李 政, 顧貴洲, 寧春瑩, 李法云, 楊 磊

(遼寧石油化工大學 生態(tài)環(huán)境研究院, 遼寧 撫順 113001)

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固體微生物菌劑在克拉瑪依石油污染土壤生物修復中的應用

李 政, 顧貴洲, 寧春瑩, 李法云, 楊 磊

(遼寧石油化工大學 生態(tài)環(huán)境研究院, 遼寧 撫順 113001)

分析了克拉瑪依石油污染土壤的理化性質(zhì)，采用固體微生物菌劑對該土壤進行生物修復，考察了最優(yōu)修復條件及修復過程中土壤微生物數(shù)量、酶活性和石油烴組分的變化。結(jié)果表明，克拉瑪依石油污染土壤是以粉砂為主的灰漠土，含水率低，含油率高，弱堿性，土壤中三大營養(yǎng)元素(氮、磷、鉀)的有效含量低，不利于微生物的生長繁殖。最優(yōu)修復條件為土壤孔隙度55%、含水率25%、固體菌劑添加量5%、氮/磷摩爾比10、生物表面活性劑添加量0.5%，在此條件下經(jīng)過60 d的生物修復，含油率由最初的4.07%下降到1.81%，降解率為55.53%，小于C27的正構(gòu)烷烴得到了明顯的降解，土壤中的微生物數(shù)量、酶活性(脫氫酶活性、過氧化氫酶活性和多酚氧化酶活性)均有所提高。在生物修復過程中，單靠改善外在環(huán)境條件進行生物刺激，無法有效去除石油烴，添加微生物菌劑進行生物強化是去除土壤中石油類污染物的關(guān)鍵因素。

固體微生物菌劑； 石油污染土壤； 生物修復； 生物強化； 生物刺激

在石油生產(chǎn)、貯運、煉制加工及使用過程中，由于事故、不正常操作及檢修等原因會造成石油烴類的溢出和排放[1-2]。據(jù)調(diào)查，在油田石油污染嚴重區(qū)域，土壤中殘余石油烴高于環(huán)境背景值500倍以上，含量可達5%～10%[3]。石油烴類進入土壤后，對土壤的理化性質(zhì)產(chǎn)生很大影響，如會堵塞土壤顆粒的孔隙結(jié)構(gòu)，從而使土壤的透氣、透水性能降低；此外，石油烴類污染物能夠與土壤中的無機氮(N)、磷(P)結(jié)合，導致土壤中有效N、P含量大量減少[4-5]，土壤肥力受到嚴重影響；并且石油烴類物質(zhì)中的多環(huán)芳烴(PAHs)具有致癌、致變、致畸等活性，能通過食物鏈在動、植物體內(nèi)逐級富集，威脅人類的生存和健康[6-7]。

中國西北地區(qū)的克拉瑪依油田，具有干旱少雨、植被覆蓋少、土壤貧瘠的特點，生態(tài)系統(tǒng)異常脆弱，土壤一旦遭受石油污染很難自凈。在石油污染土壤的治理方法中，生物修復技術(shù)被認為是最具有生命力的治理技術(shù)[8]。國內(nèi)外學者在篩選石油降解菌株[9]、微生物對石油烴降解機理[10]和石油污染土壤生物修復工藝[11]方面開展了大量的研究，證明了利用生物修復技術(shù)治理石油污染土壤的可行性。目前，將高效降解菌富集液投加到石油污染土壤中進行生物強化是常用的修復技術(shù)之一。但液體菌劑存在不易運輸、存放和使用的缺點，限制了微生物修復技術(shù)在原位場地修復中的應用。將固體微生物菌劑應用到石油污染土壤生物修復，并配合相應的生物刺激手段，包括為微生物生長提供所需的營養(yǎng)元素、優(yōu)化其生長的環(huán)境條件等[12-13]，在克拉瑪依油田石油污染土壤生物修復中更有實際意義。筆者分析了克拉瑪依石油污染土壤的理化性質(zhì)，考察了最優(yōu)修復條件和固體微生物菌劑對石油污染土壤的修復效果，測定了修復過程中土壤的含油率、微生物數(shù)量和土壤的酶活性的變化，為克拉瑪依油田石油污染土壤原位生物修復奠定基礎。

