吳 康， 滿艷茹， 唐文瀟， 俞靖龍， 周道銀， 鄧安梅， 孫 懿， 顏宏利

第二軍醫(yī)大學(xué)長(zhǎng)海醫(yī)院實(shí)驗(yàn)診斷科，上海 200433

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自動(dòng)尿液細(xì)胞DNA定量分析對(duì)泌尿系統(tǒng)炎癥與膀胱癌的鑒別診斷價(jià)值

吳 康△， 滿艷茹△， 唐文瀟， 俞靖龍， 周道銀， 鄧安梅， 孫 懿*， 顏宏利*

第二軍醫(yī)大學(xué)長(zhǎng)海醫(yī)院實(shí)驗(yàn)診斷科，上海 200433

目的： 評(píng)估尿液細(xì)胞DNA定量分析在泌尿系統(tǒng)腫瘤診斷中的應(yīng)用價(jià)值。方法： 采集92例泌尿系統(tǒng)炎癥和39例疑似膀胱癌患者的尿液分別進(jìn)行DNA定量測(cè)定、常規(guī)細(xì)胞學(xué)檢驗(yàn)和尿液液基細(xì)胞學(xué)檢查，以病理診斷為金標(biāo)準(zhǔn)，評(píng)估3種方法對(duì)泌尿系統(tǒng)炎癥與膀胱癌的鑒別診斷價(jià)值，分析尿液細(xì)胞DNA定量與腫瘤分型的關(guān)聯(lián)。結(jié)果： 尿液DNA倍體分析對(duì)膀胱癌診斷的敏感性和特異性分別為88.89%和97.09%，診斷符合率為94.66%。傳統(tǒng)尿液細(xì)胞學(xué)檢驗(yàn)的敏感性和特異性分別為51.85%和100%，準(zhǔn)確性為90.07%。尿液液基細(xì)胞學(xué)檢查對(duì)膀胱癌診斷的敏感性和特異性分別為81.48%和99.04%，診斷符合率為95.41%。尿液DNA倍體分析結(jié)果>5C細(xì)胞的個(gè)數(shù)與尿路上皮癌分型存在關(guān)聯(lián)，高級(jí)別尿路上皮癌組異倍體(>5C)細(xì)胞數(shù)量較低級(jí)別組顯著增高。結(jié)論： 尿液DNA定量分析能夠較好地鑒別泌尿系統(tǒng)炎癥與膀胱癌，較傳統(tǒng)細(xì)胞學(xué)檢驗(yàn)有更好的提示作用。

自動(dòng)尿液細(xì)胞DNA定量分析；泌尿系統(tǒng)炎癥；膀胱癌

細(xì)胞增殖取決于細(xì)胞核的DNA復(fù)制與細(xì)胞分裂。DNA含量的變化可作為直接反映腫瘤增殖能力的重要生物學(xué)指標(biāo)。細(xì)胞癌變的本質(zhì)是細(xì)胞迅速無(wú)限增殖和轉(zhuǎn)移，正常細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞在生長(zhǎng)增殖時(shí)，細(xì)胞核內(nèi)DNA結(jié)構(gòu)及含量都會(huì)發(fā)生變化。生理狀態(tài)下，人體大多數(shù)細(xì)胞(90%以上)在G0/G1期，即二倍體(2C)細(xì)胞。病理狀態(tài)下，炎性刺激時(shí)S期和G2/M期(2C至4C)細(xì)胞數(shù)量增加，腫瘤細(xì)胞過(guò)度增殖時(shí)往往導(dǎo)致>5C的非整倍體細(xì)胞出現(xiàn)并異常增多。本研究擬評(píng)估尿液細(xì)胞DNA定量分析對(duì)泌尿系統(tǒng)炎癥與膀胱癌的鑒別診斷價(jià)值。通過(guò)對(duì)細(xì)胞DNA/核酸倍體檢測(cè)，了解細(xì)胞周期變化及監(jiān)測(cè)惡性增殖的腫瘤細(xì)胞的出現(xiàn)。

