辛 華， 于海東， 楊志偉， 王 琳， 劉君星， 江清林

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院， 黑龍江 佳木斯 154003)

雷帕霉素抑制人前列腺癌細(xì)胞PC－3生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移的實(shí)驗(yàn)研究

辛 華， 于海東， 楊志偉， 王 琳， 劉君星， 江清林

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院， 黑龍江 佳木斯 154003)

目的:對(duì)人前列腺癌細(xì)胞PC－3進(jìn)行雷帕霉素的藥物試驗(yàn)，并觀察其對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移的影響。方法:抽取2012年3月至2013年11月本院經(jīng)體外培養(yǎng)的人前列腺癌細(xì)胞PC－3作為研究樣本，分別采用0ng/mL、10ng/mL、25ng/mL的雷帕霉素對(duì)其進(jìn)行藥物干預(yù)，并采用MTT法以及流式細(xì)胞儀等檢測(cè)措施分別觀察PC－3細(xì)胞的增殖、周期以及凋亡等變化。結(jié)果:在0ng/mL的雷帕霉素下，PC－3的生長(zhǎng)增殖未受到任何抑制作用。分別在12h、24h以及36h的培養(yǎng)時(shí)間下，25ng/mL的雷帕霉素濃度具有更高的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率，組間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，分別在兩種不同的濃度下，12h、24h以及36h之間兩兩比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。分別在12h、24h以及36h的培養(yǎng)時(shí)間下不同濃度的雷帕霉素組間兩兩比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，分別在三種不同濃度下，對(duì)不同培養(yǎng)時(shí)間的組別進(jìn)行比較，除了0ng/mL下24h與36h的培養(yǎng)時(shí)間下PC－3凋亡作用差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，其他組間兩兩相比均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)論:雷帕霉素對(duì)人前列腺癌細(xì)胞PC－3具有較好的抑制生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移效果，且濃度越高，培養(yǎng)時(shí)間越長(zhǎng)，效果越明顯。

雷帕霉素； 人前列腺癌細(xì)胞； PC－3； 轉(zhuǎn) 移

本次實(shí)驗(yàn)主要通過(guò)對(duì)人前列腺癌細(xì)胞進(jìn)行雷帕霉素的藥物實(shí)驗(yàn)，觀察其對(duì)癌細(xì)胞增殖生長(zhǎng)以及侵襲轉(zhuǎn)移的影響，具體如下。

1　資料與方法

1.1一般資料:抽取2012年3月至2013年11月本院經(jīng)體外培養(yǎng)的人前列腺癌細(xì)胞PC－3作為研究樣本。所有細(xì)胞樣本均具有穩(wěn)定的生長(zhǎng)速度，選擇IlyClone公司的RPMI－1640培養(yǎng)基對(duì)細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，該培養(yǎng)基主要含有10%的胎牛血清、1%的鏈霉素以及1%的青霉素[1]。進(jìn)而采用胰酶進(jìn)行消化，傳代培養(yǎng)，并取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2方 法

1.2.1藥物濃度的設(shè)置:將雷帕霉素藥物分別按照0ng/mL、10ng/mL、25ng/mL的三種不同濃度溶于培養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)，并將0mg/L的組為對(duì)照組。

1.2.2采用MTT法對(duì)PC－3細(xì)胞增殖生長(zhǎng)的測(cè)定:取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的PC－3細(xì)胞，沖洗消化后，將其與96孔培養(yǎng)板內(nèi)進(jìn)行接種，1000個(gè)細(xì)胞每孔，并于孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)24h，保持5%的二氧化碳濃度以及37℃的箱溫。之后，除去培養(yǎng)液，將三種不同濃度的雷帕霉素溶液分別加入每孔內(nèi)，為保證實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性，每個(gè)濃度的試驗(yàn)可在6個(gè)重復(fù)孔內(nèi)進(jìn)行，繼續(xù)在溫育下分別培養(yǎng)12h、24h以及36h。將5mg/mL的MTT分別加入每孔中，20μl每孔，繼續(xù)培育4h，取出上清液，在將DMSO分別加入每孔中，150μl每孔。10min后常規(guī)進(jìn)行PC－3細(xì)胞生長(zhǎng)增殖抑制率的計(jì)算，依據(jù)公式:抑制率＝[(對(duì)照組OD值－本底OD值)－(實(shí)驗(yàn)組OD值－本底OD值)?/(對(duì)照組OD值－本底OD值)]×100%[2]。