1 實驗部分

1.1 材料和試劑

1.1.1 無機鹽培養(yǎng)基(MSM)

分別將0.6 g Na2HPO4、0.2 g KH2PO4、4.0 g NaNO3、0.3 g MgSO4、0.01 g CaCl2、0.01 g FeSO4、0.5 g酵母粉按順序逐一溶解，用蒸餾水定容至1000 mL。

1.1.2 菌源

所用菌源為前期實驗篩選得到的石油降解混合菌群的菌懸液[14]。無菌條件下取一定量培養(yǎng)7 d的混合菌群的富集液，于22～30℃下5000 r/min離心10 min，收集菌體，用無菌的MSM清洗，5000 r/min再次離心10 min。反復清洗3次以上，制成菌懸液，測定OD600值，調(diào)整菌密度，最終使液體中石油降解菌數(shù)量為1.0×108CFU/mL。

1.1.3 土壤樣品

克拉瑪依油田采油二廠泄油池附近的石油污染土壤，經(jīng)過破碎混勻過2 mm篩后使用。

1.1.4 生物表面活性劑

前期研究[15]發(fā)現(xiàn)石油降解混合菌群中的其中一株單菌為表面活性劑產(chǎn)生菌。經(jīng)過提取純化冷凍干燥獲得生物表面活性劑固體粉末。

1.1.5 試劑

磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、硝酸鈉、硫酸鎂、氯化鈣、硫酸亞鐵、無水硫酸鈉、高錳酸鉀、丙酮、正己烷、鄰苯三酚(均為分析純)、酵母粉，國藥集團化學試劑有限公司產(chǎn)品；氯代三苯基四氮唑(TTC，純度大于98%)，Amresco公司產(chǎn)品；氮肥(尿素，有效氮質(zhì)量分數(shù)46.8%)、磷肥(過磷酸鈣，有效磷質(zhì)量分數(shù)16.4%)，中化集團公司產(chǎn)品。

1.1.6 其他材料

麥麩和草炭土購于當?shù)剞r(nóng)貿(mào)市場。膨松劑為長3～5 mm的干草屑，取自校園草坪，經(jīng)晾曬粉碎后使用。

1.2 固體微生物菌劑的制備

將麥麩和草炭土以質(zhì)量比為1混合均勻作為載體，高溫滅菌后冷卻到22～30℃。將50 mL菌懸液、50 mL MSM、300 mL無菌水和1000 g上述載體混合均勻，通入無菌空氣，于22～30℃下培養(yǎng)3 d，無菌室內(nèi)風干，得到石油降解菌數(shù)量約為1.0×106CFU/g的固體菌劑。

1.3 石油污染土壤生物修復條件的優(yōu)化

N、P營養(yǎng)，水分含量和石油污染程度是石油降解菌生長繁殖的限制因素[16]，因此在石油污染生物修復過程中采取投加適量的氮磷營養(yǎng)、定期補充適量的水分和投加生物表面活性劑改善原油的疏水性等措施，來促進降解菌的生長繁殖，從而提高石油污染土壤的修復效率；同時考慮原位修復時外在可調(diào)控因素，選擇土壤孔隙度、含水率、菌劑用量、N/P比和生物表面活性劑用量5個不同因素進行實驗，對修復條件進行優(yōu)化。

實驗在直徑為18 cm、高為15 cm的盆缽中進行。每組實驗用土1000 g，每1組3個平行樣。將盆缽置于22～30℃下，間隔10 d取樣，測定土壤的含油率。為了保證樣品的均質(zhì)和維持土壤中的好氧環(huán)境，采樣前將土壤上下翻動混勻。

