張 洋，張 艷，張 紅

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·論著·

· 中醫(yī)·中西醫(yī)結(jié)合研究·

不同中藥復(fù)方對心肌梗死后心力衰竭大鼠心?、?、Ⅲ型膠原的影響

張 洋，張 艷，張 紅

目的 觀察不同中藥復(fù)方對心肌梗死后心力衰竭大鼠心肌組織中Ⅰ、Ⅲ型膠原的影響。方法 2010年4月—2011年1月，以冠狀動脈結(jié)扎配合力竭式游泳的方法造成心肌梗死后心力衰竭大鼠模型，分為模型組、西藥組、益氣組、活血組、益氣活血組，另設(shè)空白對照組。每組10只大鼠。采用實(shí)時熒光定量PCR及免疫組化檢測心肌梗死后心力衰竭大鼠心肌組織中Ⅰ、Ⅲ型膠原的表達(dá)。結(jié)果 實(shí)時熒光定量PCR和免疫組化結(jié)果均顯示：與空白對照組比較,模型組大鼠Ⅰ、Ⅲ型膠原表達(dá)下降(P<0.05)；與模型組比較,各給藥組大鼠Ⅰ、Ⅲ型膠原表達(dá)升高(P<0.05)；西藥組、益氣活血組大鼠Ⅰ、Ⅲ型膠原表達(dá)高于益氣組及活血組(P<0.05)。結(jié)論 益氣活血中藥復(fù)方較益氣中藥復(fù)方、活血中藥復(fù)方更能提高心肌梗死后心力衰竭大鼠心肌組織中Ⅰ、Ⅲ型膠原的表達(dá)，可達(dá)到治療心力衰竭的作用。

益氣活血；心力衰竭 ；心肌梗死；膠原Ⅰ型；膠原Ⅲ型

張洋，張艷，張紅.不同中藥復(fù)方對心肌梗死后心力衰竭大鼠心?、?、Ⅲ型膠原的影響[J].中國全科醫(yī)學(xué)，2016，19(36)：4509-4514.[www.chinagp.net]

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心力衰竭是各種心血管疾病發(fā)展的終末階段，其發(fā)病率、致殘率及病死率均較高，心力衰竭已成為心血管疾病的主要死亡原因。心肌梗死后心室重構(gòu)是心力衰竭發(fā)生發(fā)展的重要病理生理基礎(chǔ)[1]。臨床觀察發(fā)現(xiàn)，益氣活血中藥能夠改善心力衰竭患者臨床癥狀、降低死亡率，并延緩心力衰竭進(jìn)程[2]。祖國醫(yī)學(xué)認(rèn)為，氣虛血瘀是心力衰竭發(fā)生、發(fā)展的重要機(jī)制，故益氣活血法為治療心力衰竭的有效治則。目前鮮見不同中藥復(fù)方對心肌梗死后心力衰竭影響的相關(guān)研究。本研究通過觀察不同中藥復(fù)方，即益氣中藥復(fù)方、活血中藥復(fù)方、益氣活血中藥復(fù)方對心肌梗死后心力衰竭大鼠Ⅰ、Ⅲ型膠原表達(dá)的影響，從中篩選出療效較好的中藥復(fù)方，探討其對心室重構(gòu)的影響，為中醫(yī)藥防治心力衰竭提供新策略。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 實(shí)驗(yàn)所需動物由遼寧長生生物技術(shù)有限公司提供〔SCXK(遼)2010-0001〕。選用12周齡普通級健康雄性SD大鼠100只，體質(zhì)量220～260 g。動物飼養(yǎng)環(huán)境為遼寧中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心。

本文創(chuàng)新點(diǎn)：

(1)方法創(chuàng)新：通過對大鼠冠狀動脈結(jié)扎及配合力竭式游泳的方法，成功制造了心肌梗死后心力衰竭大鼠模型，通過活血中藥復(fù)方、益氣中藥復(fù)方及益氣活血中藥復(fù)方進(jìn)行干預(yù)，從中篩選出療效突出的中藥復(fù)方。(2)思路創(chuàng)新：本研究融合了中醫(yī)辨證論治理論，進(jìn)一步證實(shí)了“益氣活血”治則在治療心力衰竭中的重要作用。

