林巧，鞏發(fā)永，肖詩明

（西昌學(xué)院苦蕎麥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川西昌 615000）

HPLC檢測苦蕎制品中黃曲霉毒素B1的可行性探討

林巧，鞏發(fā)永，肖詩明

（西昌學(xué)院苦蕎麥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川西昌 615000）

本試驗(yàn)對HPLC測定苦蕎制品中AFB1的可行性進(jìn)行研究，研究HPLC法測定黃曲霉毒素B1的標(biāo)準(zhǔn)曲線、準(zhǔn)確度、精密度、系統(tǒng)誤差、靈敏度，結(jié)果表明HPLC分析方法的檢測范圍0.20μg/L～200.00μg/L，判定系數(shù)R2=0.996 8，各個(gè)數(shù)據(jù)的相對誤差分別是7.09%、5.28%、4.55%、0.23%，苦蕎芯粉平均加標(biāo)回收率為84.58%，檢測出苦蕎面、苦蕎羹、苦蕎茶中黃曲霉毒素Bl的變異系數(shù)分別是9.36%、5.25%、8.22%。檢測靈敏度最低檢測限0.20μg/L。

HPLC；黃曲霉毒素B1；苦蕎制品；方法學(xué)

本試驗(yàn)試圖對HPLC法定量檢測黃曲霉毒素B1的可行性進(jìn)行的系統(tǒng)研究。通過研究HPLC法測定黃曲霉毒素B1的標(biāo)準(zhǔn)曲線、精密度、靈敏度、準(zhǔn)確度和不同苦蕎制品對檢測結(jié)果的影響，建立了HPLC方法評價(jià)指標(biāo)，確立了HPLC定量分析的質(zhì)控參數(shù)，證實(shí)HPLC方法用于苦蕎制品中黃曲霉毒素B1檢測具有可行性。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)試劑和材料

三氟乙酸、正己烷、乙腈、黃曲霉素B1標(biāo)準(zhǔn)品：中國標(biāo)準(zhǔn)計(jì)量局；苦蕎面、苦蕎羹、苦蕎粉、苦蕎茶：西昌航飛苦蕎科技發(fā)展有限公司。

1.2 儀器和設(shè)備

高效液相色譜系統(tǒng)（反相C18柱，熒光檢測器）：安捷倫科技有限公司；HZK-FA210電子天平：美國華志；臺式高速冷凍離心機(jī)：上海趙迪。

1.3 方法

1.3.1 繪制HPLC檢測毒素B1的標(biāo)準(zhǔn)曲線

為了考察HPLC范圍，需繪制HPLC黃曲霉毒素B1的標(biāo)準(zhǔn)曲線。將黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)液濃度按0.00、25.00、50.00、100.00、200.00μg/L依次加到高效液相色譜中，并嚴(yán)格按照HPLC的檢測步驟依次操作，測得峰面積，以標(biāo)液濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)來繪制檢測曲線。

1.3.2 HPLC檢測曲霉毒素B1的準(zhǔn)確度

用相對誤差來衡量該方法的準(zhǔn)確度[7]。為了研究

用HPLC測定黃曲霉毒素B1的準(zhǔn)確度，精確吸取0.00、25.00、50.00、100.00、200.00μg/L黃曲霉毒素B1標(biāo)品溶液20μL重復(fù)進(jìn)樣3次可以計(jì)算出相對誤差，相對誤差應(yīng)小于10%。

1.3.3 HPLC測定黃曲霉毒素B1的系統(tǒng)誤差

用樣品加標(biāo)回收率試驗(yàn)來衡量該方法的系統(tǒng)誤差[8]。為研究HPLC測定黃曲霉毒素Bl的系統(tǒng)誤差，將濃度為12.50、25.00、50.00、100.00、200.00μg/L的黃曲霉毒素標(biāo)液，分別添加50μL到5.00 g的苦蕎粉樣品中，制備不同污染程度的樣品[9]，按照測定苦蕎樣品中黃曲霉素B1的含量。回收率不低于70%[10]。

式中：P為加標(biāo)回收率，%；C1為試樣濃度，μg/L；C2為加標(biāo)試樣濃度，μg/L；C3為加標(biāo)量，μg/L。

1.3.4 HPLC檢測曲霉毒素B1的精密度

用變異系數(shù)來衡量該方法的精密度[11]。為了研究HPLC測定黃曲霉毒素B1的精密度，分別取5.0g苦蕎粉、苦蕎茶、苦蕎面樣品5份，處理后測定黃曲霉毒素B1的含量，并按照下列公式計(jì)算其變異系數(shù)，變異系數(shù)CV越小，精密度越好。當(dāng)HPLC法的變異系數(shù)的值小于10%時(shí)[10]，可認(rèn)為該試驗(yàn)的精密度好。

式中：SD為標(biāo)準(zhǔn)偏差；Xi為樣品中霉毒素B1的含量，μg/kg；X為黃曲霉毒素B1的平均含量，μg/kg；n為樣品組數(shù)；CV為變異系數(shù)，%。

