黃廣海 何云凌 邸瑤 趙彤 任長虹 范明 朱玲玲 吳麗穎 吳奎武

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BNIP3表達變化與腦缺血損傷關(guān)系的研究

黃廣海 何云凌 邸瑤 趙彤 任長虹 范明 朱玲玲 吳麗穎 吳奎武

目的 觀察大鼠永久性大腦中動脈閉塞(permanent middle cerebral artery occlusion，pMCAO)不同時間點腦損傷情況、Bcl-2/腺病毒E1B19kD相互作用蛋白3(Bcl-2/adenovirus E1B-19 kDa-interacting protein 3，BNIP3)及線粒體自噬相關(guān)蛋白的表達，探討B(tài)NIP3與腦缺血損傷程度的關(guān)系。方法 將健康雄性SD大鼠隨機分為假手術(shù)組(sham組，即pMCAO 0 h組)、pMCAO 3 h組、9 h組和 24 h組，每組12只。分別采用TTC染色檢測大鼠腦梗死體積、透射電鏡觀察線粒體形態(tài)變化、Western blot檢測BNIP3及相關(guān)蛋白表達。結(jié)果 (1)各組大鼠腦梗死體積變化：sham組TTC染色顯示無梗死發(fā)生，其余3組均存在腦梗死區(qū)。pMCAO 3 h、9 h、24 h組矯正腦梗死體積〔分別為(12.12±2.15)%、(37.00±4.24)%和(51.82±4.39)%〕均明顯高于sham組(均P<0.01)，且隨缺血時間延長而矯正腦梗死體積增加(四組間兩兩比較，均P<0.01)。(2)各組大鼠腦組織中線粒體形態(tài)變化：sham組透射電鏡可以觀察到完整的雙層線粒體膜結(jié)構(gòu)；pMCAO 3 h和9 h組觀察到典型的線粒體自噬現(xiàn)象：具有雙層膜結(jié)構(gòu)的線粒體自噬溶酶體；pMCAO 24 h組線粒體受損嚴重，嵴消失，膜破損，線粒體腫脹加劇，未觀察到線粒體自噬現(xiàn)象。(3)各組BNIP3和線粒體自噬相關(guān)蛋白表達：與sham組比較，pMCAO 3 h和9 h組BNIP3和自噬誘導(dǎo)分子Beclin-1表達增加，自噬標記分子LC3-Ⅱ/Ⅰ比值升高，接頭蛋白P62和線粒體標記分子熱休克蛋白60(heat shockprotein-60，HSP60)、線粒體外膜易位酶(translocase of outer mitochondrial membrane 20，TOM20)表達下降(均P<0.01)；與pMCAO 9 h組比較，pMCAO 24 h組BNIP3和Beclin-1表達下降，LC3-Ⅱ/Ⅰ比值降低，P62和TOM20、HSP60表達增加(均P<0.01)。結(jié)論 BNIP3很可能在腦缺血早期通過促進線粒體自噬來發(fā)揮對腦缺血損傷的保護作用。

腦缺血；BNIP3；線粒體自噬

腦卒中作為全球性的健康問題，已經(jīng)成為威脅人類健康和生命的第四位殺手。在我國，腦卒中與惡性腫瘤、心血管病構(gòu)成三大死亡原因[1]。缺血性腦卒中是最常見的腦卒中類型，約占全部腦卒中的88%，該病發(fā)病急促，死亡率、致殘率高[2]。缺血性腦卒中造成腦損傷的機制十分復(fù)雜，目前尚未被完全闡述清楚。

B淋巴細胞瘤-2基因(Bcl-2)/腺病毒E1B19kD相互作用蛋白3(BNIP3)是一種Bcl-2家族蛋白，也是低氧誘導(dǎo)因子(hypoxia inducible factor 1-alpha，HIF-1α)的靶基因，在低氧或缺血條件下在線粒體外膜處高表達[3-4]。近年來的研究顯示，BNIP3能通過介導(dǎo)線粒體自噬在低氧應(yīng)激中對細胞發(fā)揮重要的保護作用[5]。線粒體自噬是指機體在發(fā)生營養(yǎng)匱乏或缺血缺氧等應(yīng)激時，細胞選擇性地清除功能異常的線粒體的現(xiàn)象[6]，因此，線粒體自噬被認為是機體適應(yīng)不良環(huán)境的一種保護機制[7]。本研究采用大鼠永久性大腦中動脈閉塞(permanent middle cerebral artery occlusion，pMCAO)模型，觀察MCAO處理后不同時間BNIP3及線粒體自噬相關(guān)蛋白表達變化，分析腦缺血損傷程度與BNIP3表達水平之間的關(guān)系，探討B(tài)NIP3在缺血性腦卒中發(fā)病過程中的可能作用。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物和分組：選擇60只SPF級健康雄性SD大鼠，體質(zhì)量(300±20)g，購自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心，人工控制實驗室光照周期(日夜時間均為12 h)，環(huán)境溫度為(25±2)℃，濕度為(50±5)%，大鼠適應(yīng)實驗室環(huán)境1周。

