鐘芳芳 吳承龍 孫新芳 王趙偉

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補(bǔ)陽還五湯和依達(dá)拉奉聯(lián)用對(duì)小鼠急性腦缺血損傷后腦保護(hù)機(jī)制的研究

鐘芳芳 吳承龍 孫新芳 王趙偉

目的 探討補(bǔ)陽還五湯和依達(dá)拉奉聯(lián)用對(duì)急性腦缺血損傷后神經(jīng)細(xì)胞凋亡及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響，探討其可能的腦保護(hù)機(jī)制。方法 將60只小鼠隨機(jī)分假手術(shù)組、模型組、補(bǔ)陽還五湯組、依達(dá)拉奉組以及補(bǔ)陽還五湯+依達(dá)拉奉組，每組12只。采用改良線栓法制作小鼠大腦中動(dòng)脈缺血再灌注模型，給予補(bǔ)陽還五湯及依達(dá)拉奉藥物干預(yù)。分別于再灌注后1 d和7 d，采用TUNEL法觀察小鼠腦皮質(zhì)缺血區(qū)神經(jīng)細(xì)胞凋亡率，采用免疫組化方法觀察小鼠腦皮質(zhì)缺血區(qū)B淋巴細(xì)胞瘤2基因(bcl-2)、bcl-2相關(guān)X蛋白(bax)和半胱氨酸蛋白酶3(caspase-3)表達(dá)的陽性細(xì)胞數(shù)。結(jié)果 與假手術(shù)組比較，模型組小鼠腦皮質(zhì)缺血區(qū)凋亡指數(shù)升高 (P<0.01)，且bcl-2、bax和caspase-3表達(dá)的陽性細(xì)胞亦均升高(P<0.01)；經(jīng)補(bǔ)陽還五湯和(或)依達(dá)拉奉干預(yù)后，各藥物組小鼠腦組織的凋亡指數(shù)及bax和caspase-3陽性細(xì)胞均較模型組下降(P<0.01)，而腦組織bcl-2陽性細(xì)胞均較模型組增加(P<0.01)，且補(bǔ)陽還五湯+依達(dá)拉奉聯(lián)合用藥組較單一用藥組改變明顯(P<0.05)。 結(jié)論 補(bǔ)陽還五湯與依達(dá)拉奉聯(lián)用能抑制腦缺血再灌注損傷后腦細(xì)胞中促凋亡蛋白bax、caspase-3的表達(dá)；促進(jìn)具有神經(jīng)元保護(hù)作用的bcl-2蛋白的表達(dá)，從而抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡，協(xié)同發(fā)揮腦保護(hù)作用。

補(bǔ)陽還五湯；依達(dá)拉奉；腦缺血再灌注；細(xì)胞凋亡；caspase-3；bcl-2；bax

腦卒中是危害人類健康的常見病，缺血性腦卒中占腦卒中發(fā)病總數(shù)的80%以上，其發(fā)病機(jī)制與細(xì)胞凋亡有著密切關(guān)系，而減輕腦缺血半暗帶區(qū)的神經(jīng)元細(xì)胞凋亡則是治療的關(guān)鍵[1]。本文作者前期研究結(jié)果證實(shí)補(bǔ)陽還五湯(BYHWD)聯(lián)合依達(dá)拉奉(ED)對(duì)小鼠急性腦缺血再灌注損傷具有協(xié)同保護(hù)作用[2]，本研究進(jìn)一步探討兩藥聯(lián)用對(duì)腦缺血再灌注損傷后神經(jīng)細(xì)胞的凋亡及凋亡相關(guān)蛋白半胱氨酸蛋白酶3(caspase-3)、B淋巴細(xì)胞瘤2基因(bcl-2)和bcl-2相關(guān)X蛋白(bax)表達(dá)的影響，以研究其協(xié)同神經(jīng)保護(hù)作用的機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：選擇9月齡左右的雄性C57BL/6小鼠60只，體重35～40 g，由上海西普爾必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，合格證號(hào)：scxk(滬)2008-0016。實(shí)驗(yàn)前先飼養(yǎng)觀察3 d，然后隨機(jī)分成假手術(shù)組、大腦中動(dòng)脈缺血再灌注(I/R)模型組、補(bǔ)陽還五湯(BYHWD)組、依達(dá)拉奉(ED)組以及BYHWD+ED組，每組12只。各組再隨機(jī)分為術(shù)后1 d 和7 d 2個(gè)亞組，每組6只。