1.2.3流式細(xì)胞術(shù)FCM對(duì)PC－3細(xì)胞周期變化的檢查:將PC－3細(xì)胞接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶(25cm2的容量)內(nèi)，配置1×106/mL的細(xì)胞濃度，置于5%的二氧化碳濃度以及37℃的環(huán)境下進(jìn)行培養(yǎng)，24h后除去培養(yǎng)液，再將其置于4℃的環(huán)境下培養(yǎng)，以保證細(xì)胞的同步化生長(zhǎng)，2h后分別將不同濃度的2.5mL雷帕霉素溶液對(duì)應(yīng)加入各瓶?jī)?nèi)，再次孵育12h、24h以及36h后，取出舊培養(yǎng)液，并采用磷酸鹽緩沖液對(duì)培養(yǎng)瓶進(jìn)行沖洗，常規(guī)消化處理，再將1.5mL的枸櫞酸溶液加入其中，配置1 ×106/mL的懸液細(xì)胞，再次進(jìn)行磷酸鹽緩沖液的沖洗，之后對(duì)其進(jìn)行5min的離心處理，取出細(xì)胞，并采用70%的乙醇進(jìn)行固定。再次進(jìn)行5min的離心處理，收集固定細(xì)胞，去除上清液。在避光環(huán)境下加入Binding Buffer，30min后再加入PI，5min后再次加入Binding Buffer，隨后采用流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞死亡率以及凋亡率的檢測(cè)。

1.3觀察指標(biāo):①觀察不同濃度的雷帕霉素對(duì)人前列腺癌細(xì)胞增殖生長(zhǎng)的抑制情況，并將12h、24h以及36h的不同培養(yǎng)時(shí)間下的抑制效果進(jìn)行比較。②觀察不同濃度的雷帕霉素對(duì)人前列腺癌細(xì)胞凋亡的影響，并將12h、24h以及36h的不同培養(yǎng)時(shí)間下的凋亡作用進(jìn)行比較。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:采用SPSS19.0軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，計(jì)數(shù)資料以率表示，組間比較采用F檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié) 果

2.1不同濃度雷帕霉素在不同培養(yǎng)時(shí)間下對(duì)PC－3生長(zhǎng)增殖抑制的影響:在0ng/mL的雷帕霉素下，PC－3的生長(zhǎng)增殖未受到任何抑制作用。分別在12h、24h以及36h的培養(yǎng)時(shí)間下，25ng/mL的雷帕霉素濃度具有更高的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率，組間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，隨著雷帕霉素濃度的逐漸增高，PC－3的生長(zhǎng)抑制效果越好。分別在兩種不同的濃度下，12h、24h以及36h之間兩兩比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，培養(yǎng)時(shí)間越長(zhǎng)，PC－3的增殖抑制效果更好。見(jiàn)表1。

表1　不同濃度雷帕霉素在不同培養(yǎng)時(shí)間下對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率的影響(±s)

表1　不同濃度雷帕霉素在不同培養(yǎng)時(shí)間下對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率的影響(±s)

注:F＞2時(shí)組間相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)

雷帕霉素濃度12h24h36hF 10ng/mL17.9±0.3ab28.1±1.1c32.0±0.52.584 25ng/mL24.8±1.2de34.5±1.3f43.2±0.92.610 P＜0.05＜0.05＜0.05

