王建山, 夏紅軍, 萬廣平, 劉家瑋, 白 泉

(西北大學(xué)合成與天然功能分子化學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 西北大學(xué)現(xiàn)代分離科學(xué)研究所,現(xiàn)代分離科學(xué)陜西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 陜西 西安 710069)

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氨基己酸為配基的新型弱陽離子交換/疏水雙功能色譜固定相對(duì)蛋白質(zhì)的分離純化

王建山, 夏紅軍, 萬廣平, 劉家瑋, 白 泉*

(西北大學(xué)合成與天然功能分子化學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 西北大學(xué)現(xiàn)代分離科學(xué)研究所,現(xiàn)代分離科學(xué)陜西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 陜西 西安 710069)

以硅膠為基質(zhì)、氨基己酸為配基制備了一種新型弱陽離子交換/疏水(WCX/HIC)雙功能混合模式色譜固定相。該固定相配基具有一定的疏水性且含有羧基,在高鹽濃度下表現(xiàn)為HIC的性質(zhì),可作為HIC固定相使用;在低鹽濃度條件下表現(xiàn)為離子交換的性質(zhì),可作為WCX固定相使用。分別考察了該介質(zhì)在WCX和HIC兩種模式下對(duì)標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的分離性能,并與商品柱進(jìn)行比較。結(jié)果表明,所合成的WCX/HIC雙功能固定相在WCX和HIC兩種模式下對(duì)蛋白質(zhì)均有較高的分離度和選擇性,且分離能力與商品柱相當(dāng),兩種模式下標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的質(zhì)量和活性回收率均大于93%,表明該柱具有“一柱二用”的功能,適于生物大分子的分離純化?；诖穗p功能色譜柱構(gòu)建的在線單柱二維液相色譜(2DLC-1C)可在60 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)8種蛋白質(zhì)的快速分離。在70 min內(nèi)完成了對(duì)蛋清中溶菌酶的二維純化,純度可達(dá)到98.3%。該技術(shù)中一根色譜柱可當(dāng)作兩根色譜柱使用,對(duì)蛋白質(zhì)組學(xué)研究和重組蛋白藥物的生產(chǎn)具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

固定相;混合模式色譜;離子交換色譜;疏水色譜;二維液相色譜

液相色譜是蛋白質(zhì)分離純化的有效工具[1-3],二維液相色譜(2DLC)已成為蛋白質(zhì)組學(xué)等復(fù)雜樣品分離分析的關(guān)鍵技術(shù)[4,5]。一根色譜柱通常只能利用一種分離模式對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行分離純化,其特征是“一柱一用”,所以目前2DLC的構(gòu)建就需要兩根分離模式正交的色譜柱。同時(shí),樣品如何在兩根色譜柱之間進(jìn)行切換以及兩種模式流動(dòng)相之間的兼容性問題一直是限制2DLC發(fā)展的瓶頸[6]?；旌夏Ｊ缴V(mixed mode chromatography,MMC)[7]是利用蛋白質(zhì)與固定相配基之間多種相互作用進(jìn)行分離的色譜模式。在合成MMC填料時(shí),在配基中合理地引入多個(gè)作用位點(diǎn),使固定相和蛋白質(zhì)之間存在多種相互作用,以提高固定相的選擇性和柱效。與傳統(tǒng)的單一模式色譜相比,MMC具有高選擇性、高負(fù)載量等優(yōu)點(diǎn)。雖然MMC已有反相/離子交換色譜(RPLC/IEC)、反相/親水色譜(RPLC/HILIC)、親水/離子交換色譜(HILIC/IEC)和離子交換/疏水色譜(IEC/HIC)等類型,而且IEC/HIC MMC色譜柱已商品化,如美國(guó)GE Healthcare公司的Capto MMC和Capto adhere, Pall Life Sciences公司的HEA、PPA和MEP HyperCel耐鹽層析介質(zhì)。然而這些MMC柱仍是以一種色譜分離模式為主,而伴隨的其他模式只起著強(qiáng)化主分離模式的輔助作用。