1.4 石油污染土壤生物修復實驗

選擇優(yōu)化后的生物修復條件進行實驗，測定土壤的含油率、微生物數(shù)量(細菌、真菌、放線菌和石油降解菌)和土壤酶活性(脫氫酶活性、過氧化氫酶活性和多酚氧化酶活性)。

采用稀釋平板法[17]測定土壤中細菌、真菌、放線菌數(shù)量。參照最大或然數(shù)[18](Most probable number， MPN)測定土樣中石油降解菌數(shù)量。參照文獻[19]方法測定土壤酶活性。采用氯代三苯基四氮唑(TTC)還原法測定脫氫酶活性，以1 g干土1 h生成的甲臜(TPF)為脫氫酶的一個活性單位；采用高錳酸鉀滴定法測定過氧化氫酶活性，酶活性以1 g干土1 h內(nèi)消耗的0.1 mol/L KMnO4體積(以mL計)表示；采用鄰苯三酚比色法測定多酚氧化酶活性，1 g干土1 h內(nèi)生成的沒食子素的量為多酚氧化酶的1個活性單位。

1.5 土壤理化性質(zhì)的測定

參照土壤農(nóng)業(yè)化學分析方法[20]測定土壤的基本理化性質(zhì)。采用超聲波-紅外分光光度法[21]測定土壤中石油烴含量，以含油率(質(zhì)量分數(shù))表示。

1.6 石油烴氣相色譜分析

采用GC-FID (CP3800)分析石油烴組分。進樣量為1 μL，分流比1/2， CP5960毛細管色譜柱(30 m×0.53 mm×0.25 μm)。色譜柱初溫35℃，保持2 min，10 ℃/min程序升溫至350℃，保持10 min；載氣為N2；進樣口溫度20℃，保持0.1 min，以175 ℃/min線速程序升溫，終止溫度350℃；檢測器溫度350℃。

2 結(jié)果與討論

2.1 克拉瑪依油田石油污染土壤的基本性質(zhì)

用于生物修復實驗的克拉瑪依油田石油污染土壤的理化性質(zhì)列于表1，石油污染土壤微生物數(shù)量和酶活性測定結(jié)果列于表2。未經(jīng)污染的原生灰漠土是新疆主要的農(nóng)業(yè)土壤，具有“白(有機碳含量低)、板(板結(jié)，土壤結(jié)構(gòu)差)、干(保水保肥性差)”的特點[22]。由表1可知，實驗所用土壤仍具有原生灰漠土的特性，如土壤顆粒主要以粉砂為主，孔隙度和含水率較低，容易板結(jié)，保水能力差；但也具有自身的特點，土壤含油率6.15%高于國家標準0.3%[23]，有機質(zhì)含量較高，含油率對有機質(zhì)含量貢獻較大。另外，土壤中重金屬離子Cu、Zn、Pb、Cd含量均低于國家標準[23]，說明土壤未遭受重金屬離子的污染；土壤為弱堿性，土壤中N、P、K營養(yǎng)元素的有效含量不高，不利于微生物的生長繁殖。

表1 克拉瑪依油田石油污染土壤樣品的理化性質(zhì)

由表2可知，土壤中細菌的數(shù)量最多，放線菌和真菌次之，石油降解菌數(shù)量最少。土壤中脫氫酶活性、過氧化氫酶活性和多酚氧化酶活性分別為1.39 mg/(g·h)、0.56 mL/(g·h)和0.30 mg/(g·h)。