1.2 造模與分組 實(shí)驗(yàn)時間2010年4月—2011年1月。隨機(jī)選取10只未予任何處理的大鼠為空白對照組。90只大鼠經(jīng)1周適應(yīng)性喂養(yǎng)后采用2%戊巴比妥鈉溶液，按48 mg/kg劑量行腹腔注射麻醉。胸部備皮，將針形電極刺入大鼠四肢及胸壁皮下，連接超聲心電圖機(jī)，記錄心電圖(見圖1)。于左側(cè)第4肋間開胸，鈍性分離胸部肌肉，暴露肋骨，鈍性分離肋骨間肌肉組織，過程中注意保護(hù)肺臟，撥開胸腺，眼科鑷撕開心包膜，于左冠狀動脈前降支起點(diǎn)2 mm處用6-0號線結(jié)扎冠狀動脈前降支[3-4]。心臟表面給予利多卡因注射液0.1 ml以預(yù)防室性心律失常的發(fā)生[5]，重置心臟于胸腔，分層縫合胸壁。術(shù)后心電圖表現(xiàn)為ST段抬高或出現(xiàn)病理性Q波判定為發(fā)生心肌梗死(見圖2)。術(shù)后連續(xù)注射青霉素鈉3 d，以預(yù)防感染。常規(guī)喂養(yǎng)1周后將飼料減半，同時每日游泳至其力竭(把大鼠置于長2.0 m、寬1.5 m的水池中，水深約1.0 m，以大鼠頭部完全沉入水中，肢體無明顯擺動判斷為力竭)，1次/d，共4周[6-7]。再次行超聲心動圖檢測大鼠射血分?jǐn)?shù)(EF)(見圖3、4)，計(jì)算心臟指數(shù)(CI)；以EF≤60%或CI≤180 ml·min-1·kg-1作為心力衰竭成功造模的標(biāo)準(zhǔn)[8-9]。將造模成功的54只大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組、西藥組、益氣組、活血組及益氣活血組每組各10只大鼠，4只造模成功的大鼠退出本研究。

注：心率419次/min，最大值0.21 mV，最小值-0.06 mV，峰值0.28 mV

圖1 冠狀動脈結(jié)扎術(shù)前大鼠心電圖

Figure 1 The rat electrocardiogram before operation

注：心率392次/min，最大值0.24 mV，最小值-0.40 mV，峰值0.64 mV

圖2 冠狀動脈結(jié)扎術(shù)后大鼠心電圖

Figure 2 The rat electrocardiogram after operation

圖3 空白對照組大鼠超聲心動圖

圖4 術(shù)后行力竭式游泳4周大鼠超聲心動圖

Figure 4 Echocardiography of rat after operation and swimming exhaustion 4 weeks

1.3 藥物與給藥劑量 空白對照組與模型組蒸餾水灌胃1.5 ml/次，2次/d。西藥組藥物為賴諾普利片(10 mg/片)，產(chǎn)自信誼萬象藥業(yè)。益氣組藥物由黃芪、人參兩味中藥組成；活血組藥物由丹參、三七粉、益母草組成；益氣活血組藥物由黃芪、人參、丹參、三七粉、益母草組成；由天江藥業(yè)有限公司提供上述中藥復(fù)方制劑；處方中藥符合2010年版《中國藥典》相關(guān)中藥藥材質(zhì)量檢驗(yàn)規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)[10]。各給藥組大鼠按人鼠劑量換算，給藥劑量(g/kg)=人的劑量(g)×系數(shù)(0.018)/所求動物體質(zhì)量(kg)[11]。西藥組，1.5 mg生藥·kg-1·d-1，2次/d；益氣組、活血組、益氣活血組，9.2 g生藥·kg-1·d-1，2次/d[12-13]。6組均灌胃6周。

1.4 檢測方法 灌胃6周后處死全部大鼠，取其心肌組織；每只大鼠心臟按標(biāo)準(zhǔn)處理后分成2份，每份80 mg心肌組織。第1份用于實(shí)時熒光定量PCR檢測Ⅰ、Ⅲ型膠原的表達(dá)，采用SABC法進(jìn)行染色(嚴(yán)格按試劑盒說明步驟操作)，第2份用于免疫組化檢測Ⅰ、Ⅲ型膠原的表達(dá)(采用Image-Pro Plus 4.0圖像分析軟件進(jìn)行結(jié)果分析)。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)時熒光定量PCR和免疫組化檢測 各組大鼠心肌Ⅰ、Ⅲ型膠原實(shí)時熒光定量PCR溶解曲線及擴(kuò)增曲線見圖5～8。各組Ⅰ、Ⅲ型膠原的溶解曲線均有較尖銳的峰，說明擴(kuò)增產(chǎn)物穩(wěn)定，數(shù)據(jù)可以采用。

實(shí)時熒光定量PCR和免疫組化結(jié)果均顯示：與空白對照組比較,模型組大鼠Ⅰ、Ⅲ型膠原表達(dá)下降(P<0.05)；與模型組比較,各給藥組大鼠Ⅰ、Ⅲ型膠原表達(dá)升高(P<0.05)；西藥組、益氣活血組大鼠Ⅰ、Ⅲ型膠原表達(dá)高于益氣組及活血組(P<0.05，見表1、2)。