IEC和HIC所用的流動(dòng)相都是鹽水體系,接近生理?xiàng)l件,能很好地保持蛋白質(zhì)的生物活性,是最適合分離活性蛋白質(zhì)的色譜模式。Asenjo等[8]曾經(jīng)指出,純化活性蛋白質(zhì)的最佳色譜模式是先經(jīng)過IEC分離,再用HIC純化。因此很多研究者圍繞著這兩種模式展開研究,專門設(shè)計(jì)用于HIC/IEC混合模式下分離生物活性樣品的配基。Liu等[9]和Sun等[10]分別報(bào)道了IEC固定相普遍存在疏水作用。最近本課題組設(shè)計(jì)合成出了一類同時(shí)具有IEC和HIC性能的新型雙功能高效色譜分離介質(zhì)[11-13]。該介質(zhì)在高鹽濃度下表現(xiàn)為HIC的性質(zhì),可作為HIC固定相使用;而在低鹽濃度條件下表現(xiàn)為IEC的性質(zhì),可作為IEC固定相使用,用一根色譜柱就可實(shí)現(xiàn)在IEC和HIC兩種模式下對(duì)蛋白質(zhì)的高效分離,具有“一柱二用”的功能,稱之為“2D色譜柱”。以此為基礎(chǔ),利用閥切換技術(shù),采用一根雙功能色譜柱構(gòu)建了在線二維液相色譜分離系統(tǒng),稱之為單柱二維液相色譜(2DLC-1C)[14]。與常規(guī)的2DLC不同的是,可在一根色譜柱上完成HIC/IEC或IEC/HIC二維色譜分離,建立了用一根該色譜柱代替兩根常用的IEC和HIC色譜柱快速分離蛋白質(zhì)的新方法,并成功地應(yīng)用于牛胰腺中細(xì)胞色素C[15]、包涵體中γ-干擾素[16]及蛋清中3種活性蛋白質(zhì)[17]的快速分離純化。2DLC-1C技術(shù)的發(fā)展無疑給傳統(tǒng)的2DLC技術(shù)帶來了一場(chǎng)技術(shù)革新。但是該技術(shù)還剛剛起步,其發(fā)展主要依賴雙功能色譜填料的開發(fā)與制備。因此,本文以氨基己酸為配基制備了一種同時(shí)具有弱陽離子交換(WCX)和HIC雙功能的新型MMC固定相,其配基既含有羧基又有一定的疏水性,可分別在WCX和HIC兩種模式下對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行高效分離,實(shí)現(xiàn)“一柱二用”的功能。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

LC-20AVP高效液相色譜系統(tǒng)包括2臺(tái)LC-20AVP高壓泵、1臺(tái)SCL-20AVP系統(tǒng)控制器、1個(gè)7725i進(jìn)樣閥、1臺(tái)SPD-10AVP紫外可見檢測(cè)器、1臺(tái)CLASS-VP色譜工作站,UV-1601PC紫外可見分光光度計(jì)(日本Shimadzu公司); Cascada LS超純水系統(tǒng)(美國(guó)Pall公司)。TSKgel Ether-5PW色譜柱(75 mm×7.5 mm)、TSKgel CM-5PW色譜柱(75 mm×7.5 mm)(日本Tosoh公司)。

色譜專家(ChromatoExpert)儀器包括:LC-10AVP高壓泵(日本Shimadzu公司)、7725i二位六通進(jìn)樣閥(美國(guó)Rheodyne公司)、C5-2004四通切換閥、C5-2006六通切換閥、C5H-2008八通切換閥、C5H-2000十通切換閥、Z10M1十通、Z8M1八通(均購(gòu)自瑞士VICI公司)[14]。

