王 鵬， 吳貽明

上海市楊浦區(qū)精神衛(wèi)生中心，上海 200090

?

石菖蒲對(duì)抑郁模型大鼠海馬組織mTOR信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

王 鵬， 吳貽明

上海市楊浦區(qū)精神衛(wèi)生中心，上海 200090

目的： 探討石菖蒲對(duì)抑郁模型大鼠海馬組織mTOR信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。方法： 采用孤養(yǎng)結(jié)合慢性不可預(yù)見應(yīng)激方法造成大鼠抑郁，在7、14、21、28 d時(shí)，檢測(cè)各組大鼠曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中水平運(yùn)動(dòng)、垂直運(yùn)動(dòng)得分，并用Western印跡法檢測(cè)各組大鼠海馬組織mTOR信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)變化。結(jié)果： 21 d、28 d時(shí)，與對(duì)照組比較， 模型組垂直運(yùn)動(dòng)和水平運(yùn)動(dòng)得分減少(P<0.01)；與模型組比較， 中、西藥組垂直運(yùn)動(dòng)和水平運(yùn)動(dòng)得分增加(P<0.05、0.01)。21 d、28 d時(shí)，與對(duì)照組比較，模型組大鼠海馬Akt、mTOR、p70S6K和elF-4E蛋白的表達(dá)下調(diào)(P<0.01)；與模型組比較，中、西藥組大鼠海馬Akt、mTOR、p70S6K和elF-4E蛋白表達(dá)增加(P<0.01)。結(jié)論： 石菖蒲的抗抑郁效應(yīng)可能通過(guò)激活mTOR信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)而實(shí)現(xiàn)。

石菖蒲；抑郁癥；mTOR信號(hào)通路

抑郁癥是一種常見的心境障礙，以情緒低落、興趣喪失等為主要臨床表現(xiàn)[1]。孤養(yǎng)結(jié)合慢性不可預(yù)知性應(yīng)激能造成較理想的抑郁狀態(tài)[2]，是目前最好的抑郁癥造模方式[3]。mTOR是一種非典型絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，其作用是調(diào)控蛋白質(zhì)翻譯起始階段。近期研究[4]發(fā)現(xiàn)，通過(guò)激活mTOR信號(hào)通路，可抑制抑郁癥行為，其通過(guò)上調(diào)多種突觸發(fā)生相關(guān)蛋白 (4E-BPl、 p70S6K)的磷酸化水平，進(jìn)而提高神經(jīng)突觸的成熟程度和數(shù)量，產(chǎn)生抗抑郁效果。

石菖蒲具有開竅豁痰、 醒神益智等功效，可用于治療抑郁癥等精神疾患。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)[5]表明，石菖蒲湯對(duì)孤養(yǎng)結(jié)合慢性不可預(yù)知性應(yīng)激動(dòng)物抑郁模型有明顯的抗抑郁作用。但關(guān)于石菖蒲對(duì)抑郁癥模型中mTOR信號(hào)通路作用的研究較少。石菖蒲抗抑郁的機(jī)制仍不清楚。本研究建立孤養(yǎng)結(jié)合慢性應(yīng)激抑郁大鼠模型，觀察在形成抑郁的不同時(shí)間點(diǎn)，石菖蒲激活抑郁模型大鼠海馬mTOR通路相關(guān)蛋白表達(dá)的情況。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和分組 雄性健康(清潔級(jí))SD大鼠48只，體質(zhì)量200～220 g，由復(fù)旦大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部提供，動(dòng)物使用合格證號(hào): SYXK(滬)2009-0082。按照數(shù)字隨機(jī)方式，將大鼠分成4組：對(duì)照組、模型組、中藥組和西藥組，各12只。中藥組：石菖蒲(上海中醫(yī)藥大學(xué)提供)10 g·kg﹣1·d﹣1灌胃；西藥組:氟西汀(常州四藥制藥有限公司提供)1.3 mg·kg﹣1·d﹣1灌胃；模型組和對(duì)照組：0.9%氯化鈉液1.5 mL·kg﹣1·d﹣1灌胃。每日9:00開始灌胃，持續(xù)28 d。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料 Western組織裂解液、考馬斯亮藍(lán)蛋白檢測(cè)試劑盒由武漢博士德生物工程有限公司提供；兔抗人Akt、mTOR、p70S6K、elF-4E蛋白多克隆抗體和辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG由美國(guó)Santa Cruze公司提供。