圖5 Ⅰ型膠原溶解曲線

圖6 Ⅰ型膠原擴(kuò)增曲線

圖7 Ⅲ型膠原溶解曲線

圖8 Ⅲ型膠原擴(kuò)增曲線

Table 1 Expression results ofⅠ,Ⅲ type collagen detected by real time fluoresconce guantitative PCR in each group rats

組別只數(shù)Ⅰ型膠原Ⅲ型膠原空白對照組10100±000100±000模型組10053±003a061±002a西藥組10096±003b098±002b益氣組10078±003bc083±002bc活血組10079±002bc085±002bc益氣活血組10095±003bde097±002bdeF值23722253P值<005<005

注：與空白對照組比較，aP<0.05；與模型組比較,bP<0.05；與西藥組比較，cP<0.05；與益氣組比較，dP<0.05；與活血組比較，eP<0.05

2.2 心肌組織免疫組化法染色 Ⅰ、Ⅲ型膠原在心肌纖維橫紋中呈棕色顆粒為陽性?？瞻讓φ战M心肌纖維橫紋中Ⅰ、Ⅲ型膠原的分布均勻、清晰。模型組Ⅰ、Ⅲ型膠原的表達(dá)較空白對照組明顯減少；西藥組、活血組、益氣組及益氣活血組Ⅰ、Ⅲ型膠原表達(dá)較模型組明顯增多；西藥組、益氣活血組Ⅰ、Ⅲ型膠原表達(dá)較益氣組、活血組增多(見圖9、10，本文圖9、10彩圖見本刊官網(wǎng)www.chinagp.net電子期刊相應(yīng)文章附件)。

Table2ExpressionresultsofⅠ,Ⅲtypecollagenimmunohistochemistryineachgrouprats

組別只數(shù)Ⅰ型膠原Ⅲ型膠原 空白對照組10486±50120±20模型組1047±7a60±19a西藥組10461±49b105±20b益氣組10339±37bc86±19bc活血組10341±38bc88±19bc益氣活血組10458±50bde102±21bdeF值29761524P值<005<005

注：與空白對照組比較，aP<0.05；與模型組比較,bP<0.05；與西藥組比較，cP<0.05；與益氣組比較，dP<0.05；與活血組比較，eP<0.05

3 討論

唐·孫思邈在《備急千金要方·心臟門》中首次提出“心衰”這一病名，“心衰則伏……”。宋·趙佶在《圣濟(jì)總錄·心臟門》中提出：“心衰則健忘，不足則胸腹脅下與腰背引痛……”?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)的心力衰竭與中醫(yī)文獻(xiàn)記載的“心衰”尚存在著一定差異，屬于中醫(yī)學(xué)“胸痹”“水腫”“喘證”“心悸”等范疇[14]。其病機(jī)之根為陽微陰弦本虛標(biāo)實(shí)之證候，本虛以氣虛為主，標(biāo)實(shí)則以血瘀為重。因氣虛血瘀之證候貫穿于心力衰竭發(fā)展始末，故益氣活血為心力衰竭基本治則[15]。

圖9 各組大鼠心肌組織Ⅰ型膠原免疫組化染色 (SABC法，×40)

圖10 各組大鼠心肌組織Ⅲ型膠原免疫組化染色 (SABC法，×40)

心室重構(gòu)引起的心肌結(jié)構(gòu)和功能的改變是心力衰竭發(fā)生發(fā)展的核心機(jī)制。心肌梗死所導(dǎo)致心肌膠原代謝異常的心室重構(gòu)是心肌梗死后心力衰竭的病理生理基礎(chǔ)。生理情況下,Ⅰ、Ⅲ型膠原構(gòu)成心肌膠原網(wǎng)絡(luò)支架(Ⅰ型膠原約占心肌膠原總含量80%，Ⅲ型膠原約占11%),在保護(hù)心肌細(xì)胞、維持心臟構(gòu)型和僵硬度等方面起著十分重要的作用[16]。心肌膠原的過度沉積可促使心肌膠原的分布及含量發(fā)生改變，即各型膠原比例失調(diào)(主要為Ⅰ、Ⅲ型膠原比例失衡)，心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)排列紊亂，病理性心肌重構(gòu)使心功能進(jìn)行性惡化，最終導(dǎo)致心力衰竭[17]。心肌膠原含量減少也可引起心肌細(xì)胞退化，細(xì)胞排列紊亂，甚至引起心肌肌纖維斷裂；表現(xiàn)為心肌彈性、抗?fàn)坷约白笫沂鎻垳p退，從而導(dǎo)致心臟每搏輸出量及EF下降，進(jìn)而加快心室重構(gòu)和心力衰竭進(jìn)程[18]。