1.3.5 HPLC檢測曲霉毒素B1的靈敏度

用信噪比來衡量該方法的靈敏度[12]。為了研究HPLC測定黃曲霉毒素B1的靈敏度，先進(jìn)空白溶劑，測出噪音峰高N。再進(jìn)樣0.10、0.15、0.20、0.25μg/L的黃曲霉毒素B1標(biāo)品，當(dāng)檢測濃度的色譜峰高是噪音色譜峰高的3倍，即信噪比S/N=3時(shí)，該濃度即為最小檢測濃度。

1.4 HPLC檢測曲霉毒素B1含量的方法

1.4.1 樣品的處理及制備

取5 g粉碎苦蕎樣品至50mL的離心管中，加入20mL乙腈-水（84+16，體積比）提取液，在電動(dòng)振蕩器上震蕩30min，1000 r/min真空離心15min，取上清液。

1.4.2 試樣凈化

移取約8mL上清液至多功能凈化柱，插入玻璃管中并緩慢推動(dòng)填料管，收集凈化液。

1.4.3 試樣衍生化

將2μL凈化液轉(zhuǎn)移塞小瓶中，注意避光。在烘干機(jī)中（85±1）℃吹干。加入100μL三氟乙酸和200μL正己烷，密閉混勻30 s后，在（40±1）℃烘干箱中衍生15min再用溫吹干。以水-乙腈（85+15，體積比）200μL溶解，混勻30 s，1 000 r/min真空離心15min，取上清液樣品瓶中備用。

1.4.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

準(zhǔn)確移取2.00μg/mL黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)品1mL至10mL容量瓶中，配置濃度為200.00μg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液；取5mL濃度為200.00μg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液至10mL容量瓶中配制成100.00μ/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液；取5mL濃度為100.00μg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液至10mL容量瓶中配制成50.00μg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液；取5mL濃度為50.00μg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液至10mL容量瓶中配制成25.00μg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液；吸取標(biāo)準(zhǔn)溶液200μL，在烘干機(jī)中85℃吹干，衍生化方法同1.4.3。

1.4.5 測定及條件

色譜柱：4.6mm×150mm，5μm，C18；柱溫：30℃；流動(dòng)相：乙腈（色譜純）17%，水83%；流速：0.50mL/min；進(jìn)樣量：20μL；熒光檢測器：激發(fā)波長：360 nm：發(fā)射波長440 nm[13]。

1.4.6 測定

以標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積對濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過保留時(shí)間的比較確定黃曲霉毒素B1的峰，根據(jù)峰面積計(jì)算試樣中黃曲霉毒素B1含量。計(jì)算樣品中黃曲霉毒素B1的濃度：

式中：C為試樣中黃曲霉毒素B1的濃度，μg/L；A為試樣按照外標(biāo)法在標(biāo)準(zhǔn)曲線中對應(yīng)的濃度，μg/L；V為試樣提取液體積，mL；m為試樣的取樣量，g；f為試樣溶液衍生后較衍生前的濃縮倍數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 HPLC檢測曲霉毒素B1的標(biāo)準(zhǔn)曲線

將黃曲霉毒素 B1標(biāo)準(zhǔn)液濃度按 0.00、25.00、50.00、100.00、200.00μg/L依次衍生后在激發(fā)波長為360 nm，發(fā)射波長為440 nm柱溫為30℃的條件下分別進(jìn)樣20μL，測定出AFB1的峰面積，見圖1，黃曲霉毒素B1樣品色譜圖見圖2。

圖1 黃曲霉毒素B1標(biāo)品色譜圖Fig.1 The chromatogram of the AFB1

圖2 黃曲霉毒素B1樣品色譜圖Fig.2 The chromatogram of the AFB1

以峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，黃曲霉毒素B1的濃度為橫坐標(biāo)，得回歸方程Y=0.074 1X+0.033，R2= 0.9968，黃曲霉毒素B1含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線。黃曲霉素B1含量高并且判定系數(shù)為0.996 8接近1，說明在0.20μg/L～200.00μg/L范圍內(nèi)HPLC法所繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性相關(guān)性較好。HPLC檢測霉毒素B1的標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖3。

圖3 HPLC檢測霉毒素B1的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 HPLC standard curvemethod for thedeterm ination of aflatoxin B1

2.2 HPLC檢測曲霉毒素B1的準(zhǔn)確度

黃曲霉毒素B1標(biāo)液精確吸取0.00、25.00、50.00、100.00、200.00μg/L黃曲霉毒素B1標(biāo)品溶液20μL重復(fù)進(jìn)樣3次可以計(jì)算出相對誤差，見表1。

表1 HPL檢測曲霉毒素B1的準(zhǔn)確度Table1 Accuracy of HPLC for determ ination of aflatoxin B1

由表1可知HPLC法中各個(gè)數(shù)據(jù)的相對誤差分別是7.09%、5.28%、4.55%、0.23%均在國家規(guī)定的10%以內(nèi)，說明HPLC法的準(zhǔn)確度良好。