1.3 孤養(yǎng)結(jié)合慢性不可預(yù)知性應(yīng)激抑郁模型建立[6]大鼠均單籠飼養(yǎng)，24 h禁食，通宵照明，48 ℃ 烘箱熱烘6 min，2℃ 冷水中游泳6 min，懸尾3 min，夾尾3 min，110 V電擊足底3 min，高速水平振蕩6 min。在21 d內(nèi)隨機(jī)使用以上刺激方法，每種刺激出現(xiàn)2次，每天1種；為使大鼠不能預(yù)料刺激的發(fā)生，同種刺激不能連續(xù)出現(xiàn)。

1.4 檢測(cè)指標(biāo)和方法 在實(shí)驗(yàn)的7、14、21和28 d，每組隨機(jī)選擇3只大鼠，進(jìn)行曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)，斷頭取腦，用Western印記法檢測(cè)mTOR通路相關(guān)蛋白的表達(dá)。

1.4.1 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn) 分別在7、14、21和28 d，進(jìn)行曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)。以動(dòng)物穿越曠場(chǎng)試驗(yàn)箱底面方塊數(shù)(四爪都進(jìn)入方格)為水平活動(dòng)得分；以兩前爪騰空或攀附墻壁為垂直活動(dòng)得分。每次實(shí)驗(yàn)5 min。

1.4.2 Western印記 提取海馬組織，根據(jù)組織樣品的光密度(D)值調(diào)節(jié)蛋白濃度，測(cè)定Akt、mTOR 、p70S6K和elF-4E蛋白相對(duì)表達(dá)量，用目的蛋白/GAPDH灰度值表示。

2 結(jié) 果

2.1 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn) 結(jié)果(表 1～2)表明：在21d、28d，與對(duì)照組比較，模型組大鼠水平運(yùn)動(dòng)、垂直運(yùn)動(dòng)得分減少(P<0.01)；在21、28d, 與模型組比較，中、西藥組水平運(yùn)動(dòng)和垂直運(yùn)動(dòng)得分增加(P<0.05、0.01)。

2.2 大鼠海馬Akt、mTOR、p70S6K和elF-4E蛋白表達(dá)情況 結(jié)果(表 3～6)表明：在21、28d，與對(duì)照組比較，模型組Akt、mTOR、p70S6K和elF-4E蛋白表達(dá)下調(diào)(P<0.01)；在21、28d，與模型組比較，中、西藥組Akt、mTOR、p70S6K和elF-4E蛋白表達(dá)上調(diào)(P<0.01)。

表1 各組大鼠水平運(yùn)動(dòng)評(píng)分比較 分; n=3,

**P<0.01與對(duì)照組比較；#P<0.05與模型組比較；##P<0.01與模型組比較

表2 各組大鼠垂直運(yùn)動(dòng)評(píng)分比較 分; n=3,

**P<0.01與對(duì)照組比較；#P<0.05與模型組比較；##P<0.01與模型組比較

表3 各組大鼠海馬Akt蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 %; n=3,

**P<0.01與對(duì)照組比較；##P<0.01與模型組比較

表4 各組大鼠海馬mTOR蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 %; n=3,

**P<0.01與對(duì)照組比較；##P<0.01與模型組比較

表5 各組大鼠海馬p70S6K蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 %; n=3,

**P<0.01與對(duì)照組比較；##P<0.01與模型組比較

表6 各組大鼠海馬eIF-4E蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 %; n=3,

**P<0.01與對(duì)照組比較;##P<0.01與模型組比較

3 討 論

石菖蒲具有廣泛的中樞神經(jīng)系統(tǒng)調(diào)節(jié)作用。本研究中，在石菖蒲和氟西汀治療后21 d、28 d，抑郁模型大鼠垂直運(yùn)動(dòng)評(píng)分和水平運(yùn)動(dòng)評(píng)分較模型組顯著提高，即抑郁模型大鼠對(duì)新鮮環(huán)境的好奇程度和活動(dòng)明顯改善。由此推斷，對(duì)于抑郁模型大鼠，石菖蒲有較好的抗抑郁效應(yīng)，在治療21 d效果尤為明顯，延長(zhǎng)治療時(shí)間，在28 d效應(yīng)仍明顯。

mTOR信號(hào)通路在抑郁癥發(fā)病和抗抑郁治療中的作用近年來(lái)受到關(guān)注。mTOR主要通過(guò)作用于p70S6K調(diào)控真核啟動(dòng)因子4E-BPl和S6K1，進(jìn)一步調(diào)節(jié)下游蛋白質(zhì)的翻譯[7]。Liu等[8]認(rèn)為，mTOR信號(hào)通路與突觸可塑性有關(guān)。Li等[4]對(duì)抑郁模型大鼠或抑郁癥死亡患者大腦皮質(zhì)的研究提示，壓力和抑郁可能導(dǎo)致前額皮質(zhì)錐體神經(jīng)元萎縮；激活mTOR信號(hào)通路可增加神經(jīng)突觸的數(shù)量及成熟程度，最終產(chǎn)生抗抑郁效果，而用mTOR拮抗劑阻斷mTOR途徑則可能加重抑郁行為。