自動(dòng)尿液細(xì)胞DNA定量分析是一項(xiàng)新型的用于評(píng)估是否存在泌尿系統(tǒng)腫瘤細(xì)胞的檢查方法。對(duì)于患者，該檢查安全無(wú)創(chuàng)，便于標(biāo)本的采集和病情的監(jiān)測(cè)。對(duì)于檢驗(yàn)工作者，該方法具有靈敏度高、可標(biāo)準(zhǔn)化、客觀性強(qiáng)等顯著優(yōu)勢(shì)。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 2014年8月至2016年8月于上海長(zhǎng)海醫(yī)院就診的92例泌尿系統(tǒng)炎癥和39例疑似膀胱癌患者，患者均簽署知情同意書(shū)，獲得本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。收集患者清晨第一次尿液，要求尿量大于200 mL，并于2 h內(nèi)送檢進(jìn)行細(xì)胞DNA倍體檢測(cè)，詳細(xì)記錄病史、癥狀、病理結(jié)果。

1.2 方法 尿液標(biāo)本混勻離心，根據(jù)沉淀的細(xì)胞數(shù)量加入適量固定液(50%酒精)重懸后混勻，使用涂片離心機(jī)制成薄層細(xì)胞片2張，一張采用福爾根(Feulgen)DNA染液染色細(xì)胞的細(xì)胞核[1]，用于DNA定量測(cè)定；另一張用瑞氏-吉姆薩染液染色，用于常規(guī)細(xì)胞學(xué)檢驗(yàn)，由一名具有4年以上專業(yè)工作經(jīng)驗(yàn)的中級(jí)檢驗(yàn)人員進(jìn)行閱片。

1.3 細(xì)胞圖像分析 采用AcCell全自動(dòng)細(xì)胞分析圖像系統(tǒng)(武漢蘭丁醫(yī)學(xué)高科技有限公司)進(jìn)行掃描處理[2-3]，用軟件進(jìn)行細(xì)胞圖像分割，得到單個(gè)細(xì)胞核的圖像，按照不同的細(xì)胞類(lèi)型自動(dòng)分組，根據(jù)細(xì)胞DNA含量對(duì)每個(gè)像素做0至255之間的量化分析，統(tǒng)計(jì)整個(gè)樣本中的所有細(xì)胞核DNA含量。

1.4 病理學(xué)診斷 泌尿系統(tǒng)炎癥組因未做組織病理檢查，病理學(xué)診斷結(jié)果為尿液液基細(xì)胞學(xué)檢測(cè)；疑似泌尿系統(tǒng)腫瘤組進(jìn)行活檢或手術(shù)，由病理醫(yī)生進(jìn)行取材及病理診斷，以組織病理結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 兩組之間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)(α)為0.05。

2 結(jié) 果

2.1 不同方法對(duì)泌尿系統(tǒng)腫瘤的檢出率對(duì)比 取92例泌尿系統(tǒng)炎癥患者和39例疑似膀胱癌患者尿液，分別進(jìn)行DNA定量分析、傳統(tǒng)細(xì)胞學(xué)鏡檢、尿液液基細(xì)胞學(xué)病理和組織病理檢查，兩組分別以尿液液基細(xì)胞學(xué)檢查結(jié)果和組織病理結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算細(xì)胞DNA定量分析、常規(guī)細(xì)胞學(xué)檢驗(yàn)和尿液液基細(xì)胞學(xué)檢查3種方法對(duì)泌尿系統(tǒng)腫瘤的檢出率。結(jié)果(表1～表3)表明：131例標(biāo)本最終經(jīng)組織病理診斷27例膀胱癌，DNA倍體分析對(duì)膀胱癌診斷的敏感性和特異性分別為88.89%和97.09%，診斷符合率為94.66%；傳統(tǒng)尿液細(xì)胞學(xué)檢驗(yàn)的敏感性和特異性分別為51.85%和100%，準(zhǔn)確性為90.07%；尿液液基細(xì)胞學(xué)檢查對(duì)膀胱癌診斷的敏感性和特異性分別為81.48%和99.04%，診斷符合率為95.41%。

