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        HPLC-ICP-MS聯(lián)用技術測定水產(chǎn)品中的汞形態(tài)

        2016-12-13 03:48:46陳巖劉永濤趙曉麗楊慧耿安靜王富華
        食品研究與開發(fā) 2016年23期
        關鍵詞:甲基汞乙基水產(chǎn)品

        陳巖,劉永濤,趙曉麗,楊慧,耿安靜,王富華,3,*

        (1.廣東省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品公共監(jiān)測中心,廣東廣州510640;2.農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質量安全風險評估實驗室(廣州),廣東廣州510640;3.農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質量安全檢測與評價重點實驗室,廣東廣州510640;4.中國水產(chǎn)科學研究院長江水產(chǎn)研究所,湖北武漢430223)

        HPLC-ICP-MS聯(lián)用技術測定水產(chǎn)品中的汞形態(tài)

        陳巖1,2,劉永濤3,4,趙曉麗1,楊慧1,2,耿安靜1,王富華1,2,3,*

        (1.廣東省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品公共監(jiān)測中心,廣東廣州510640;2.農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質量安全風險評估實驗室(廣州),廣東廣州510640;3.農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質量安全檢測與評價重點實驗室,廣東廣州510640;4.中國水產(chǎn)科學研究院長江水產(chǎn)研究所,湖北武漢430223)

        建立了鹽酸超聲輔助提取-HPLC-ICP-MS測定水產(chǎn)品中汞形態(tài)的分析方法。通過對水產(chǎn)樣品進行預先脫脂,以5mol/L鹽酸為提取劑,超聲水浴提取60min。以95%A相(10mmol/L乙酸銨+0.12%L-半胱氨酸)和5%B相(無水乙醇)作為流動相,經(jīng)C18反相高效液相色譜柱(4.6mm×150mm,5μm)等度洗脫,202Hg為ICP-MS的檢測離子,5min實現(xiàn)3種形態(tài)汞的完全分離。本方法的線性范圍為0~100μg/L(r≥0.999 3),檢出限為0.11μg/L~0.19μg/L,加標回收率為79.84%~92.76%,RSD為2.86%~6.72%(n=6)。該方法具有分離時間短、綠色環(huán)保、靈敏度高、回收率滿意等特點。

        高效液相色譜;電感耦合等離子體質譜;汞;超聲輔助提?。恍螒B(tài)分析

        汞是影響人類健康和生態(tài)環(huán)境最具危害性的元素之一,它以各種各樣的物理或化學形式存在。近年來,隨著水環(huán)境污染的日益嚴重,水產(chǎn)動植物通過直接吸收富集、食物鏈的生物放大等作用在體內(nèi)富集相當數(shù)量的汞,水產(chǎn)品的攝取已成為人類暴露于汞的主要途徑[1]。汞的常見形態(tài)有元素汞(Hg0)、無機汞(Hg2+及其化合物)和有機汞(甲基汞MeHg和乙基汞EtHg),不同形態(tài)汞的特性決定了其復合物分布、生物學富集和毒性,其中甲基汞的毒性最大[2]。因此,如何快速準確測定汞形態(tài)對水產(chǎn)品中汞的安全風險評估至關重要。

        目前,基于色譜分離技術與原子光譜或質譜等檢測技術聯(lián)用技術被認為是樣品中汞形態(tài)分析較理想的方法,包括高效液相色譜-原子熒光光譜法(HPLCAFS)[3-5]、氣相色譜-原子熒光光譜法(GC-AFS)[6]、高效液相色譜-電感耦合等離子體質譜法(HPLC-ICP-MS)[7]、氣相色譜-電感耦合等離子體質譜法(GC-ICP-MS)[8]等。盡管HPLC-AFS法被認定為我國食品安全標準中甲基汞測定的規(guī)定方法[9],其靈敏度與液相色譜-電感耦合等離子體質譜法相比仍有待較大的改善。隨著ICP-MS儀器國產(chǎn)化的推進,HPLC-ICP-MS必將成為食品中汞形態(tài)分析的常用方法。本研究在以往HPLCICP-MS研究的基礎上,通過對樣品前處理及色譜分離條件進行合理優(yōu)化,獲得一種更加綠色環(huán)保的汞形態(tài)測定方法,該方法適用于水產(chǎn)品中不同形態(tài)汞的分析檢測。