表2 克拉瑪依油田石油污染土壤中的微生物數(shù)量和酶活性

2.2 克拉瑪依油田石油污染土壤生物修復條件優(yōu)化

2.2.1 土壤孔隙度

研究表明，添加膨松劑改善土壤的孔隙度能夠提高土壤的保水和通氣能力，促進降解菌生長繁殖，強化微生物降解作用[24]。將土壤樣品與一定量膨松劑混合均勻，調(diào)整土壤的孔隙度分別為50%、55%、60%、65%，接種質(zhì)量分數(shù)為5%的固體菌劑，并作同等條件下土壤孔隙度為原始值(31%)的對照實驗。定期補充水分保持土壤含水率為20%，間隔10 d翻動土壤，同時取樣測定土壤中的含油率，結(jié)果示于圖1。

圖1 不同孔隙度石油污染土壤的含油率隨培養(yǎng)時間的變化

由圖1可以看出，當土壤的孔隙度為原始值31%，即不添加膨松劑時，土壤中的石油烴降解不明顯，60 d修復之后土壤含油率僅下降0.58%；添加膨松劑改變土壤的孔隙度后，土壤中的石油烴得到明顯降解，孔隙度為55%、60%和65%的土壤經(jīng)過60d修復土壤含油率變化明顯，由最初的4.05%下降到2.5%以下，降解率均達到40%以上；但隨著膨松劑添加量的增多，土壤孔隙度變大，導致土壤的持水性變差，水分補充的頻率變高。綜合考慮，選擇孔隙度為55%的土壤為最適修復條件。

2.2.2 土壤含水率

將土壤樣品與一定量膨松劑混合均勻，調(diào)整土壤的孔隙度為55%，接種質(zhì)量分數(shù)為5%的固體菌劑，定期補充水分保持土壤含水率分別為15%、20%、25%、30%、35%，間隔10d翻動土壤，同時取樣測定土壤中的含油率，結(jié)果示于圖2。

圖2 不同含水率石油污染土壤中含油率隨培養(yǎng)時間的變化

土壤含水率對土壤中微生物影響顯著，是影響石油降解菌生長繁殖的限制因素[16]。賈建麗等[25]也發(fā)現(xiàn)，水分是石油污染土壤微生物多態(tài)性的關(guān)鍵限定性因子，是制約石油污染土壤微生物多態(tài)性的重要因素。由圖2可知，當土壤含水率低于20%時，土壤含油率在生物修復的第30 d才得到較大幅度的下降，而當土壤含水率高于20%時，土壤含油率在生物修復的第20 d就得到較大幅度的下降，可見含水率影響降解菌對石油烴的利用速率。隨著土壤含水率的提高，土壤中石油烴含量逐漸降低，當含水率為25%時，經(jīng)過60 d的生物修復，土壤含油率由4.05%降低為2.42%，石油烴降解率達到40.25%；繼續(xù)提高含水率，含油率降低不明顯，同時考慮原位修復時當?shù)馗珊瞪儆?、水資源短缺，保持土壤中較高的含水率很難實現(xiàn)，因此，選擇土壤含水率25%為最適修復條件。

2.2.3 菌劑用量

將土壤樣品與一定量膨松劑混合均勻，調(diào)整土壤的孔隙度分別為55%，分別接種質(zhì)量分數(shù)為3%、5%、7%、9%的固體菌劑，同時作同等條件不添加菌劑的對照實驗，定期補充水分保持土壤含水率為25%，間隔10 d翻動土壤，同時取樣測定土壤中的含油率，結(jié)果示于圖3。

圖3 不同菌劑用量下石油污染土壤中含油率隨培養(yǎng)時間的變化

由圖3可以看出，不添加菌劑的石油污染土壤的含油率變化不大，表明其中的石油烴降解不明顯，而所有添加菌劑的土壤樣品的石油烴得到明顯降解，說明菌劑加入可以明顯改善土壤的修復效果。隨著菌劑添加量的增大，土壤的含油率逐漸降低，石油烴的降解率升高；當添加5%的固體菌劑修復石油污染土壤60 d后，土壤的含油率由最初的4.05%降低到2.40%，降解率為40.74%；而當菌劑添加量繼續(xù)增大，土壤的含油率雖然也逐漸降低，但幅度變小，而且菌劑添加量較大會增加成本，從經(jīng)濟上會造成不必要的浪費。綜合考慮，選擇固體菌劑添加量為5%。