1.1.2 主要儀器和試劑：體視顯微鏡(OLYMPUS公司，日本)，手術(shù)器械整套(上海艾研生物科技有限公司，中國)，透射電子顯微鏡(HITACHI公司，日本)，2，3，5-氯化三苯四唑(2，3，5-Trephenyltetrazolium Chloride，TTC)、LC3抗體、β-actin抗體(Sigma公司，美國)，ECL發(fā)光液(Bio-Rad公司，美國)，BNIP3抗體、P62抗體(Abcam公司，英國)，Beclin-1抗體(BD公司，美國)，HSP60抗體、TOM20抗體(Santa Cruz公司，美國)，辣根過氧化酶標記的山羊抗兔、山羊抗鼠IgG(MBL公司，日本)。

1.2 方法

1.2.1 pMCAO大鼠模型的建立：隨機選取12只作為假手術(shù)組(sham組，即pMCAO 0 h組)，不造模，其余大鼠以改良的Zea-Longa法[8]造模。大鼠稱重后以1%(質(zhì)量濃度)戊巴比妥鈉按體質(zhì)量0.5 mL/100 g左下腹腹腔注射，頸前正中切口，游離出頸總動脈(CCA)、頸內(nèi)動脈(ICA)和頸外動脈(ECA)。將線栓由頸外動脈殘端插入頸內(nèi)動脈，線栓至頸內(nèi)動脈和頸外動脈分叉處大約(1.8～2.0 cm)時可感覺到有輕微的抵觸感，提示線栓已到指定位置。檢查大鼠無明顯活動出血后，縫合切口。手術(shù)操作后將大鼠放置于保溫毯上，溫度設(shè)置為37℃，監(jiān)測大鼠心率和呼吸，待其麻醉蘇醒后轉(zhuǎn)移至干凈衛(wèi)生飼養(yǎng)籠中。大鼠麻醉蘇醒后參考Zea-Longa的5分制評分標準進行神經(jīng)行為學(xué)評分[8]，保留評分1～3分的大鼠。選擇Zea-Longa神經(jīng)行為學(xué)評分相近的大鼠36只，將大鼠隨機分為pMCAO 3 h組、9 h組和24 h組，每組12只，其中6只用于TTC染色檢測腦梗死體積，6只用于透射電鏡觀察和Western blot分析相關(guān)蛋白表達。sham組大鼠相應(yīng)皮膚切開分離血管后不插線栓即縫合，其余步驟相同。

1.2.2 TTC染色：將sham組、pMCAO 3 h、9 h和24 h組每組12只大鼠分別于手術(shù)操作后0 h、3 h、9 h、24 h頸椎脫臼處死，開顱取腦，腦組織腹面向上放入腦模，自視交叉始切，每只鼠共切取6片腦組織，片厚約2 mm。將切片放入1%(質(zhì)量濃度)TTC溶液中，室溫避光顯色20 min，正常腦組織呈紅色，腦梗死區(qū)組織呈白色。選擇存在白色梗死灶者的切片，放入4%(質(zhì)量濃度)多聚甲醛溶液中固定2 h，固定后用PBS清洗切片，將切片按順序排列，拍照后用Image J軟件計算矯正腦梗死體積(%)。矯正腦梗死體積(%)=〔健側(cè)大腦半球體積-(梗死側(cè)大腦半球體積-梗死部分體積)〕/健側(cè)大腦半球體積×100%[9]。