γ-縮水甘油醚氧基丙基三甲氧基硅烷購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司;碳酸鈉、氯化鈉、磷酸二氫鉀均購(gòu)自天津科密歐化學(xué)試劑公司;硫酸銨購(gòu)自成都市科龍化工試劑廠;氨基己酸購(gòu)自中國(guó)預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院勞衛(wèi)所,以上試劑均為分析純。全多孔硅膠(粒徑5 μm,比表面積180 m2/g,孔徑22 nm)購(gòu)自中科院蘭州化學(xué)物理研究所。溶菌酶(lysozyme,純度≥96%,蛋清)、核糖核酸酶A(RNase A,純度≥98%,牛胰臟)、細(xì)胞色素C(cytochrome C,純度≥97%,馬心)、核糖核酸酶B(RNase B,純度≥98%,牛胰臟)、α-糜蛋白酶原A(α-chymotrypsingen A,純度≥96%,牛胰臟)、肌紅蛋白(myoglobin,純度≥98%,馬心)、胰島素(insulin,純度≥95%,牛胰臟)、卵白蛋白(ovalbumin,純度≥98%,蛋清),牛血清白蛋白(bovine serum albumin,純度≥97%,牛血清),α-乳白蛋白(α-lactalbumin,純度≥95%,牛奶)、α-淀粉酶(α-amylase,純度≥98%,枯草桿菌)、考馬斯亮亮G-250(純度≥95%)均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)部分

1.2.1 固定相的制備

以氨基己酸為配基的色譜固定相制備過程如圖1所示。取1.67 g氨基己酸溶于100 mL水中,然后加入5.3 g Na2CO3溶解,用NaOH調(diào)節(jié)pH值為11.5,冰浴下攪拌,緩慢滴加2.0 mLγ-縮水甘油醚氧基丙基三甲氧基硅烷。滴加完畢攪拌10 min后升溫至62 ℃,反應(yīng)24 h。用冰乙酸調(diào)反應(yīng)液pH值為5.5,過濾。在濾液中加入2.0 g活化后的硅膠,90 ℃下反應(yīng)2 h,過濾,依次用500 mL水、100 mL甲醇、100 mL丙酮充分洗滌填料,50 ℃下真空干燥4 h。采用勻漿法將上述填料裝填入尺寸為50 mm×4.6 mm的不銹鋼柱內(nèi)。

圖 1 以氨基己酸為配基的WCX/HIC雙功能色譜固定相的合成Fig. 1 Synthetic procedures of weak cation exchange chromatography/hydrophobic interaction chromatography (WCX/HIC) dual-function stationary phase with aminocaproic acid as the ligand

1.2.2 色譜條件

HIC模式:流動(dòng)相A為3.0 mol/L (NH4)2SO4+20 mmol/L KH2PO4,pH 7.0;流動(dòng)相B為20 mmol/L KH2PO4, pH 7.0。WCX模式:流動(dòng)相A為20 mmol/L KH2PO4, pH 6.5;流動(dòng)相B為20 mmol/L KH2PO4+1.0 mol/L NaCl,pH 6.5。所有流動(dòng)相經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾后使用。流速:1.0 mL/min;線性梯度洗脫:0～100%B,30 min;檢測(cè)波長(zhǎng):280 nm。

1.2.3 溶菌酶的活性測(cè)定方法

參照文獻(xiàn)[18]用溶壁球菌為底物測(cè)定溶菌酶的活性:取50 mg溶壁球菌溶于100 mL磷酸鹽緩沖溶液(pH=7.0)中,25 ℃恒溫?cái)嚢杌旌? min,用磷酸鹽緩沖液將其250 nm處的吸光度值調(diào)至0.6～0.8,移取3.0 mL溶壁球菌菌液于比色皿中,在450 nm處以磷酸鹽緩沖溶液做參比測(cè)定吸光度,加入10 μL溶菌酶溶液,每隔30 s測(cè)一次吸光度值,共讀3 min,以吸光度對(duì)時(shí)間作圖,取最初線性部分,其斜率即為吸光度值的變化率。以吸光度值的變化率對(duì)加入標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的質(zhì)量作圖。用同樣的方法測(cè)定樣品吸光度值的變化率,依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求得蛋白質(zhì)的濃度,與同時(shí)測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)濃度比較便可計(jì)算出活性回收率。