1.1.2 主要藥品及試劑：ED注射液(南京先聲東元制藥有限公司)；BYHWD(紹興市人民醫(yī)院制劑室提供，由黃芪120 g、當(dāng)歸6 g、川芎3 g、地龍3 g、赤芍5 g、紅花3 g和桃仁3 g組成，水煎、濃縮后生藥含量為2.0 g/mL)；氯化三苯基四氮唑(TTC，購自中國醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司)；TUNEL凋亡試劑盒(瑞士Roche公司提供，批號(hào)11684817910)； bcl-2(批號(hào)20070223)、bax(批號(hào)20070223)、caspase-3(批號(hào)20070227)免疫組化染色試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 造模及藥物干預(yù)：參照改良的Longa-Zea線栓法[3]制作小鼠大腦中動(dòng)脈缺血再灌注模型，缺血90 min后拔出線栓再灌注。假手術(shù)組僅分離右側(cè)頸總動(dòng)脈并離斷右頸外動(dòng)脈，不予栓塞。術(shù)后2 h行神經(jīng)功能評(píng)分，小鼠出現(xiàn)右側(cè)Horner征和左側(cè)以上肢為重的偏癱作為動(dòng)物模型成功的判定標(biāo)準(zhǔn)，不符合標(biāo)準(zhǔn)的動(dòng)物予以剔除，并隨機(jī)補(bǔ)充。于術(shù)后2 h起，BYHWD組按體重10 mL/kg給予BYHWD藥液灌胃，ED組按體重3 mg/kg給予ED尾靜脈注射，BYHWD+ED組分別等劑量給予BYHWD灌胃和ED尾靜脈注射，模型組和假手術(shù)組均予等量生理鹽水灌胃及尾靜脈注射，1次/d，連續(xù)7 d。

1.2.2 腦組織標(biāo)本制備：于腦缺血再灌注1 d和7 d，以10%(體積分?jǐn)?shù))水合氯醛按體重600 mg/kg深度麻醉小鼠，迅速打開胸腔，暴露心臟，剪開右心房，于心尖部剪開左心室，插管至主動(dòng)脈，快速注入150 mL甲醛灌注固定，斷頭取腦，沿視交叉后緣做冠狀切片，常規(guī)石蠟包埋，行5 μm連續(xù)切片用于凋亡與免疫組化檢測。