1.2.3 透射電鏡觀察腦組織中線粒體形態(tài)結(jié)構(gòu)：于1.3.2中相同的時間、方法，將sham組、pMCAO 3 h、9 h和24 h組每組6只大鼠處死，取腦組織進行切片，每只鼠共切取6片腦組織。取其中第1、2和6片切片與1.3.2相同方法進行TTC染色，取第3、4和5切片梗死側(cè)大腦皮質(zhì)及對側(cè)皮質(zhì)相應(yīng)部位各取約1×1×1 mm大小組織塊，置入2.5%(質(zhì)量濃度)戊二醛溶液中固定4 h，制備成電鏡樣品，剩余組織液氮凍存留待制備Western blot樣品。透射電鏡下觀察記錄腦組織細胞中線粒體形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化，當(dāng)細胞中出現(xiàn)典型的具有雙層膜的包裹線粒體的自噬體或者單層膜的自噬溶酶體的時候表明細胞的線粒體自噬活性增強。

1.2.4 Western blot檢測pMCAO后梗死側(cè)腦組織中BNIP3及線粒體自噬相關(guān)蛋白的表達：本研究所觀察線粒體自噬相關(guān)蛋白包括Beclin-1、微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(LC3)、熱休克蛋白60(HSP60)、線粒體外膜易位酶(TOM20)、選擇性自噬接頭蛋白P62。本研究中梗死側(cè)腦組織為線栓閉塞側(cè)的對側(cè)腦組織，在形態(tài)上TTC染色顯示白色梗死灶。將“1.3.3”中每組6只大鼠制備電鏡樣品后剩余的第3、4和5片腦片梗死側(cè)半腦置于組織勻漿研磨器中研磨，加RIPA裂解液裂解，于4℃以12000r/min離心30 min后取上清，采用BCA法檢測上清液蛋白濃度，制備16%(質(zhì)量濃度)SDS-PAGE分離膠，聚丙烯酰胺凝膠電泳，濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，5%(質(zhì)量濃度)脫脂奶粉室溫封閉2 h，滴加一抗(BNIP3兔單抗1∶1000，TM20兔多抗1∶5000，LC3兔單抗1∶1000，Beclin-1鼠單抗1∶1000，P62鼠單抗1∶5000，HSP60羊多抗1∶4000，β-actin鼠單抗1∶10000)于4℃冰箱孵育過夜。TBST漂洗10 min×3次，然后用辣根過氧化物酶標記的二抗室溫孵育2 h。TBST漂洗10 min×3次后加入ECL超敏發(fā)光液顯影。用掃描儀將X射線底片掃描成照片，Image J軟件計算各組目的條帶的灰度值。LC3以LC3-Ⅱ灰度值與LC3-Ⅰ灰度值的比值(即LC3-Ⅱ/Ⅰ)比值，其他線粒體自噬相關(guān)蛋白及BNIP3以目的條帶灰度值與內(nèi)參β-actin灰度值的比值作為相對表達量?；叶戎当戎荡蟠硐鄳?yīng)蛋白的表達量高。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS19.0軟件進行分析。計量資料以均數(shù)±標準差表示，4組間腦矯正梗死體積、BNIP3及線粒體自噬相關(guān)蛋白相對表達量比較均采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)，組間兩兩比較采用Post hoc方法。以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠矯正腦梗死體積變化 sham組大鼠無腦梗死發(fā)生，其余3組均存在腦梗死區(qū)(圖1)。四組間矯正腦梗死體積比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=316.247，P=0.000)。pMCAO3 h、9 h、24 h組梗死體積〔分別為(12.12±2.15)% 、(37.00±4.24)% 和(51.82±4.39)%〕均明顯高于sham組〔P<0.01〕，且隨缺血時間延長而腦梗死體積增加(四組間兩兩比較，均P<0.01)。

2.2 各組大鼠腦組織中線粒體形態(tài)變化比較 sham組大鼠腦組織中神經(jīng)細胞的線粒體結(jié)構(gòu)正常，鏡下可見完整的雙層線粒體膜結(jié)構(gòu)，內(nèi)膜向內(nèi)腔延生形成嵴，外膜呈橢圓形；pMCAO 3 h、9 h組線粒體多變圓，并可見典型的線粒體自噬情況，具有自噬體膜包裹線粒體的結(jié)構(gòu)；pMCAO 24 h組線粒體形態(tài)結(jié)構(gòu)受到嚴重破壞，雙層膜結(jié)構(gòu)不完整，嵴消失，線粒體腫脹明顯加劇，且多呈空泡化，完全觀察不到線粒體自噬結(jié)構(gòu)(圖2)。