1.2.4 蛋白質(zhì)含量的測(cè)定

采用Bradford法[19]測(cè)定蛋白質(zhì)含量:取7個(gè)5 mL離心管,每個(gè)加入2 mL考馬斯亮藍(lán)溶液。在1～6號(hào)管分別加入質(zhì)量濃度為0.2 g/L的標(biāo)準(zhǔn)牛血清白蛋白溶液0、20、40、80、100、120 μL, 7號(hào)管中加入適量樣品溶液。加入0.15 mol/L NaCl溶液至溶液總體積為2.12 mL,混合均勻,在595 nm處測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線的吸光度值和樣品溶液的吸光度值,據(jù)測(cè)定的蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度計(jì)算相應(yīng)蛋白質(zhì)的質(zhì)量。

1.2.5 蛋白質(zhì)回收率的測(cè)定

在WCX和HIC模式下分別測(cè)定蛋白質(zhì)的質(zhì)量回收率。配制質(zhì)量濃度為5 g/L的蛋白質(zhì)溶液,在WCX和HIC模式下分別進(jìn)樣,每次進(jìn)樣50 μL,收集樣品峰蛋白質(zhì),采用Bradford法測(cè)定樣品峰的蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度,據(jù)測(cè)定的蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度計(jì)算相應(yīng)蛋白質(zhì)的質(zhì)量回收率。質(zhì)量回收率(%)=(回收蛋白質(zhì)質(zhì)量/進(jìn)樣蛋白質(zhì)質(zhì)量)×100%。

1.2.6 靜態(tài)吸附量的測(cè)定

分別考察了WCX和HIC緩沖體系中溶菌酶的吸附平衡。向離心管中加入10 mg合成的雙功能色譜填料,然后加入5 mL現(xiàn)配的0.5 g/L溶菌酶溶液(溶菌酶溶于20 mmol/L KH2PO4, pH 6.5),置于25 ℃恒溫?fù)u床中振蕩,每隔1 h取出離心管,以10 000 r/min的速度離心10 min,取上清液,迅速進(jìn)行蛋白質(zhì)含量測(cè)定,參比液為不含蛋白質(zhì)的空白緩沖液,用紫外分光光度計(jì)在595 nm下測(cè)定20 mmol/L KH2PO4(pH=6.5)和2 mol/L (NH4)2SO4+20 mmol/L KH2PO4(pH=7.0)的緩沖體系吸附蛋白質(zhì)后的吸光度值,直至吸附量不變?yōu)橹埂?/p>

2 結(jié)果與討論

2.1 氨基己酸為配基的WCX/HIC雙功能固定相對(duì)蛋白質(zhì)的分離

如圖1所示,氨基己酸通過氨基與γ-縮水甘油醚氧基丙基三甲氧基硅烷的環(huán)氧基團(tuán)反應(yīng)后,再與活化后硅膠反應(yīng),將氨基己酸修飾到硅膠表面。所合成的固定相配基中含有羧基,在低鹽濃度條件下可表現(xiàn)出WCX的性質(zhì);同時(shí),該配基具有一定的疏水性,在高鹽濃度條件下可表現(xiàn)出HIC的性質(zhì)。因此,分別考察了該MMC固定相在WCX和HIC兩種模式下對(duì)蛋白質(zhì)的分離效果,結(jié)果如圖2所示。

在HIC模式下,考察了細(xì)胞色素C、肌紅蛋白、核糖核酸酶A、溶菌酶、α-淀粉酶和胰島素6種疏水性不同的蛋白質(zhì)在此WCX/HIC雙功能色譜柱上的色譜行為,并與最常用的HIC商品柱TSKgel Ether-5PW進(jìn)行了對(duì)比。如圖2a和2c所示,該色譜固定相在HIC模式下可使6種標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)完全分離,其分離能力與HIC商品柱相當(dāng)。