1.2.3 TUNEL法檢測神經(jīng)元細(xì)胞凋亡：按試劑盒說明書進(jìn)行操作。(1)切片常規(guī)脫蠟至水，滴加蛋白酶K室溫消化20 min；(2)微波修復(fù)抗原5 min后自然冷卻；(3)滴加TUNEL反應(yīng)液，37 ℃孵育1 h；(4)滴加辣根過氧化物酶標(biāo)抗熒光素抗體工作液，37 ℃孵育30 min；(5)用DAB顯色劑呈色；(6)常規(guī)脫水、透明、封片。在光鏡下觀察凋亡細(xì)胞，細(xì)胞核中有棕黃色顆粒者為陽性細(xì)胞。按下列公式計(jì)算凋亡指數(shù)(AI)：AI=凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.2.4 免疫組化檢測：切片常規(guī)脫蠟至水，滴加3%(體積分?jǐn)?shù))H2O2孵育10 min；微波修復(fù)抗原10 min自然冷卻至室溫；滴加10%(質(zhì)量濃度)正常山羊血清，室溫封閉30 min；分別滴加兔抗bcl-2、兔抗bax及兔抗active caspase-3抗血清，4℃孵育24 h；滴加二抗工作液(山羊抗兔)室溫反應(yīng)15 min；滴加辣根酶標(biāo)記卵白素工作液，室溫反應(yīng)15 min；DAB顯色劑呈色；梯度脫水、中型樹脂封片。每只小鼠各取兩張切片，在光鏡下于梗死灶周邊區(qū)隨機(jī)選擇5個(gè)視野，分別計(jì)算bcl-2、bax、caspase-3陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)以及AI，取平均值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組神經(jīng)細(xì)胞凋亡比較 腦缺血再灌注后，光鏡下凋亡細(xì)胞核呈棕黃色，細(xì)胞體積縮小，染色質(zhì)固縮呈圓形或卵圓形。I/R模型組陽性細(xì)胞數(shù)最多，BYHWD+ED組陽性細(xì)胞數(shù)目明顯減少(圖1)。與假手術(shù)組比較，余各組神經(jīng)細(xì)胞AI均升高(P<0.01)；與I/R模型組比較，BYHWD組、ED組以及BYHWD+ED組神經(jīng)細(xì)胞AI均降低，且BYHWD+ED組低于BYHWD組和ED組(P<0.05，P<0.01)。與缺血再灌注1 d相比，除假手術(shù)組外，余各組小鼠缺血再灌注7 d時(shí)神經(jīng)細(xì)胞AI均較1 d時(shí)降低(P<0.01)。結(jié)果見表1。

2.2 各組小鼠腦組織bcl-2、bax和caspase-3表達(dá) 光鏡下小鼠腦組織bcl-2、bax及caspase-3表達(dá)陽性細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有棕黃色顆粒(圖2-3)。與缺血再灌注1 d相比，7 d時(shí)模型組和各用藥組的腦組織bcl-2、bax和caspase-3陽性細(xì)胞有減少(P<0.05)。不同時(shí)間點(diǎn)，與I/R模型組比較，BYHWD組、ED組以及BYHWD+ED組腦組織bcl-2陽性細(xì)胞均明顯增加(P<0.01)，而bax、caspase-3陽性細(xì)胞下降(P<0.01)，且BYHWD+ED組較BYHWD組和ED組改變明顯(P<0.05)，BYH-WD組和ED組間比較差異則無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)果見圖2-3和表2-4。

I/R：腦缺血再灌注，ED：依達(dá)拉奉，BYHWD：補(bǔ)陽還五湯，表1～4、圖2～4同；A：假手術(shù)組；B：I/R模型組；C：ED組；D：BYHWD組；E：ED+BYHWD組 圖1 各組小鼠腦缺血再灌注后7 d時(shí)腦皮質(zhì)缺血區(qū)TUNEL染色表現(xiàn)

組別1d7dF值P值BYHWD+ED組17.87±0.43*#△12.59±1.07*#△75.47<0.01BYHWTD組24.16±0.74*#16.01±0.87*#83.92<0.01ED組24.04±0.53*#16.40±1.04*#30.84<0.01I/R模型組37.27±2.36*20.49±2.78*15.25<0.01假手術(shù)組1.17±0.380.68±1.270.49>0.05F值588.14106.72P值<0.01<0.01

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.01；與I/R組比較，#P<0.01；與ED組和BYHWD組比較，△P<0.05

圖2 各組小鼠腦缺血再灌注后7 d時(shí)腦皮質(zhì)缺血區(qū)bcl-2和bax陽性細(xì)胞的表達(dá)(免疫組化)

A：假手術(shù)組；B：I/R模型組；C：ED組；D：BYHWD組；E：ED+BYHWD組 圖3 各組小鼠腦缺血再灌注后7 d時(shí)腦皮質(zhì)缺血區(qū)caspase-3陽性細(xì)胞的表達(dá)(免疫組化)