2.2.4 土壤的n(N)/n(P)

將一定量的氮肥、磷肥溶解后添加到石油污染土壤樣品中，使土壤有效P質(zhì)量分數(shù)為200 mg/kg，通過調(diào)整氮肥含量使土壤中n(N)/n(P)分別為5、10、15、20，然后與一定量膨松劑混合均勻，調(diào)整土壤的孔隙度為55%，接種質(zhì)量分數(shù)為5%的固體菌劑，定期補充水分保持土壤含水率為25%，間隔10 d翻動土壤，同時取樣測定土壤中的含油率，結(jié)果示于圖4。

圖4 不同n(N)/n(P)的石油污染土壤的含油率隨培養(yǎng)時間的變化

N、P是微生物新陳代謝和繁殖所必須的營養(yǎng)物質(zhì)。降解石油的細菌細胞化學組成可以用C106H180O45N16P1表示[26]，因此石油污染土壤生物修復的最佳可生物利用的n(C)∶n(N)∶n(P)為100∶15∶1。當土壤受到石油烴的污染以后，碳源過量，對比微生物降解所需最佳n(C)∶n(N)∶n(P)，土壤中生物可利用的N、P元素嚴重不足，限制微生物的生長繁殖[27-28]。因此在進行石油污染土壤修復時，需要添加相應營養(yǎng)元素來滿足土壤中微生物的營養(yǎng)需求，增強土壤微生物活性，從而加快石油烴的分解。由圖4可知，經(jīng)過60 d的生物修復，n(N)/n(P)為10的實驗組土壤含油率減少最明顯，由初始的4.03%降低為2.12%，石油烴降解率為47.39%。n(N)/n(P)過低或者過高均不利于土壤中石油烴的降解，這是因為n(N)/n(P)過低時，其中的N、P營養(yǎng)不能達到微生物生長繁殖所需要的比例，限制微生物的代謝；n(N)/n(P)過高，N、P營養(yǎng)過剩會對微生物產(chǎn)生毒害作用[29]。因此，選擇n(N)/n(P)為10為最適修復條件。

2.2.5 生物表面活性劑用量

將一定量的氮肥、磷肥溶解后添加到土壤中，調(diào)整土壤的n(N)/n(P)為10，然后與一定量膨松劑混合均勻，調(diào)整土壤的孔隙度為55%，接種質(zhì)量分數(shù)為5%的固體菌劑，分別添加質(zhì)量分數(shù)為0.1%、0.3%、0.5%、0.7%的生物表面活性劑，并作同等條件下不添加表面活性劑的對照實驗，定期補充水分保持土壤含水率為25%，間隔10 d翻動土壤，同時取樣測定土壤中的含油率，結(jié)果示于圖5。

圖5 不同生物表面活性劑添加量時石油污染土壤的含油率隨培養(yǎng)時間的變化

在石油污染土壤的生物修復過程中，污染物從土壤表面到細胞內(nèi)部的傳遞速率是生物降解的一大限制因素。表面活性物質(zhì)的加入能夠改善原油的疏水性，降低土壤顆粒對原油的吸附性，加快這一傳質(zhì)過程，從而提高其生物可利用性[30]。與化學合成的表面活性劑相比，生物表面活性劑具有無毒或者低毒的優(yōu)點，并且可生物降解，對環(huán)境的影響較小，因而非常適合在環(huán)境領域應用。由圖5可以看出，經(jīng)過60 d的生物修復，添加生物表面活性劑的實驗組土壤樣品的含油率降低更加顯著。由于該生物表面活性劑為混合菌群本身降解過程中產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物，不對土壤中其它降解菌產(chǎn)生毒性，且同時參與了某些降解菌的共代謝過程，因此具有較好的降解效果。隨著表面活性劑添加量的增加，土壤的含油率逐漸降低，當添加生物表面活性劑質(zhì)量分數(shù)為0.5%時，土壤含油率由4.07%下降到1.81%，石油烴降解率為55.53%；添加表面活性劑質(zhì)量分數(shù)為0.7%時，石油烴降解率為56.79%。綜合考慮，選擇生物表面活性劑添加量為質(zhì)量分數(shù)0.5%是最適生物修復條件。