圖 2 WCX/HIC雙功能色譜柱及兩根商品柱 對(duì)蛋白質(zhì)分離的比較Fig. 2 Chromatograms of the proteins separated by WCX/HIC dual-function mixed mode chromatography (MMC) column and comparison with two commercially available columns a. HIC mode of dual-function MMC column; b. WCX mode of dual-function MMC column; c. HIC mode of TSKgel Ether-5PW; d. WCX mode of TSKgel CM-5PW. The size of the TSK column was 75 mm×7.5 mm. The size of the dual-function column was 50 mm×4.6 mm. Mobile phases in the HIC mode: solution A was 3.0 mol/L (NH4)2SO4+0.02 mol/L KH2PO4 (pH 7.0) and solution B was 0.02 mol/L KH2PO4 (pH 7.0). Mobile phases in the WCX mode: solution A was 0.02 mol/L KH2PO4 (pH 6.5) and solution B was 0.02 mol/L KH2PO4+1.0 mol/L NaCl (pH 6.5). Flow rate: 1.0 mL/min; linear gradient elution: 30 min, 0-100% mobile phase B; detection wavelength: 280 nm. Peaks: 1. cytochrome C (30 μg); 2. myoglobin (50 μg); 3. RNase A (50 μg); 4. lysozyme (15 μg); 5. α-amylase (40 μg); 6. insulin (50 μg); 7. RNase B (50 μg); 8. α-chymotrypsingen A (25 μg).

在WCX模式下,考察了卵白蛋白(pI4.7)、牛血清白蛋白(pI4.98)、α-乳清蛋白(pI5.2)、胰島素(pI5.35)和α-淀粉酶(pI6.0)5種酸性蛋白質(zhì)以及核糖核酸酶B(pI8.8),核糖核酸酶A(pI9.4)、α-糜蛋白酶原A(pI9.2)、細(xì)胞色素C(pI10.6)和溶菌酶(pI11.0)等5種堿性蛋白質(zhì)在該WCX/HIC雙功能固定相上的色譜行為,結(jié)果表明,上述5種酸性蛋白質(zhì)均未在該色譜柱上保留,5種堿性蛋白質(zhì)達(dá)到基線分離(見圖2b)。在TSKgel CM-5PW柱上核糖核酸酶B與核糖核酸酶A、細(xì)胞色素C與α-糜蛋白酶原A色譜峰完全重疊,無法分離,只有4種堿性蛋白質(zhì)可達(dá)到基線分離(見圖2d)。表明所合成的雙功能色譜固定相在WCX模式下對(duì)蛋白質(zhì)的分離能力優(yōu)于商品柱TSKgel CM-5PW。上述結(jié)果表明,這種雙功能固定相在兩種模式下對(duì)蛋白質(zhì)均表現(xiàn)出較高的分離度和選擇性,其分離能力可與商品柱相媲美,在一根雙功能色譜柱上實(shí)現(xiàn)了“一柱二用”的功能。

2.2 質(zhì)量回收率、活性回收率和靜態(tài)吸附量

蛋白質(zhì)的質(zhì)量回收率和活性回收率是衡量色譜柱優(yōu)劣的重要指標(biāo)。選擇了4種在WCX和HIC模式下均保留的蛋白質(zhì),分別測(cè)定了兩種模式下它們的質(zhì)量回收率和活性回收率,結(jié)果如表1所示。在WCX和HIC兩種分離模式下,蛋白質(zhì)的質(zhì)量回收率均不低于95%,表明該雙功能固定相對(duì)蛋白質(zhì)的不可逆吸附很小。溶菌酶在WCX和HIC模式下的活性回收率分別為93.5%和95.3%。在WCX(20mmol/L KH2PO4)和HIC(20 mmol/L KH2PO4+2.0 mol/L (NH4)2SO4)模式下測(cè)定的溶菌酶靜態(tài)吸附量分別為145.2 mg/g和98.3 mg/g。