2.3 HPLC檢測曲霉毒素B1的系統(tǒng)誤差

該方法的系統(tǒng)誤差用樣品加標(biāo)回收率試驗(yàn)來衡量，別為12.50、25.00、50.00、100.00、200.00μg/L的黃曲霉毒素標(biāo)液，添加50μL到5.00 g的苦蕎粉樣品中，制備不同污染程度的樣品，加標(biāo)樣品經(jīng)提取、凈化和衍生后，按照HPLC法測定加標(biāo)樣品中黃曲霉素B1的含量，見表2。

表2 HPLC檢測蕎芯粉中黃曲霉毒素B1的回收率Table2 Determ ination of Tartary Buckwheat core powderrecovery of aflatoxin B1in the rateof HPLCmethod

由表2可知，在12.50μg/L～200.00μg/L范圍內(nèi)，本方法的加標(biāo)回收率介于80.20%～89.50%之間，符合技術(shù)要求；平均回收率是84.58%，高于最低回收率70%，說明HPLC法的系統(tǒng)誤差在符合要求內(nèi)。

2.4 HPLC檢測曲霉毒素B1的精密度

為了研究HPLC測定黃曲霉毒素B1的精密度，分別取5.00 g苦蕎面、苦蕎羹、苦蕎茶樣品5份，處理后測定黃曲霉毒素B1的含量，計(jì)算其變異系數(shù)，見表3。

表3 HPLC法檢測黃曲霉毒素B1的精密度Table3 The precision of HPLCm ethod for thedeterm ination ofaflatoxin B1

由表3可知，HPLC測定苦蕎面、苦蕎羹、苦蕎茶中黃曲霉毒素B1的變異系數(shù)分別是9.36%、5.25%、8.22%，國標(biāo)GB/T17480-2008《食品中黃曲霉毒素B1的測定酶聯(lián)免疫吸附法》規(guī)定變異系數(shù)應(yīng)小于10%，以上數(shù)據(jù)均小于10%，說明HPLC法的精密度良好。

2.5 HPLC檢測曲霉毒素B1的靈敏度

先進(jìn)0μg/L黃曲霉毒素B1標(biāo)品，測出出峰附近噪

音信號N為0.0015 mAU，再進(jìn)樣0.10、0.15、0.20、0.25μg/L的黃曲霉毒素B1標(biāo)品，測出信號S，計(jì)算由S/N，見表4。

表4 HPLC檢測黃曲霉毒素B1的靈敏度Table4 Sensitivity of HPLC for determ ination of aflatoxin B1

由表4可知，當(dāng)黃曲霉毒素Bl濃度為0.20μg/L時(shí)，色譜峰高為噪音峰高的3倍。因此HPLC的最低檢測濃度為0.20μg/L。

3 討論與結(jié)論

本試驗(yàn)建立了HPLC分析方法的質(zhì)控參數(shù)并對苦蕎制品檢測性能和可靠性作了詳細(xì)的分析。結(jié)果顯示：HPLC法的繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，判定系數(shù)R2=0.996 8接近1，符合檢測要求；在0.20μg/L～200.00μg/L范圍內(nèi)，苦蕎粉的加標(biāo)回收率介于80.20%～89.50%之間，符合技術(shù)要求；平均回收率是84.58%，高于最低回收率70%。HPLC測定苦蕎面、苦蕎羹、苦蕎茶中黃曲霉毒素B1的變異系數(shù)分別是9.36%、5.25%、8.22%，小于10%，符合國標(biāo)GB/T17480-2008《食品中黃曲霉毒素B1的測定酶聯(lián)免疫吸附法》規(guī)定要求，HPLC法中最低檢測濃度為0.20μg/L。

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The Feasible Discussion about A flatoxin B1Determ ination in Tartary Buckwheat Products by HPLC

LINQiao，GONGFa-yong，XIAOShi-ming
（Buckwheat Laboratory of Xichang College，Xichang 615000，Sichuan，China）

Feasibility ofdeterminingaflatoxin B1in tartary buckwheatproductsby HPLCwas researched by analyzing the standard curve，accuracy，precision，the system error and sensitivity.The results showed thatusing HPLC to determine the aflatoxin B1in tartary buckwheat products，the detection range was 0.20μg/L～200.00μg/L，determination coefficientR2was0.996 8，the relative errorwas7.09%、5.28%、4.55%、0.23% respectively，theaverage recovery ofstandard addition in buckwheatcore flourwas84.58%，the variation coefficientofbuckwheatnoodles，buckwheatsoup and buckwheat teawas9.36%，5.25%，8.22%respectively，and the detection sensitivity reached 0.20μg/L.

HPLC；aflatoxin B1；tartarybuckwheatproducts；methodology

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.23.034

2016-01-28

四川省教育廳重點(diǎn)科研基金項(xiàng)目（13ZA0157）

林巧（1978—），女（漢），副教授，碩士，研究方向：食品品質(zhì)與安全管理。