組別1d7dF值P值BYHWD+ED組33.27±2.13*#△23.64±2.13*#△7.36<0.05BYHWTD組27.29±2.79*#16.91±2.02*#6.41<0.05ED組27.04±2.33*#16.07±2.65*#6.95<0.05I/R模型組21.71±1.20*10.43±2.04*16.35<0.01假手術(shù)組3.11±0.132.92±1.070.02>0.05F值160.7966.33P值<0.01<0.01

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.01；與I/R模型組比較，#P<0.01；與ED組和BYHWD組比較，△P<0.05

表3 各組小鼠腦缺血再灌注損傷后不同時(shí)間點(diǎn)bax表達(dá)比較

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.01；與I/R模型組比較，#P<0.01；與ED組和BYHWD組比較，△P<0.05

表4 各組小鼠腦缺血再灌注損傷后不同時(shí)間點(diǎn)caspase-3表達(dá)比較

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.01；與I/R模型組比較，#P<0.01；與ED組和BYHWD組比較，△P<0.05

3 討論

腦缺血再灌注后神經(jīng)細(xì)胞損傷主要包括壞死和凋亡。凋亡是腦缺血再灌注損傷引起的神經(jīng)細(xì)胞延遲性死亡[4]。腦缺血發(fā)生時(shí)，缺血半暗帶區(qū)產(chǎn)生大量自由基，出現(xiàn)線粒體損傷、鈣超載等反應(yīng)，這些因素均可觸發(fā)細(xì)胞凋亡[5]。因而在腦缺血再灌注損傷后，搶救半暗帶區(qū)神經(jīng)細(xì)胞，減少細(xì)胞凋亡發(fā)生，能減輕腦缺血再灌注損傷的程度和范圍[6]。本實(shí)驗(yàn)采用BYHWTD與ED聯(lián)合干預(yù)小鼠腦缺血再灌注模型，通過TUNEL標(biāo)記發(fā)現(xiàn)，腦缺血再灌注損傷后腦組織凋亡細(xì)胞數(shù)明顯增多，經(jīng)藥物治療后凋亡細(xì)胞數(shù)明顯減少，且BYHWTD+ED組減少最明顯，提示腦缺血再灌注損傷可引起神經(jīng)細(xì)胞凋亡發(fā)生，BYHWD和ED對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的凋亡具有抑制作用，以兩者聯(lián)用的效果尤為顯著。

腦缺血后細(xì)胞凋亡主要發(fā)生在缺血半暗帶區(qū)，是一種涉及多因素調(diào)控的復(fù)雜的主動(dòng)死亡過程，其中主要包括caspase-3、bcl-2/bax、核因子κB(NF-κB)等因子的調(diào)控[7]。bcl-2/bax主要通過調(diào)節(jié)線粒體膜的通透性來調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡，二者通過在線粒體外膜形成離子通道，抗凋亡蛋白bcl-2阻礙細(xì)胞色素C的釋放，抑制凋亡；而bax等則促進(jìn)凋亡。bcl-2與bax相互作用共同參與程序性細(xì)胞凋亡過程[8-9]。另外，bcl-2家族基因與caspase家族共同參與了細(xì)胞凋亡中由線粒體介導(dǎo)的內(nèi)源性途徑。研究表明，bax可從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到線粒體，增加線粒體膜的通透性，釋放細(xì)胞色素C入細(xì)胞漿，激活caspase-3，引起細(xì)胞凋亡[10-11]。caspase-3是多種凋亡途徑最主要的下游效應(yīng)因子之一，是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵酶，在各種因素啟動(dòng)的凋亡程序中起最后樞紐作用，直接參與細(xì)胞凋亡的發(fā)生，導(dǎo)致腦缺血再灌注損傷[12]。在缺血性神經(jīng)損傷過程中，抑制caspase-3活性可產(chǎn)生明顯的神經(jīng)保護(hù)作用[13]。