2.3 各組大鼠梗死側(cè)腦組織中BNIP3和線粒體自噬相關(guān)蛋白表達 結(jié)果見表1，圖3。與sham組比較，pMCAO 3 h和9 h組BNIP3、Beclin-1蛋白表達增加，自噬標記分子LC3-Ⅱ/Ⅰ比值升高，接頭蛋白P62和線粒體標記蛋白TOM20、HSP60表達下降(均P<0.01)，pMCAO 24 h組BNIP3、HSP60蛋白表達下降，Beclin-1、LC3-Ⅱ/Ⅰ比值、P62、TOM20水平增加(均P<0.01)；與pMCAO 3 h組比較，pMCAO 9 h組BNIP3、TOM20、HSP60表達下降，Beclin-1、LC3-Ⅱ/Ⅰ比值、P62水平升高(均P<0.01)，pMCAO 24 h組BNIP3、Beclin-1表達下降，LC3-Ⅱ/Ⅰ比值、P62、TOM20、HSP60表達水平升高(均P<0.01)；與pMCAO 9 h組比較，pMCAO24 h組BNIP3和Beclin-1表達下調(diào)，LC3-Ⅱ/Ⅰ比值降低，P62和TOM20、HSP60表達增加(均P<0.01)。

0 h：sham組；3 h：pMCAO 3 h 組；9 h：pMCAO 9 h 組；24 h：pMCAO 24 h 組 圖1 各組大鼠腦組織TTC染色表現(xiàn)(圖中每組均為1只鼠的冠狀腦組織切片，自上至下順序為由前極向后方向；圖中白色部分為梗死區(qū))

N：nucleus(細胞核)；A：sham組；B：pMCAO 3 h 組；C：pMCAO 9 h 組；D：pMCAO 24 h 組 圖2 pMCAO后各時間組腦組織中線粒體形態(tài)的超微結(jié)構(gòu)變化(圖中黑色箭頭所示為線粒體自噬溶酶體；各圖中主體部分均為右上角部分圖中紅方框部分圖的3倍放大，每張圖中的大小兩個標尺均為500 μm)

組別Beclin-1BNIP3p62TOM20LC3-II/IHSP60pMCAO24h0.416±0.017*#△0.234±0.012*#△1.292±0.021*#△1.098±0.070*#△0.813±0.021*#△0.945±0.026*#△pMCAO9h0.848±0.022*#0.907±0.031*#0.970±0.009*#0.581±0.016*#0.857±0.028*#0.849±0.020*#pMCAO3h0.584±0.012*1.021±0.027*0.751±0.018*0.677±0.005*0.497±0.016*0.883±0.010*sham0.372±0.0170.677±0.0201.112±0.0270.993±0.0120.356±0.0251.286±0.019F932.2771300.212803.349275.148673.816638.451P0.0000.0000.0000.0000.0000.000

注：與sham組比較，*P<0.01；與pMCAO 3 h組比較，#P<0.01；與pMCAO 9 h組比較，△P<0.01

0 h：sham組；3 h：pMCAO 3 h 組；9 h：pMCAO 9 h 組；24 h：pMCAO 24 h 組 圖3 各組大鼠梗死側(cè)腦組織中BNIP3及線粒體自噬相關(guān)蛋白表達比較(Western blot法)

3 討論

腦卒中已經(jīng)成為危害大眾健康和降低患者生活質(zhì)量的主要疾病，其中又以缺血性卒中發(fā)病率最高。因此，揭示腦缺血過程的損傷機制，尋找藥物治療的有效靶點具有重要的現(xiàn)實意義。

發(fā)生缺血/缺氧時細胞線粒體首先受損，受損線粒體釋放活性氧(ROS)和凋亡信號，引起細胞凋亡或壞死[10]。近年研究發(fā)現(xiàn)，細胞內(nèi)存在一種保護機制，能將受損的線粒體通過自噬體的介導(dǎo)而被溶酶體所降解，此過程即為線粒體自噬。線粒體自噬可以清除受損線粒體，減少ROS產(chǎn)生和凋亡信號的釋放，對機體起保護作用，因而越來越受到人們的重視。

BNIP3是由Boyd等[11]在酵母雙雜交篩選實驗中首次發(fā)現(xiàn)的線粒體外膜蛋白，之后又證實BNIP3是低氧誘導(dǎo)因子HIF-1的靶分子，能被低氧或缺血條件誘發(fā)高表達[12]?，F(xiàn)有研究表明，BNIP3能作為線粒體自噬的受體分子通過與自噬標記分子LC3的直接結(jié)合誘發(fā)線粒體自噬[13]。但在腦缺血過程中BNIP3的表達變化及其與線粒體自噬的關(guān)系還未見研究報道。