表1 細(xì)胞DNA定量分析對(duì)膀胱癌的檢出情況

表2 常規(guī)細(xì)胞學(xué)檢驗(yàn)對(duì)膀胱癌的檢出情況

表3 尿液液基細(xì)胞學(xué)檢查對(duì)膀胱癌的檢出情況

2.2 不同級(jí)別尿路上皮癌患者尿液細(xì)胞DNA定量對(duì)比 27例膀胱癌患者中25例為尿路上皮癌患者，分析計(jì)數(shù)>5C細(xì)胞(異倍體細(xì)胞)數(shù)量與尿路上皮癌分級(jí)之間的關(guān)聯(lián)發(fā)現(xiàn)，高級(jí)別尿路上皮癌組>5C細(xì)胞數(shù)量顯著高于低級(jí)別尿路上皮癌組(P<0.01，圖1)。低級(jí)別尿路上皮癌組患者>5C細(xì)胞數(shù)量(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差)為4.28±3.10，高級(jí)別尿路上皮癌組患者>5C細(xì)胞數(shù)量為21.67±15.29。

圖1 尿路上皮癌患者尿液細(xì)胞DNA定量分析

3 討 論

本研究以病理診斷為金標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)92例泌尿系統(tǒng)炎癥患者和39例疑似泌尿系統(tǒng)腫瘤患者的尿液進(jìn)行檢測(cè)，通過(guò)比較傳統(tǒng)細(xì)胞學(xué)檢驗(yàn)、尿液液基細(xì)胞學(xué)檢查和DNA定量分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)：尿液DNA定量分析對(duì)泌尿系統(tǒng)炎癥與膀胱癌的鑒別診斷，與尿液液基細(xì)胞學(xué)檢查效率相當(dāng)，較傳統(tǒng)細(xì)胞學(xué)檢驗(yàn)有更好的提示作用。

27例活檢病理診斷的膀胱癌病例中，有3例DNA倍體分析與病理結(jié)果不符，分析考慮存在兩方面因素：(1)標(biāo)本中細(xì)胞數(shù)量少或標(biāo)本受到污染，如陰道分泌物、前列腺液的污染，或留取不當(dāng)致尿液被外源物質(zhì)所污染，導(dǎo)致尿液中的細(xì)胞破壞明顯，均可能造成假陰性結(jié)果；(2)腫瘤本身的因素，如局部微環(huán)境及脫落時(shí)間因素所致的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核出現(xiàn)一系列退化性改變。此外，我們發(fā)現(xiàn)由于DNA倍體圖像分析技術(shù)需要計(jì)算單個(gè)細(xì)胞的DNA指數(shù)，因此會(huì)剔除重疊細(xì)胞，導(dǎo)致一些具有粘附特性的腫瘤細(xì)胞被剔除，造成假陰性結(jié)果。104例非泌尿系統(tǒng)腫瘤患者的標(biāo)本中，DNA倍體分析，存在4例異倍體(>5C)細(xì)胞數(shù)量分別為1個(gè)、1個(gè)、2個(gè)和3個(gè)的假陽(yáng)性病例，他們的診斷分別為膀胱粘膜慢性炎癥、膀胱粘膜慢性炎癥、嗜酸性膀胱炎和膀胱粘膜慢性炎癥。這些倍體異常的假陽(yáng)性病例預(yù)后如何，有待于我們進(jìn)一步的跟蹤隨訪。

盡管傳統(tǒng)細(xì)胞學(xué)鏡檢尿液腫瘤細(xì)胞假陽(yáng)性率為0，但陽(yáng)性檢出率只有51.85%，較DNA定量分析明顯偏低。經(jīng)我們統(tǒng)計(jì)，在漏診的13例傳統(tǒng)細(xì)胞學(xué)檢驗(yàn)病例中，有9例為尿液DNA定量分析僅見(jiàn)少量異倍體細(xì)胞，即>5C細(xì)胞數(shù)量小于3個(gè)。細(xì)胞的形態(tài)，特別是胞核和核仁的大小、形狀及染色不一致是惡性腫瘤的重要特征。臨床傳統(tǒng)細(xì)胞學(xué)檢驗(yàn)過(guò)程中常常遇到因細(xì)胞數(shù)量少、細(xì)胞形態(tài)不典型而難以確診的脫落細(xì)胞病例，導(dǎo)致陽(yáng)性檢出率偏低。與診斷效率相當(dāng)?shù)哪蛞阂夯?xì)胞學(xué)檢查比較，自動(dòng)尿液細(xì)胞DNA倍體檢查的優(yōu)勢(shì)在于可以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞學(xué)檢查的自動(dòng)化、標(biāo)準(zhǔn)化和數(shù)字化。該檢測(cè)技術(shù)同樣采用高效的液基薄層細(xì)胞制片，除進(jìn)行人工閱片外，該技術(shù)可進(jìn)行儀器自動(dòng)拍攝，對(duì)所有細(xì)胞核的DNA含量進(jìn)行定量分析統(tǒng)計(jì)，獲得定量結(jié)果。