綜上所述，石油污染土壤生物修復的優(yōu)化條件為土壤孔隙度55%、土壤含水率25%、固體菌劑添加量5%、n(N)/n(P)=10、生物表面活性劑添加量0.5%。

2.3 石油污染土壤生物修復效果

2.3.1 土壤含油率的變化

在上述優(yōu)化的生物修復條件下對石油污染土壤室內(nèi)生物修復60 d，土壤含油率的變化如圖6所示。

圖6 優(yōu)化條件下石油污染土壤修復中含油率隨培養(yǎng)時間的變化

由圖6可知，對于添加微生物菌劑的土壤，在修復最初的20 d，含油率變化不大，此時降解菌可能處在適應階段，還沒發(fā)揮降解作用；在20～50 d，含油率迅速降低，表明降解菌已經(jīng)開始適應該土壤環(huán)境，在大量增殖的同時降解了污染物；而50 d之后，降解速率變緩，可能是因為此時營養(yǎng)物質(zhì)消耗殆盡，并且原油中容易被微生物利用的組分變少，剩余的難于被降解甚至有毒的組分較多，從而導致降解速率變慢；添加菌劑的土壤修復60 d，含油率由最初的4.07%下降到1.81%，降解率為55.53%。而同等條件不添加菌劑的土壤含油率變化不大，僅由最初的4.07%下降到3.15%，石油降解率為22.6%，遠低于添加菌劑的土壤?？梢姡瑢τ谑蜔N降解菌含量(3.24×103CFU/g，見表2)較少的土壤，單純的通過添加營養(yǎng)物質(zhì)(氮、磷肥)、改善土壤的理化性質(zhì)(增大孔隙度、增大含水率)以及改善原油的性狀(添加生物表面活性劑)等措施來刺激土壤中固有降解菌達到降解石油烴的目的不可行，必須再投加具有高效降解石油烴能力的菌劑，才可以有效地強化生物修復的速率和效果。

2.3.2 石油烴組成的變化

石油污染土壤添加微生物菌劑和對照土壤樣品室內(nèi)生物修復60 d后石油烴組成的氣相色譜示于圖7。從圖7可以看出，經(jīng)過60 d的生物修復，與對照土壤相比，添加菌劑的石油污染土壤中小于C27的烴類得到了明顯的降解。說明低碳數(shù)的烴類組分在修復過程中優(yōu)先被微生物利用，而菌劑對高碳原子數(shù)石油烴的利用率低[31]。

圖7 石油污染土壤修復60 d后殘余石油烴組分的氣相色譜

2.3.3 土壤微生物數(shù)量的變化

石油污染土壤經(jīng)微生物菌劑室內(nèi)生物修復60 d過程中微生物數(shù)量的變化如圖8所示。由圖8可知，整個修復過程中，真菌的數(shù)量變化不大，放線菌數(shù)量略有升高，細菌和石油降解菌數(shù)量變化規(guī)律基本一致，變化幅度最大。土壤中固有的石油降解菌含量較少，而添加菌劑后，石油降解菌數(shù)量由3.24×103CFU/g(見表2)增加到1.04×104CFU/g，對應的細菌的數(shù)量也有很大的增加。在修復最初的20 d，石油降解菌數(shù)量增加緩慢，這是因為此時菌群處于適應期，生長代謝較慢；之后，隨著菌群逐漸適應土壤環(huán)境，石油降解菌大量生長繁殖，在修復的第50 d，石油降解菌數(shù)量增加到1.15×106CFU/g，在第60 d增加到1.6×106CFU/g，占細菌總數(shù)(2.0×106CFU/g)的80%。在土壤中內(nèi)源性烴降解菌數(shù)量大于106CFU/g時，土壤中石油烴污染物降解速率會較快[32]，因此，在生物修復的第50 d應該采取一定的措施，如適當?shù)奶砑訝I養(yǎng)、增加土壤中的氧氣含量等來改善石油降解菌的外部生長環(huán)境，促進污染物的進一步降解。