BYHWD出自清代王清任《醫(yī)林改錯(cuò)》，為補(bǔ)氣活血通絡(luò)的方藥，能多環(huán)節(jié)、多靶點(diǎn)發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用；ED具有抗氧自由基作用。本研究采用中西藥物聯(lián)用干預(yù)小鼠腦缺血模型，結(jié)果顯示小鼠腦缺血再灌注損傷后缺血半暗帶區(qū)細(xì)胞bcl-2、bax和caspase-3表達(dá)顯著增多，表明bcl-2、bax和caspase-3的表達(dá)參與了腦缺血區(qū)神經(jīng)細(xì)胞的損傷過程，小鼠腦缺血再灌注后啟動(dòng)了凋亡機(jī)制，這與國內(nèi)外研究相符；另外，BYHWD+ED組小鼠腦缺血區(qū)神經(jīng)細(xì)胞bcl-2陽性細(xì)胞數(shù)明顯增加，而bax與caspase-3陽性細(xì)胞數(shù)明顯降低，提示BYHWD和ED可協(xié)同抑制腦缺血再灌注損傷神經(jīng)元凋亡。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示，BYHWD和ED聯(lián)用可通過促進(jìn)重要的凋亡抑制基因bcl-2表達(dá)，抑制凋亡誘導(dǎo)基因bax及caspase-3的表達(dá)，從而抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡，加速神經(jīng)功能的恢復(fù)，協(xié)同發(fā)揮腦保護(hù)作用。本研究從分子水平闡明了BYHWD聯(lián)合ED治療急性缺血性腦血管病的機(jī)制，為中西藥結(jié)合治療缺血性腦卒中提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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(本文編輯：時(shí)秋寬)

Neuroprotective effects of Buyang Huanwu Decoction combined with edaravone in the brain of mice with acute cerebral ischemia injury

ZHONGFangfang*，WUChenglong，SUNXinfang，WANGZhaowei.*

DepartmentofNeurology，ShaoxingPeople′sHospital，ShaoxingZhejiang312000，China

ZHONG Fangfang，Email：13867536519@126.com

Objective To study the effects of Buyang Huanwu Decoction(BYHWD) combined with edaravone(ED) on the apoptosis of neuron and expression of apoptosis related protein following cerebral ischemia-reperfusion(I/R) and further to discuss the mechanism of neuroprotection. Methods Sixty mice were randomly divided into the sham group， the I/R group， the BYHWD group， the ED group and the BYHWD+ED group， 12 mice in each group. Each group was further randomly divided into 1 d and 7 d groups. The middle cerebral artery occlusion/reperfusion model was established by the improved intraluminal filament technique in mice. BYHWD and ED interventions were applied. Immunohistochemistry method was used to analyze the expression of bcl-2， bax and caspase-3 positive cells， and TUNEL method was used to evaluate the neuronal apoptosis. Results Compared with the sham group， the apoptosis index of neuron increased in the I/R group (P<0.01)， the bcl-2， bax and caspase-3 positive cells also increased(P<0.01). After intervention in the drug groups，the apoptosis index declined(P<0.01)，the bcl-2 positive cells increased(P<0.01)，but the bax and caspase-3 positive cells decreased(P<0.01). Above indexes of the BYHWD+ED group were better than those of the single drug group(P<0.05). Conclusions The combination of BYHWD and ED can decrease the expression of bax， caspase-3 protein，and increase bcl-2 expression to inhibit the neuronal apoptosis and accelerate the recovery of neural function. It suggests that the two agents play synergistic roles in protecting the brain from cerebral ischemic reperfusion injury.

Buyang Huanwu Decoction；edaravone；cerebral ischemia reperfusion；cellular apoptosis；caspase-3；bcl-2；bax

10.3969/j.issn.1006-2963.2016.04.009

浙江省紹興市公益性技術(shù)應(yīng)用研究計(jì)劃項(xiàng)目(2013B70076)

312000 浙江省紹興市人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科

鐘芳芳，Email：13867536519@126.com

R743.3

A

1006-2963(2016)04-0267-05

2016-01-14)