本研究采用pMCAO大鼠模型來探討腦缺血過程中BNIP3表達變化及其與線粒體自噬的關(guān)系，分析BNIP3表達與腦缺血損傷程度的相關(guān)性，探索BNIP3作為藥物靶點干預(yù)腦缺血損傷的可行性。研究結(jié)果顯示，與sham組相比，pMCAO3 h和9 h組BNIP3表達水平升高，透射電鏡下可觀察到典型的線粒體自噬現(xiàn)象，線粒體自噬相關(guān)蛋白Beclin-1蛋白表達增加，自噬標記分子LC3-Ⅱ/Ⅰ比值升高，接頭蛋白P62和線粒體標記蛋白TOM20、HSP60表達下降(均P<0.01)，也顯示線粒體自噬被激活，此時腦梗死發(fā)生程度較輕。pMCAO24 h組BNIP3表達水平與pMCAO 9 h組比較顯著下降，電鏡觀察結(jié)果及線粒體自噬相關(guān)蛋白Beclin-1、LC3、P62、TOM20、HSP60檢測也都顯示線粒體自噬被抑制，此時腦梗死體積明顯增加。上述現(xiàn)象表明，BNIP3可以促進線粒體自噬的發(fā)生，而線粒體自噬在保護機體細胞過程中發(fā)揮重要作用。本研究中腦缺血早期BNIP3水平升高，線粒體自噬現(xiàn)象明顯；在腦缺血后期BNIP3表達水平降低，線粒體自噬亦被抑制而不能發(fā)揮保護作用，腦梗死加劇。以上結(jié)果提示BNIP3很可能在腦缺血早期通過促進線粒體自噬來發(fā)揮對腦缺血損傷的保護作用。

綜上所述，在腦缺血過程中BNIP3的表達變化與線粒體自噬的發(fā)生密切相關(guān)；BNIP3高表達可能在減輕缺血性腦損傷過程中發(fā)揮重要作用，而BNIP3低表達則可能加重缺血性腦損傷程度。該結(jié)果為今后進一步研究BNIP3潛在的腦保護作用提供了直接證據(jù)，同時也為臨床治療缺血性腦損傷疾病提供了新的干預(yù)靶點。

[1]鐘曉南. 腦卒中的免疫機制進展[J]. 中國神經(jīng)免疫學(xué)和神經(jīng)病學(xué)雜志， 2011， 18(6)：435-437.

[2]戴正澤， 王輝軍， 趙應(yīng)群. 腦出血血腫擴大的研究進展[J]. 中國神經(jīng)免疫學(xué)和神經(jīng)病學(xué)雜志， 2015， 22(5)：365-368.

[3]Ray R， Chen G， Velde CV， et al. BNIP3 heterodimerizes with Bcl-2/Bcl-XL and induces cell death independent of a Bcl-2 homology 3 (BH3) domain at both mitochondrial and nonmitochondrial sites[J]. J Biol Chem， 2000， 275(2)： 1439-1448.

[4]Luo L， Xiong ZB， Zeng H， et al. Expression of BNIP3 and its correlations to HIF-1alpha and VEGF in clear cell renal cell carcinoma[J]. J Sichuan Univ Med Sci， 2012， 43(1)： 79-82.

[5]Mazure NM，Pouysségur J. Hypoxia-induced autophagy： cell death or cell survival?[J]. Curr Opin Plant Biol， 2010， 22(2)：177-180.

[6]Lemasters JJ. Selective mitochondrial autophagy， or mitophagy， as a targeted defense against oxidative stress， mitochondrial dysfunction， and aging[J]. Rejuv Res， 2005， 8(1)：3-5.

[7]Zhang H， Bosch-Marce M， Shimoda LA， et al. Mitochondrial autophagy is an HIF-1-dependent adaptive metabolic response to hypoxia[J]. J Biol Chem， 2008， 283(16)： 10892-10903.

[8]Longa EZ， Weinstein PR， Carlson S， et al. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats[J]. Stroke， 1989， 20(1)： 84-91.