DNA倍體分析技術(shù)在多種人類(lèi)腫瘤診斷中具有重要的診斷價(jià)值，其在宮頸癌及癌前病變的診斷、早期篩查及評(píng)估預(yù)后的實(shí)踐中早已取得了國(guó)內(nèi)外同行的廣泛認(rèn)可[4-5]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)其在臨床懷疑的口腔早期腫瘤及口腔癌癥中具有非常顯著的診斷價(jià)值[6-7]，對(duì)漿膜腔積液[8]、支氣管肺泡灌洗液[9]等體液中的惡性細(xì)胞的診斷具有良好的應(yīng)用價(jià)值。在泌尿系統(tǒng)腫瘤方面，研究發(fā)現(xiàn)DNA倍體分析可大大提高尿路上皮癌檢測(cè)的特異性,增加對(duì)浸潤(rùn)性膀胱癌及上尿路上皮癌診斷的靈敏度，是對(duì)尿路上皮癌檢測(cè)方法的有力補(bǔ)充[10]。本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)自動(dòng)DNA定量分析技術(shù)能夠較好地鑒別癌細(xì)胞和炎癥刺激導(dǎo)致的細(xì)胞核異質(zhì)改變，對(duì)膀胱癌的輔助診斷具有較高的敏感性和特異性，且尿液脫落細(xì)胞DNA異倍體細(xì)胞數(shù)量與尿路上皮癌的分級(jí)顯著相關(guān)，尿液DNA倍體分析能夠?yàn)槊谀蛳到y(tǒng)腫瘤提供良好的輔助診斷依據(jù)。盡管研究發(fā)現(xiàn)VEGF、VEGFR定量分析熒光原位雜交(FISH)法對(duì)膀胱尿路上皮癌診斷的敏感性高于DNA倍體和尿細(xì)胞學(xué)檢查[11],但由于FISH檢查法價(jià)格昂貴，不適用于臨床篩查。相比較而言，隨著自動(dòng)尿液細(xì)胞DNA倍體檢測(cè)技術(shù)在圖像采集和篩選方面的不斷改進(jìn)[12-13]，其在惡性疾病的大樣本量篩查方面具有的優(yōu)勢(shì)將進(jìn)一步顯現(xiàn)。

[ 1 ] 孫小蓉, 汪 建.脫落細(xì)胞學(xué)診斷[M].武漢:湖北科學(xué)技術(shù)出版社, 2006:234-235.

[ 2 ] Palcic B, Garner DM, MacAulay CE, et al. Oncometrics Imaging Corporation and Xillix Technologies Corporation. Use of the Cyto-Savant in quantitative cytology[J]. Acta Cytol, 1996,40(1):67-72.

[ 3 ] Doudkine A, Macaulay C, Poulin N, et al. Nuclear texture measurements in image cytometry[J]. Pathologica, 1995,87(3):286-299.

[ 4 ] Guillaud M, Benedet JL, Cantor SB，et al．DNA ploidy compared with human papilloma virus testing (Hybrid Capture II) and conventional cervical cytology as a primary screening test for cervical high-grade lesions and cancer in 1555 patients with biopsy confirmation[J]. Cancer, 2006,107(2):309-318.

[ 5 ] B?cking A, Nguyen VQ. Diagnostic and prognostic use of DNA image cytometry in cervical squamous intraepithelial lesions and invasive carcinoma[J]. Cancer, 2004,102(1):41-54.

[ 6 ] Macey R. DNA-Image Cytometry and Computer-Assisted Brush Biopsy have Potential as Diagnostic Tools for Clinically Suspected Oral Precancer and Oral Cancer[J]. J Evid Based Dent Pract, 2016,16(2):113-114.

[ 7 ] Abt E. DNA-image cytometry has promise for oral cancer detection[J]. Evid Based Dent, 2015,16(4):106-107.