表 1 WCX和HIC模式下蛋白質(zhì)的質(zhì)量回收率(n=5)

所合成的氨基己酸為配基的WCX/HIC雙功能色譜固定相在IEC和HIC模式下對(duì)蛋白質(zhì)的分離能力與相應(yīng)的商品柱相當(dāng),且具有高的質(zhì)量回收率、活性回收率和負(fù)載量,適于生物大分子的分離。

圖 4 在線單柱二維液相色譜法對(duì)蛋清中溶菌酶純化的(a)色譜圖和(b)SDS-PAGE圖Fig. 4 (a) Chromatogram and (b) sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) analysis of egg white separated by 2DLC-1C (a) chromatogarphic conditions were the same as those in Fig. 3. Peaks in (a): 1. lysozyme purified with WCX mode; 2. lysozyme separated by the second dimensional with HIC mode. Lanes in (b): 1. egg white; 2. fraction of peak 1; 3. fraction of peak 2; 4. lysozyme.

圖 3 在線單柱二維液相色譜法對(duì)8種蛋白質(zhì)的分離色譜圖Fig. 3 Chromatogram of eight proteins separated by on-line two-dimensional liquid chromatography with a single column (2DLC-1C) Mobile phases in the HIC mode: solution A was 3.0 mol/L (NH4)2SO4+0.02 mol/L KH2PO4 (pH 7.0) and solution B was 0.02 mol/L KH2PO4 (pH 7.0). Mobile phases in the WCX mode: solution A was 0.02 mol/L KH2PO4 (pH 7.0) and solution B was 1.0 mol/L (NH4)2SO4+0.02 mol/L KH2PO4 (pH 7.0). Flow rate: 1.0 mL/min. The gradient elution program is represented by the dashed line in the chromatogram. The blue shaded area represents the column equilibrium process with solution A for 5 min, and the yellow shaded area represents the second dimensional online sample injection process. Peaks: 1. RNase B; 2. RNase A; 3. α-chymotrypsin A; 4. cytochrome C; 5. lysozyme; 6. bovine serum albumin; 7. ovalbumin; 8. insulin.

2.3 在線單柱二維液相色譜對(duì)蛋白質(zhì)的分離

如前所述,氨基己酸為配基的雙功能色譜柱在WCX和HIC兩種模式下對(duì)蛋白質(zhì)均有較高的分離能力和選擇性,可替代兩根相應(yīng)單模式色譜柱。由于WCX和HIC的分離機(jī)理是正交的,結(jié)合閥切換技術(shù),采用一根該雙功能色譜柱構(gòu)建了在線2DLC-1C分離系統(tǒng),并用于標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的分離,結(jié)果如圖3所示。8種標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)經(jīng)過第一維WCX分離后,5種堿性蛋白質(zhì)完全分離,牛血清白蛋白、卵白蛋白和胰島素3種酸性蛋白質(zhì)不保留而隨溶劑峰直接流出,收集其餾分于樣品環(huán)Ⅰ中。當(dāng)?shù)谝痪SWCX模式梯度洗脫完成后,用3.0 mol/L (NH4)2SO4溶液平衡色譜柱5 min,以使其轉(zhuǎn)換為HIC模式,對(duì)第一維未分離餾分進(jìn)行第二維HIC分離。經(jīng)過HIC分離后,牛血清白蛋白、卵白蛋白和胰島素這3種酸性蛋白質(zhì)也被完全分離。所以,利用一根WCX/HIC功能色譜柱所構(gòu)建的在線2DLC-1C在60 min內(nèi)完成了8種蛋白質(zhì)的快速分離純化。