圖8 石油污染土壤微生物數(shù)量隨培養(yǎng)時間的變化

2.3.4 土壤酶活性的變化

在土壤生態(tài)系統(tǒng)的物質(zhì)循環(huán)和能量轉(zhuǎn)化中，土壤酶起著非常重要的作用，它催化土壤中的一切生物化學反應，反映土壤中各種生物化學過程的強度和方向[33]。當土壤受到石油的污染后，土壤系統(tǒng)中酶活性會受到一定的影響，它能夠有效地促進土壤中的有機污染物進行凈化。 土壤酶作為土壤的組成部分，是土壤生物活性的一個重要指標，其活性的大小反映土壤中生化反應的方向強度[34]。微生物菌劑對石油污染土壤室內(nèi)生物修復60 d過程中，土壤中脫氫酶活性、過氧化氫酶活性以及多酚氧化酶活性的變化列于表3。

脫氫酶屬于胞內(nèi)酶，是土壤中很重要的一種酶，它能夠催化有機物質(zhì)脫氫，起著氫的中間轉(zhuǎn)化傳遞作用，因此脫氫酶活性可以反映處理體系內(nèi)活性微生物量及其對有機物的降解活性，進而評價降解性能[35]。過氧化氫酶廣泛存在于微生物的細胞中，是參與土壤中物質(zhì)和能量轉(zhuǎn)化的一種重要的氧化還原酶[36]。過氧化氫酶是在生物呼吸過程中和有機物質(zhì)的生物化學氧化反應過程中形成，在土壤營養(yǎng)物質(zhì)的轉(zhuǎn)化過程中起著重要的作用，它可以分解土壤中對微生物有害的過氧化氫物(微生物的呼吸作用及土壤有機物氧化分解過程中會產(chǎn)生一定濃度的過氧化氫物)，參與土壤有機碳的轉(zhuǎn)化，為土壤微生物活動提供一個良好的土壤環(huán)境，并在一定程度上反映了土壤生物化學過程的強度，而且與土壤肥力狀況關(guān)系密切[37]。土壤中的多酚氧化酶是一類含銅的氧化還原酶，能將土壤腐殖質(zhì)組分中芳香族化合物氧化成醌，醌與土壤中蛋白質(zhì)、氨基酸、 糖類、礦物等物質(zhì)反應生成大小相對分子質(zhì)量不等的有機質(zhì)，完成土壤芳香族化合物循環(huán)，促進土壤有機碳的累積，改善土壤物理性狀[38]。多酚氧化酶與土壤中芳烴和酚類的降解密切相關(guān)[39]。

由表3可知，在生物修復的過程中，土壤中脫氫酶活性、過氧化氫酶活性和多酚氧化酶活性均發(fā)生了較大的變化，均隨著修復時間的增長不斷升高。

表3 石油污染土壤室內(nèi)生物修復60 d過程中酶活性隨培養(yǎng)時間的變化

經(jīng)過60 d的生物修復，土壤中脫氫酶活性增加幅度較大，說明石油污染土壤中氫原子的傳遞速率增加，石油類有機污染物的氧化分解速率加快；過氧化氫酶活性逐漸升高，這是因為在生物修復過程中土壤微生物大量增加，尤其是石油降解菌大量繁殖，使土壤中的石油烴得到氧化分解，同時也產(chǎn)生大量過氧化氫，微生物為避免細胞膜等被氧化而分泌更多的過氧化氫酶，導致土壤中過氧化氫酶活性增大；多酚氧化酶活性逐漸升高，這是因為在生物修復過程中石油污染土壤中的芳烴被氧化為酚類物質(zhì)，刺激微生物產(chǎn)生大量多酚氧化酶，使土壤的多酚氧化酶活性增大。