[9]Liu H， Lu J， Hua Y， et al. Targeting heat-shock protein 90 with ganetespib for molecularly targeted therapy of gastric cancer[J]. Cell Death Dis， 2015， 6(1)： e1595.

[10]Ertracht O， Malka A， Atar S， et al. The mitochondria as a target for cardioprotection in acute myocardial ischemia[J]. Pharmacol Therapeut， 2014， 142(1)： 33-40.

[11]Boyd JM， Malstrom S， Subramanian T， et al. Adenovirus E1B 19 kDa and Bcl-2 proteins interact with a common set of cellular proteins[J]. Cell， 1994， 79(2)： 341-351.

[12]Bruick RK. Expression of the gene encoding the proapoptotic Nip3 protein is induced by hypoxia[J]. Proc Natl Acad Sci， 2000， 97(16)： 9082-9087.

[13]Hanna RA， Quinsay MN， Orogo AM， et al. Microtubule-associated protein 1 light chain 3 (LC3) interacts with BNIP3 protein to selectively remove endoplasmic reticulum and mitochondria via autophagy[J]. J Biol Chem， 2012， 287(23)： 19094-19104.

(本文編輯：鄒晨雙)

Study of the relationship between BNIP3 expression and cerebral ischemic injury

HUANGGuanghai，HEYunling，DIYao，ZHAOTong，RENchanghong，F(xiàn)ANMing，ZHULingling，WULiying*，WUKuiwu*.

*DepartmentofCognitiveScience，AcademyofMilitaryMedicalSciences，Beijing100850，China

WU Kuiwu， Email： ammswu@sina.com； WU Liying， Email： liyingwu_china@163.com

Objective To investigate the brain injury condition in rat with permanent middle cerebral artery occlusion( pMCAO)at different time points，expression of Bcl-2/adenovirus E1B-19 kDa-interacting protein 3(BNIP3) and mitophagy-related proteins in order to explore the relationship between BNIP3 and cerebral ischemia injury degree. Methods Healthy male SD rats were randomly divided into the sham surgery group (0 h group)， pMCAO 3 h， 9 h group and 24 h group， there were 12 rats in each group. The brains were dyed with TTC to measure the infarct percentage at different time points. Then， the mitophagy was observed by transmission electron microscope. The expression of BNIP3 and mitophagy-related proteins in brains were determined quantitatively by western blotting analysis. Results (1)The sham group showed no infarction with TTC staining， but the other three groups had cerebral infarction area. The infarct volume of pMCAO 3 h，9 h and 24 h group [ (12.12±2.15)%， (37.00±4.24)% and (51.82±4.39)%， respectively] was significantly higher than that of the sham group (P<0.01， respectively)， and increased with ischemia time prolonged(multiple comparison，P<0.01， respectively). (2)The complete bilayer mitochondrial membrane structure was observed by transmission electron microscope in the sham group； The typical bilayer membrane structure of mitophagy was observed in the pMCAO 3 h and 9 h groups， and the mitochondrial damage was severe in the pMCAO 24 h group， such as mitochondrial crista disappearing， damaged membrane， mitochondrial swelling.Mitophagy was not observed.(3)The western blot results revealed that the expressions of BNIP3 and Beclin-1 increased， the ratio of LC3-Ⅱ/Ⅰ elevated， P62， TOM20 and HSP60 levels declined within 3-9 h compared with the sham group(P<0.01， respectively).In addition， we also found that the protein levels of BNIP3 and Beclin-1 were down-regulated，the ratio of LC3-Ⅱ/Ⅰ decreased， and the protein levels of P62， TOM20 and HSP60 increased at 24 h compared with those in the pMCAO 9 h group(P<0.01， respectively). Conclusions BNIP3 is likely to play a protective role in cerebral ischemic injury at the early stage of cerebral ischemia by promoting mitophagy.

cerebral ischemia； BNIP3； mitophagy

10.3969/j.issn.1006-2963.2016.04.007

國家自然科學(xué)基金面上項目(31271211)；國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃(973計劃)(2012CB518200)

100850 軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所認知科學(xué)研究室(黃廣海、何云凌、邸瑤、趙彤、范明、朱玲玲、吳麗穎、吳奎武)；100053 低氧適應(yīng)轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)北京市重點實驗室(任長虹)

吳奎武，Email：ammswu@sina.com；吳麗穎，Email：liyingwu_china@163.com

R363.2；R743.3

A

1006-2963(2016)04-0256-06

2016-01-04)