充血、炎細(xì)胞浸潤現(xiàn)象嚴(yán)重，固有層出現(xiàn)中性粒細(xì)胞和大單核細(xì)胞浸潤，胃底腺有少量不規(guī)則現(xiàn)象，主細(xì)胞和壁細(xì)胞數(shù)明顯減少。與模型組比較，各給藥組大鼠的肺損傷和胃損傷都有不同程度的減輕，肺間隔、肺間質(zhì)出血、肺泡壁增厚和胃黏膜水腫、充血、炎細(xì)胞浸潤等病理變化顯著改善。各組大鼠肺組織和胃組織的病理形態(tài)圖見圖1。

4 討論

采用干姜誘導(dǎo)并結(jié)合5%乙醇給藥建立的大鼠血熱出血模型，具有出血癥狀明顯、重復(fù)性高、穩(wěn)定性強(qiáng)的特點(diǎn)[5]，近年來常被用于止血中藥的研究。本研究中，首先采用1.5 kg/L干姜水煎液對(duì)血熱出血模型進(jìn)行復(fù)制，并用5%乙醇代替自由飲水使胃黏膜受到乙醇刺激，以增加胃出血的幾率。成模后，模型組大鼠出現(xiàn)體質(zhì)量減輕、攝食量減少、飲水量增加的癥狀，肉眼觀察肺、胃組織均有不同程度的血絲、血點(diǎn)以及暗紅色瘀斑，病理組織學(xué)檢查顯示肺纖維組織增生嚴(yán)重，肺間質(zhì)明顯充血并伴有多處炎細(xì)胞浸潤，胃黏膜出現(xiàn)水腫、充血、炎細(xì)胞浸潤和胃底腺變形等現(xiàn)象，表明肺組織和胃組織均有出血的病理變化；而且大鼠血小板最大聚集率降低、t-PA/PAI-1的比值升高也表明，采用干姜誘導(dǎo)并結(jié)合5%乙醇建模后引起大鼠血小板系統(tǒng)、纖溶系統(tǒng)異常，從而使止血功能發(fā)生障礙，血熱出血模型復(fù)制成功。

血小板激活是一期止血的基礎(chǔ)，并為凝血系統(tǒng)活化及凝血酶的最終形成提供磷脂表面，當(dāng)血管受到損傷而出血時(shí)，血小板被迅速激活，發(fā)生血小板與血小板之間的相互黏附和聚集并且釋放出多種促凝物質(zhì)，從而達(dá)到止血的目的。因此，血小板聚集率是檢測止血最常用的指標(biāo)[14]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與模型組比較，BSP中、高劑量組大鼠的血小板最大聚集率顯著增加，表明BSP能通過促進(jìn)血小板聚集率，調(diào)整血小板系統(tǒng)，發(fā)揮止血作用。

纖溶是指血液凝固過程中形成的纖維蛋白，被分解液化的過程。參與纖溶過程的一系列化學(xué)物質(zhì)組成的系統(tǒng)稱為纖溶系統(tǒng)。纖溶是體內(nèi)重要的抗凝血過程。血液中凝血系統(tǒng)與纖溶系統(tǒng)之間既相互矛盾又相互動(dòng)態(tài)平衡的過程，是正常機(jī)體維持體內(nèi)血液流動(dòng)和防止血液丟失的關(guān)鍵[15]。t-PA與PAI-1是纖溶系統(tǒng)中最常見的指標(biāo)，在纖溶系統(tǒng)的活化過程中起著重要的作用。t-PA是組織型纖溶酶原激活物，主要由內(nèi)皮細(xì)胞分泌、合成，可通過激活纖溶蛋白溶解酶使纖維蛋白溶解；PAI-1是纖溶酶原激活物抑制物，是t-PA的主要抑制劑。正常情況下，兩者處于動(dòng)態(tài)平衡，共同調(diào)節(jié)纖溶系統(tǒng)以維持正常的血液流動(dòng)，但兩者失衡將導(dǎo)致出血或血栓形成。所以也常通過對(duì)t-PA/PAI-1比值的檢測，反映纖溶系統(tǒng)是否處于平衡狀態(tài)[13，16]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與模型組比較，BSP中、高劑量組大鼠血漿中PAI-1含量升高、t-PA/PAI-1比值降低，表明BSP能通過改善t-PA/PAI-1的比值，使兩者恢復(fù)動(dòng)態(tài)平衡而調(diào)節(jié)纖溶系統(tǒng)，起到止血作用。