[ 8 ] 張素霞, 周 紅, 宇小婷, 等.全自動(dòng)DNA定量分析檢測(cè)對(duì)惡性胸腔積液診斷的價(jià)值[J].中華病理學(xué)雜志, 2015,44(9):653-654.

[ 9 ] 陶 偉, 李 俊, 程柳柳. 細(xì)胞DNA定量分析技術(shù)在肺癌診斷中的應(yīng)用價(jià)值[J].中華腫瘤雜志, 2016,38(2):113-117.

[10] 唐 燕, 余 龍. 尿路上皮癌診斷中DNA倍體分析和尿脫落細(xì)胞學(xué)檢查的臨床價(jià)值[J],臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志, 2015,31(6):636-639.

[11] 顧沈陽(yáng), 俞俊杰, 劉亞?wèn)|, 等. 全自動(dòng)圖像細(xì)胞法、熒光原位雜交法、流式細(xì)胞儀對(duì)膀胱腫瘤的診斷和意義[J].實(shí)用癌癥雜志, 2014,29(1):41-44.

[12] Friedrich D, B?cking A, Meyer-Ebrecht D, et al. Removing defocused objects from single focal plane scans of cytological slides[J]. J Pathol Inform, 2016,7:21.

[13] Bougen-Zhukov N, Loh SY, Lee HK, et al. Large-scale image-based screening and profiling of cellular phenotypes[J]. Cytometry A, 2016.[Epub ahead od print]

[本文編輯] 廖曉瑜， 賈澤軍

The value of automated urine cell DNA quantitative analysis in the differential diagnosis of urinary tract inflammation and bladder cancer

WU Kang△, MAN Yan-ru△, TANG Wen-xiao, YU Jing-long, ZHOU Dao-yin, DENG An-mei, SUN Yi*, YAN Hong-li*

Department of Clinical Laboratory, Changhai Hospital, Second Military Medical University, Shanghai 200433, China

Objective： To evaluate the application value of urine cell DNA quantitative analysis in the diagnosis of urinary tract tumors. Methods： There were 92 cases of urinary tract inflammation and 39 cases of patients with suspected bladder cancer urine were tested by DNA quantitative determination, conventional cytology test and urine cytology, pathological diagnosis as the gold standard, the value of the three methods in differential diagnosis of urinary tract inflammation and bladder cancer were assessed, the correlationship between urine cell DNA quantitative and tumor types was analyzed. Results： The sensitivity and specificity of urinary DNA ploidy analysis for the diagnosis of bladder cancer were 88.89% and 97.09%, respectively, and the diagnostic accuracy was 94.66%. The sensitivity and specificity of the traditional urine cytology test were 51.85% and 100%, respectively, and the accuracy was 90.07%. The sensitivity and specificity of urine liquid based cytology test in the diagnosis of bladder cancer were 81.48% and 99.04%, respectively, and the diagnostic accuracy was 95.41%. Urine DNA ploidy analysis results >5C cell number and the type of the urinary tract epithelial cancer were associated, high level of urinary tract epithelial cancer group (>5C) cell number was significantly higher than the low level group. Conclusions： The urine DNA quantitative analysis can identify the urinary system inflammation and bladder cancer, which is better than the traditional cytology test.

automated urine cell DNA quantitative analysis; urinary system inflammation; bladder cancer

2016-07-05 [接受日期] 2016-10-19

國(guó)家自然科學(xué)基金(81302579，81471605)，上海申康醫(yī)院發(fā)展中心市級(jí)醫(yī)院臨床輔助科室能力建設(shè)項(xiàng)目基金(SHDC22014014). Supported by National Natural Science Foundation of China(81302579，81471605)and Ability Construction of Clinical Assistant Department of Municipal Hospital of Shanghai Shenkang Hospital Development Center(SHDC22014014).

吳 康，檢驗(yàn)技師. E-mail：759051596@qq.com；滿艷茹，檢驗(yàn)技師. E-mail：707149296@qq.com

10.12025/j.issn.1008-6358.2016.20160714

短篇論著

R 737.1

A

△共同第一作者(Co-first authors).

*通信作者(Corresponding authors). Tel: 021-31162079, E-mail: medsunyi@163.com; Tel: 021-31162079, E-mail: y_hongli@yahoo.com