本研究發(fā)現(xiàn)，大鼠海馬組織mTOR通路相關(guān)蛋白Akt、p70S6K和elF-4E表達(dá)在抑郁形成過(guò)程中呈下降趨勢(shì)，21 d、28 d模型組mTOR通路相關(guān)蛋白表達(dá)低于對(duì)照組，提示石菖蒲可能通過(guò)激活mTOR信號(hào)通路發(fā)揮其抗抑郁效應(yīng)；而Liu等[8]的研究表明，mTOR信號(hào)通路與蛋白質(zhì)合成與突觸可塑性有關(guān)，由此推斷，石菖蒲抗抑郁效應(yīng)的藥理機(jī)制可能與激活mTOR信號(hào)通路，繼而增加海馬蛋白質(zhì)合成與突觸可塑性有關(guān)，但仍需進(jìn)一步研究。

[ 1 ] Schmidt DR,Dantas RA,Marziale MH.Anxiety and depression among nursing professionals who work in surgical units[J].Rev Esc Enferm USP,2011,45(2):487-493.

[ 2 ] Hennessy MB,Deak T,Schiml-Webb PA.Stress-induced sickness behaviors: an alternative hypothesis for responses during maternal separation[J].Dev Psychobiol,2001,39(2):76-83.

[ 3 ] D' Aquila PS,Peana AT,Carboni V,et al.Exploratory behaviour and grooming after repeated restraint and chronic mildstress: effect of desipramine[J].Eur J Pharmacol,2000,399(1):43-47.

[ 4 ] Li N，Lee B，Liu RJ，et al. mTOR-dependent synapse formation underlies the rapid antidepressant effects of NMDA antagonists[J]．Science，2010，329(5994)：959-964．

[ 5 ] 李明亞, 陳紅梅. 石菖蒲對(duì)行為絕望動(dòng)物抑郁模型的抗抑郁作用[J]. 中藥材, 2001,244 (1):40-41 .

[ 6 ] Luo DD,An SC,Zhang X.Involvement of hippocampalserotonin and neuropeptide Y in depression induced by chronic unpredicted mild stress[J].Brain Res Bull,2008,77(1):8-12.

[ 7 ] 陳洪菊，屈 藝，母得志．mTOR信號(hào)通路的生物學(xué)功能[J]．生命的化學(xué)，2010，30(4)：555-561．

[ 8 ] Liu RJ，Aghajanian GK. Stress blunts serotonin and hypocretin-evoked EPSCs in prefrontal cortex: role of corticesterone-mediated apical dendritic trophy[J]．Proc Natl Acad Sci USA, 2008,105(1)：359-364.

[本文編輯] 姬靜芳

Effects of Rhizoma Acori Tatarinowii (Shi Chang Pu) on expression of mTOR signaling pathway related protein in hippocampus of depression model rats

WANG Peng, WU Yi-ming

Mental Health Center of Shanghai Yangpu District, Shanghai 200090, China

Objective： To explore the effects of rhizoma acori tatarinowii on mTOR signaling pathway in the hippocampus of depression model rats. Methods： The rat models with depression induced by isolation and chronic unpredictable stress were studied. Models were randomly divided into four groups and the rats of each group were intragastrically perfused with corresponding interventions at the 7th, 14th, 21st, and 28th day. The horizontal movement and vertical movement scores in the open field test were got, and the expressions of mTOR protein and Akt, p70S6K, elF-4E protein in the hippocampus were examined by Western blotting. Results： On the 21st and 28th day, the horizontal motion and vertical motion scores in the open field test of the model group was lower than those of the control group(P<0.01).The horizontal motion and vertical motion scores in the open field test of Chinese medicine group and western medicine group were higher than those of the model group (P<0.05 andP<0.01). On the 21st and 28th day, mTOR, Akt, p70S6K or elF-4E protein expressions in the hippocampus of the rats in the model group were lower than those in the control group (P<0.01). The expressions of mTOR protein and Akt, p70S6K, elF-4E protein in the hippocampus of the rats in Chinese medicine group and western medicine group were higher than those in the model group (P<0.01). Conclusions： The anti-depressant effect of rhizoma acori tatarinowii can be realized by upregulating mTOR, Akt, p70S6K or elF-4E protein expressions in the hippocampus.

rhizoma acori tatarinowii; depression; mTOR signaling pathway

2015-12-06 [接受日期] 2016-04-08

王 鵬，住院醫(yī)師. E-mail:159106841@qq.com

10.12025/j.issn.1008-6358.2016.20150888

短篇論著

R 971+.4

A