圖1 各組大鼠肺組織和胃組織的病理形態(tài)圖（HE，×100）

Fig 1 The pathological sections of lung and stomach of rats in each group（HE，×100）

綜上所述，BSP可能通過升高血小板聚集率、調(diào)節(jié)纖溶系統(tǒng)的t-PA和PAI-1動(dòng)態(tài)平衡、改善肺組織和胃組織出血等病理損傷，從而綜合發(fā)揮止血作用。

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Study on Hemostatic Effect and Mechanism of Polysaccharides from Bletilla striata in Blood Heat and Hemorrhage Model Rats

DONG Yongxi1，2，LIU Xingxing3，DONG Li1，2，WANG Xia1，2，HUANG Yong2，WANG Yonglin2（1.School of Pharmacy，Guizhou Medical University，Guiyang 550025，China；2.Guizhou Provincial Key Lab of Pharmaceutics，Guizhou Medical University，Guiyang 550004，China；3.Guiyang Health Center for Women and Children，Guiyang 550003，China）

OBJECTIVE：To study the hemostatic effect and mechanism of the polysaccharides from Bletilla striata in blood heat and hemorrhage（BBH）model rats.METHODS：Rats were randomly divided into normal control group，model group，Yunnan baiyao group（0.50 g/kg），and BSP low-dose，medium-dose and high-dose groups（0.34，0.68，1.35 g/kg），with 10 rats in each group.Except for normal control group，those groups were given water decoction of Rhizoma Zingiberis and 5%ethanol to induce BBH model.After modeling，those groups were given relevant medicine intragastrically，once a day，for 14 days，except normal control group and model group were given normal saline intragastrically.1 h after last administration，body weight，food intake，water intake，the rate of platelet aggregation，the contents of t-PA and PAI-1，pathological change of lung and stomach were all detected in each group.RESULTS：Compared with normal control group，body weight，food intake，maximal rate of platelet aggregation and the content of PAI-1 were decreased in model group；while water intake，the content of t-PA and ratio of t-PA/PAI-1 were increased（P＜0.05 or P＜0.01）.Moreover，hemorrhage and inflammation of lung and stomach were found.Compared with model group，the body weight and food intake of Yunnan baiyao group，BSP low-dose，medium-dose and high-dose groups were increased，while water intake were decreased（P＜0.05 or P＜0.01）；the maximal rate of platelet aggregation and the content of PAI-1 were increased in Yunnan baiyao group，BSP medium-dose and high-dose groups，while ratio of t-PA/PAI-1 were decreased（P＜0.05 or P＜0.01），the pathological changes of lung and stomach relieved to varying degrees.CONCLUSIONS：BSP exerts hemostatic effect by up-regulating the rate of platelet aggregation，rising fibrinolysis systems，improving the lesion of lung and stomach.

Polysaccharides from Bletilla striata；Blood heat and hemorrhage；Rats；Platelet aggregation；Fibrinolytic system；Histopathological examination

R985

A

1001-0408（2016）31-4347-04

2016-05-02

2016-06-20）

（編輯：鄒麗娟）

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（No.81360636，81460630）；貴州省優(yōu)秀青年科技人才專項(xiàng)（No.黔科合人字〔2015〕11號(hào)）；貴州省高等學(xué)校創(chuàng)新能力提升計(jì)劃（No.黔教合協(xié)同創(chuàng)新字〔2013〕04）

＊講師，碩士。研究方向：心血管藥物設(shè)計(jì)與合成。電話：0851-88416153。E-mail：dongyx01@163.com

#通信作者：副教授，碩士。研究方向：中藥藥效學(xué)、藥理學(xué)研究和安全性評(píng)價(jià)。電話：0851-88416153。E-mail：108405755@qq.com

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2016.31.08