2.4 在線單柱二維液相色譜對(duì)蛋清中溶菌酶的純化

為進(jìn)一步驗(yàn)證所合成的WCX/HIC雙功能色譜固定相對(duì)蛋白質(zhì)樣品的分離能力,利用圖3建立的在線單柱二維液相色譜法對(duì)蛋清中的溶菌酶進(jìn)行純化。圖4a為以雞蛋清處理液為樣品,進(jìn)樣量為500 μL的色譜圖。經(jīng)第一維WCX分離,將溶菌酶同其他雜質(zhì)分離,收集溶菌酶樣品峰1。對(duì)系統(tǒng)進(jìn)行重新平衡,轉(zhuǎn)換為HIC模式后,將第一維收集的溶菌酶餾分重新進(jìn)樣進(jìn)行第二維HIC精純化,收集各步溶菌酶的樣品峰,進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)鑒定,并進(jìn)行純度掃描,電泳結(jié)果見圖4b,純度結(jié)果見表2。結(jié)果表明,本試驗(yàn)成功地利用在線2DLC-1C將雞蛋清中溶菌酶的純度由30.3%提高到98.3%。

表 2 在線2DLC-1C對(duì)雞蛋清中溶菌酶分離純化后的純度

3 結(jié)論

以硅膠為基質(zhì)、氨基己酸為配基合成了一種新型WCX/HIC雙功能色譜固定相,該介質(zhì)可分別在WCX和HIC模式下對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行分離,具有較高的分離度和選擇性,分離能力與相應(yīng)的單模式商品柱相當(dāng),具有“一柱二用”功能,可替代兩根單模式的HIC和WCX色譜柱使用。基于此構(gòu)建的在線2DLC-1C可在60 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)8種蛋白質(zhì)的快速分離,且成功地純化了雞蛋清中的溶菌酶,純度達(dá)98.3%。兩種模式共用相同的鹽水體系流動(dòng)相,不僅克服了傳統(tǒng)2DLC流動(dòng)相不兼容的難題,而且一根色譜柱可當(dāng)作兩根色譜柱使用,可大大降低分離介質(zhì)的用量,降低生產(chǎn)成本,對(duì)蛋白質(zhì)組學(xué)研究及重組蛋白藥物的生產(chǎn)具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

[1] Dong Y, Yu Z M, Li H Y, et al. Chinese Journal of Chromatography, 2016, 34(8): 811

董宇, 俞忠明, 李洪玉, 等. 色譜, 2016, 34(8): 811

[2] Hu Z T, Xiao Z, Zhou X, et al. Chinese Journal of Chromatography, 2015, 33(6): 628

胡朝暾, 肖震, 周熙, 等. 色譜, 2015, 33(6): 628

[3] Zhang Q Q, Zhang L, Gao X D, et al. Chinese Journal of Chromatography, 2014, 32(11): 1271

張權(quán)青, 張磊, 高小迪, 等. 色譜, 2014, 32(11): 1271

[4] Zhang Y H, Qibule H, Jin Y, et al. Chinese Journal of Chromatography, 2015, 33(3): 291

張艷海, 其布勒哈斯, 金燕, 等. 色譜, 2015, 33(3): 291

[5] Huang Z, Hong G F, Gao M X, et al. Chinese Journal of Chromatography, 2014, 32(4): 343

黃志, 洪廣峰, 高明霞, 等. 色譜, 2014, 32(4): 343

[6] Zhu G J, Liang Z, Zhang L H, et al. Chinese Journal of Chromatography, 2009, 27(5): 518