2.2不同濃度雷帕霉素在不同培養(yǎng)時(shí)間下對(duì)PC－3細(xì)胞凋亡的影響:分別在12h、24h以及36h的培養(yǎng)時(shí)間下對(duì)不同濃度的雷帕霉素對(duì)PC－3細(xì)胞的凋亡作用進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)組間兩兩比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，隨著濃度的不斷升高，對(duì)PC－3細(xì)胞凋亡的作用越明顯。同時(shí)分別在三種不同濃度下，對(duì)不同培養(yǎng)時(shí)間的組別進(jìn)行比較，相關(guān)數(shù)據(jù)相比均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見(jiàn)表2。

表2　不同濃度雷帕霉素在不同培養(yǎng)時(shí)間下對(duì)PC－3細(xì)胞凋亡的影響(±s)

表2　不同濃度雷帕霉素在不同培養(yǎng)時(shí)間下對(duì)PC－3細(xì)胞凋亡的影響(±s)

注:F＞2時(shí)組間相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)

雷帕霉素濃度12h24h36hF 0ng/mL3.8±0.2ab5.9±0.4c6.1±0.62.537 10ng/mL10.8±0.3de17.7±0.9f20.6±0.83.227 25ng/mL14.9±0.5gh21.3±1.0i28.5±1.23.970 F2.8212.0983.550 P＜0.05＜0.05＜0.05

3　討 論

雷帕霉素屬于一類(lèi)新型的大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)免疫抑制劑，可通過(guò)阻斷不同細(xì)胞因子間的傳導(dǎo)信號(hào)，破壞癌細(xì)胞的生長(zhǎng)進(jìn)程，從而起到較好的抑制生長(zhǎng)及侵襲轉(zhuǎn)移的作用[3]。本次試驗(yàn)通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)，探討不同濃度的雷帕霉素對(duì)PC－3細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制及轉(zhuǎn)移效果。0ng/ mL的雷帕霉素未對(duì)PC－3的生長(zhǎng)增殖起到任何抑制作用，然而在不同的雷帕霉素濃度下，PC－3的生長(zhǎng)抑制率各不相同，濃度越高，其抑制效果越好。然而不同的培養(yǎng)時(shí)間也對(duì)PC－3的生長(zhǎng)抑制具有不同的效果，培養(yǎng)時(shí)間越長(zhǎng)，其抑制率越高，如此次試驗(yàn)中分別在兩種不同的濃度下，差異顯著，說(shuō)明培養(yǎng)時(shí)間越長(zhǎng)，PC－3的增殖抑制效果更好。雷帕霉素對(duì)PC－3的凋亡作用于生長(zhǎng)抑制作用形似，分別在12h、24h以及36h的培養(yǎng)時(shí)間下對(duì)不同濃度的雷帕霉素對(duì)PC－3細(xì)胞的凋亡作用進(jìn)行觀察，濃度越高，PC－3凋亡作用越強(qiáng)。同時(shí)，分別在三種不同濃度下，對(duì)不同培養(yǎng)時(shí)間的組別進(jìn)行比較，均表現(xiàn)為培養(yǎng)時(shí)間越長(zhǎng)，PC－3凋亡作用越顯著。

[1] 邊躍俊.前列腺特異抗原(PSA)檢測(cè)的臨床應(yīng)用[J].哈爾濱醫(yī)藥，2005，25(6):94～96.

[2] 韓嬌艷.鹽酸川芎嗪通過(guò)mTOR信號(hào)通路和凋亡通路抑制前列腺癌PC－3細(xì)胞的增殖[D].重慶醫(yī)科大學(xué)，2013.

[3] 姚雙，康曉明，李麗，等.雷帕霉素對(duì)大鼠慢性腎間質(zhì)纖維化中HGF、TGF－β的表達(dá)的影響[J].黑龍江醫(yī)藥科學(xué)，2013，36(3):11～12.

1006－6233(2016)11－1891－02

A 【doi】10.3969/j.issn.1006－6233.2016.11.059

黑龍江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目，(編號(hào):D201225)；佳木斯大學(xué)科學(xué)技術(shù)重點(diǎn)項(xiàng)目，(編號(hào):12Z1201504)

江清林，E－mail:jqljms＠126.com