3 結(jié) 論

(1)從克拉瑪依油田采集的石油污染土壤為灰漠土，成分以粉砂為主，土壤未遭受重金屬離子的污染，含水率低，含油率6.15%高于國家標準，弱堿性，土壤中三大營養(yǎng)元素(N、P、K)的有效含量很低，不利于微生物的生長繁殖。

(2)使用固體微生物菌劑對該石油污染土壤進行修復的優(yōu)化條件為土壤孔隙度55%、土壤含水率25%、固體菌劑添加量5%(質(zhì)量分數(shù))、n(N)/n(P)為10、生物表面活性劑添加量0.5%(質(zhì)量分數(shù))。

(3)在生物修復過程中，單靠改善外在環(huán)境條件進行生物刺激不能有效去除石油烴，添加微生物菌劑進行生物強化是去除土壤中石油烴的關(guān)鍵因素。在最優(yōu)修復條件下，添加菌劑的土樣經(jīng)過60 d的生物修復，含油率由最初的4.07%下降到1.81%，降解率為55.53%，小于C27的正構(gòu)烷烴得到了明顯的降解，并且在生物修復過程中微生物數(shù)量、土壤的酶活性(脫氫酶活性、過氧化氫酶活性和多酚氧化酶活性)均有所提高。

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Application of Solid Microbial Agent in Bioremediation ofPetroleum Contaminated Soil in Karamay Oilfield

LI Zheng, GU Guizhou, NING Chunying, LI Fayun, YANG Lei

(InstituteofEco-environmentalSciences,LiaoningShihuaUniversity,Fushun113001,China)

In order to study solid microbial agent bioremediation for petroleum contaminated soil in Karamay oilfield, the physicochemical properties of soil were analyzed. The optimal bioremediation conditions and the changes of soil microbe quantity, enzyme activity and hydrocarbon component in the process of bioremediation were investigated. The results showed that the Karamay petroleum contaminated soil was silt-based gray desert soil with low H2O content, high oil content, weak alkaline, and the available content of three major nutrients (nitrogen, phosphorus and potassium) was low, which was not conducive to the growth of microorganisms. The optimal bioremediation conditions were soil porosity 55%, moisture mass fraction 25%, inoculation amount of microbial agent 5%, nitrogen/phosphorus molar ratio 10 and the addition amount of biosurfactant 0.5%. After 60 d bioremediation under the optimal conditions, the oil content in petroleum contaminated soil dropped from 4.07% to 1.81% with the degradation rate 55.53%, andn-alkanes less than C27were biodegraded obviously. In this process, both the microbe quantity and enzyme activities (dehydrogenase activity, catalase activity and polyphenol oxidase activity) in the soil were improved. In the bioremediation process, only the improvement of external environment conditions for biostimulation could not effectively remove petroleum hydrocarbons, while the addition of microbial agents for bioaugmentation on the basis was the key factor to remove petroleum pollutants from soil.

solid microbial agent; petroleum contaminated soil; bioremediation; bioaugmentation; biostimulation

2016-01-15

國家自然科學基金項目(41571464)和遼寧省教育廳科學研究項目(L2014148)資助

李政，女，講師，博士，從事石油污染治理相關(guān)研究；E-mail:lizheng.zz@163.com

李法云，男，教授，博士，從事石油污染土壤修復方面的研究；E-mail:lifayun@hotmail.com

1001-8719(2016)06-1195-10

X172； TE991

A

10.3969/j.issn.1001-8719.2016.06.016