朱貴杰, 梁振, 張麗華, 等. 色譜, 2009, 27(5): 518

[7] McLaughlin L W. Chem Rev, 1989, 89(2): 309

[8] Asenjo J A, Andrews B A. J Mol Recognit, 2004, 17(3): 236

[9] Liu P, Yang H Y, Geng X D. J Chromatogr A, 2009, 1216: 7497

[10] Sun X, Yang Y, Geng X D. Journal of Analytical Science, 2010, 26(1): 6

孫萱, 楊云, 耿信篤. 分析科學(xué)學(xué)報(bào), 2010, 26 (1): 6

[11] Zhao K L, Yang L, Wang X J, et al. Talanta, 2012, 98: 86

[12] Song C, Wang J S, Zhao K L, et al. Biomed Chromatogr, 2013, 27(12): 1741

[13] Zhao K L, Yang F, Xia H J, et al. J Sep Sci, 2015, 38(5): 703

[14] Geng X D, Ke C Y, Chen G, et al. J Chromatogr A, 2009, 1216(16): 3553

[15] Yang X M, Yu Y, Geng X D. Scientia Sinica Chimica, 2013, 43(5): 599

楊曉明, 余煒, 耿信篤. 中國(guó)科學(xué): 化學(xué), 2013, 43(5): 599

[16] Yang F, Bai Q, Zhao K L, et al. Anal Bioanal Chem, 2015, 407(6): 1721

[17] Wang J S, Xia H J, Wan G P, et al. Acta Chimica Sinica, 2016, 74(3): 265

王建山, 夏紅軍, 萬廣平, 等. 化學(xué)學(xué)報(bào), 2016, 74(3): 265

[18] Goldberg M E, Rudolph R, Jaenicke R. Biochemistry-US, 1991, 30(11): 2790

[19] Bradford M M. Anal Biochem, 1976, 72(1): 248

A novel dual-function weak cation exchange/hydrophobic interaction chromatography stationary phase with aminocaproic acid as the ligand for protein separation

WANG Jianshan, XIA Hongjun, WAN Guangping, LIU Jiawei, BAI Quan*

(KeyLaboratoryofSyntheticandNaturalFunctionalMoleculeChemistryofMinistryofEducationofChina,InstituteofModernSeparationScience,NorthwestUniversity,ProvincialKeyLaboratoryofModernSeparationScienceofShaanxi,Xi’an710069,China)

A novel dual-function mixed-mode stationary phase based on silica gel functionalized with aminocaproic acid as the ligand was prepared. Because of the ligand with hydrophobicity and containing carboxyl function groups, it could display hydrophobic interaction chromatography (HIC) character in a high salt concentration mobile phase and weak cation exchange chromatography (WCX) character in a low salt concentration mobile phase. As a result, it could be employed to separate proteins with both WCX and HIC modes. The resolution and selectivity of the stationary phase were evaluated under both HIC and WCX modes with protein standards. In comparison with the conventional WCX and HIC columns, the results were satisfactory and acceptable. Protein mass and bioactivity recoveries of more than 93% could be achieved in both WCX and HIC mode using this column. The results indicated that the novel dual-function mixed-mode column in many cases could replace the use of two individual WCX and HIC columns. Based on this two-dimensional (2D) column, a new two-dimensional liquid chromatography (2DLC) technology with a single column (2DLC-1C) was developed. Eight kinds of protein standards could be separated completely with online 2DLC-1C within 60 min. It was also applied to purify lysozyme from egg white successfully with a purity of 98.3%. It is important to proteome research and recombinant protein drug production for saving column expense and simplifying the process in biotechnology.

stationary phase; mixed-mode chromatography (MMC); ion-exchange chromatography (IEC); hydrophobic interaction chromatography (HIC); two-dimensional liquid chromatography (2DLC)

10.3724/SP.J.1123.2016.08019

2016-08-18

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(21545007);陜西省科技統(tǒng)籌創(chuàng)新工程計(jì)劃項(xiàng)目(2013SZS18-K01);陜西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室重點(diǎn)科研項(xiàng)目(2010JS103,11JS097,14JS098,15JS115).

Foundation item: National Natural Science Foundation of China (No. 21545007); Shaanxi Provincial Science and Technology Co-ordinating Innovation Projects (No. 2013SZS18-K01); Key Research Program of Shaanxi Province Key Laboratory (Nos. 2010JS103, 11JS097, 14JS098, 15JS115).

O658

A

1000-8713(2016)12-1228-06

鄒漢法研究員紀(jì)念專輯(上)·研究論文

* 通訊聯(lián)系人. E-mail:baiquan@nwu.edu.cn.