本實(shí)驗(yàn)通過對大鼠冠狀動脈結(jié)扎及配合力竭式游泳的方法導(dǎo)致心脈氣虛血瘀，成功營造了大鼠心肌梗死后心力衰竭(胸痹)模型，予益氣活血中藥進(jìn)行干預(yù)。采用實(shí)時熒光定量PCR及免疫組化法檢測大鼠心肌組織中Ⅰ、Ⅲ型膠原的表達(dá)。本研究發(fā)現(xiàn)，與模型組比較，西藥組、益氣組、活血組、益氣活血組大鼠心肌組織Ⅰ、Ⅲ型膠原表達(dá)明顯升高；其中益氣活血組與西藥組效果相當(dāng)，二者效果優(yōu)于益氣組及活血組。本研究提示3種中藥復(fù)方均可改善心肌組織Ⅰ、Ⅲ型膠原表達(dá)，效果以益氣活血組最為明顯。以黃芪、人參、丹參、三七粉、益母草為主要功效的益氣活血中藥中，黃芪、人參益氣通陽，丹參、三七粉、益母草活血化瘀通脈；諸藥合用，可達(dá)益氣活血，化瘀通脈之功效。本研究表明，益氣活血中藥配伍后在治療心力衰竭過程中起到了促進(jìn)協(xié)同作用，為“氣旺以促血行”的配伍理論提供了科學(xué)客觀的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，佐證了“益氣活血”治則在治療心力衰竭中的重要意義。其作用機(jī)制可能是通過調(diào)節(jié)心肌膠原的分布及代謝，修復(fù)受損心肌組織，增強(qiáng)心肌的抗?fàn)坷?、彈性，從而提高心肌整體收縮力，抑制心室重構(gòu)，達(dá)到治療心力衰竭的作用。

作者貢獻(xiàn)：張洋進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與實(shí)施、撰寫論文并對文章負(fù)責(zé)；張艷進(jìn)質(zhì)量控制及校審；張紅進(jìn)行評估、資料收集整理。

本文無利益沖突。

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(本文編輯：趙躍翠)

Effect of Different Chinese Herbal Compound on Type Ⅰ,Ⅲ Collagen in Myocardium of Rats with Heart Failure Following Myocardial Infarction

ZHANG Yang，ZHANG Yan，ZHANG Hong.

Liaoning University of Traditional Chinese Medicine,Shenyang 110032，China

ZHANG Yan，the Affiliated Hospital of Liaoning University of Traditional Chinese Medicine,Shenyang 110032,China;E-mail:95194031@qq.com

Objective To observe the effect of different Chinese herbal compound on type Ⅰ,Ⅲ collagen in myocardium of rats with heart failure following myocardial infarction.Methods From April 2010 to January 2011,the rat model of heart failure following myocardial infarction were established by coronary artery ligation method and exhaustive swimming.The experimental rats were divided into model group,western medicine group,Reinforcing qi group,Activating blood group,Reinforcing qi and activating blood group,and control group.10 rats in each group.Real time fluorescence quantitative PCR and immunohistochemistry were used to detect the expression of type Ⅰ,Ⅲ collagen in the myocardium of rats with heart failure following myocardial infarction.Results Compared with control group,the expression of type Ⅰ,Ⅲ collagen in model group detected by PCR and immunohistochemistry significantly decreased (P<0.05).Compared with model group,the expression of type Ⅰ,Ⅲ collagen in each treatment groups detected by PCR and immunohistochemistry significantly increased (P<0.05).The expression of type Ⅰ,Ⅲ collagen in western medicine group and Reinforcing qi and Activating blood group detected by PCR and immunohistochemistry were significantly higher than Reinforcing qi group and Activating blood group (P<0.05).Conclusion Reinforcing qi and activating blood Chinese herbal compound can improve the expression of type Ⅰ,Ⅲ collagen in myocardium of rats with heart failure following myocardial infarction,thus achieve the role of treatment of heart failure.

Reinforcing qi activat blood;Heart failure；Myocardial infarction；Collagen type I；Collagen type Ⅲ

110032 遼寧省沈陽市，遼寧中醫(yī)藥大學(xué)(張洋)；遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院(張艷)；大連醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院中醫(yī)理療科(張紅)

張艷，110032遼寧省沈陽市,遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院；E-mail:95194031@qq.com

R 541.6

A

10.3969/j.issn.1007-9572.2016.36.021

2016-06-20；

2016-11-05)