        1 材料與方法

        1.1 儀器與試劑

        Agilent1260高效液相色譜儀-Agilent7700x型電感耦合等離子體質譜儀、ZORBAX SB C18色譜柱(4.6×150mm,5μm)、Eclipse plusC18色譜柱(4.6mm× 150mm,5μm):美國Agilent公司;ETHOSOne微波消解系統(tǒng):意大利Milestone公司;AL204型電子天平:瑞士Mettler Toledo公司;Milli-Q型純水系統(tǒng):美國Millipore公司。

        乙醇(色譜純)、L-半胱氨酸(純度99%)、乙酸銨(純度99.99%)、氨水(色譜純)、鹽酸(優(yōu)級純)、氫氧化鉀(優(yōu)級純):阿拉丁試劑公司;甲基汞標準溶液(GBW 08675,濃度76.6μg/g±2.9μg/g)、乙基汞溶液標準物質(GBW(E)08152,濃度75.3μg/g±2.8μg/g)、紫菜成分分析標準物質(GBW10023)、生物成分分析標準物質(大蝦,GBW10050):中國計量科學研究院;無機汞(Part#8500-6940,濃度10mg/L):美國Agilent公司;魚、紫菜、海帶等水產(chǎn)品樣品:購自廣州市區(qū)大型超市。

        1.2 方法

        1.2.1 樣品制備

        本課程教學大綱以一個與授課專業(yè)相關的專題項目——專題數(shù)據(jù)庫管理系統(tǒng)的具體實現(xiàn)為項目案例,對課程學時分配、教學目標、教學任務、各單元教學內(nèi)容及基本要求、課程考核等進行設計。以項目數(shù)據(jù)庫系統(tǒng)的設計、應用開發(fā)為案例,貫穿教學全過程,即通過這個實際數(shù)據(jù)庫應用開發(fā)項目的層層推進,使學生在學習解決問題的過程中,學會數(shù)據(jù)庫的應用技術、原理和工具的使用,培養(yǎng)學生成為能夠勝任生產(chǎn)、服務、技術和管理工作的高素質勞動者和高級技術應用型人才。

        將市場上購買的魚類樣品去除頭、骨及內(nèi)臟部分,切成小塊狀后用勻漿機攪碎,放置于-18℃冰箱內(nèi)保存。紫菜和海帶樣品用剪刀剪碎后用粉碎機制成粉末。

        1.2.2 總汞的測定

        參照GB 5009.17-2014《食品安全國家標準食品中總汞及有機汞的測定》的方法,即稱取1.0 g混勻樣品于50mL消解罐中,加入8mL硝酸,于微波消解儀上消解。消解完畢后轉移至25mL容量瓶,定容至刻度,搖勻后在原子熒光光譜儀上測定[9]。樣品測定過程中以紫菜(GBW10023)和大蝦(GBW 10050)兩種標準物質作為質控樣。

        1.2.3 汞形態(tài)的測定

        稱取約5.0 g樣品于50mL離心管中,加入10mL丙酮,渦旋1min,3 500 r/min離心5min,傾掉丙酮溶液。準確加入10mL 5mol/LHCl溶液,渦旋混勻,室溫下在超聲水浴中萃取60min,再用濃氨水調(diào)節(jié)pH值至中性,以3 500 r/min的速度離心20min,收集上清液,過0.45μm濾膜后進行HPLC-ICP-MS測定。

        1.2.3.1 高效液相色譜(HPLC)條件

        色譜柱為Agilent ZORBAX SBC18色譜柱,流動相為5%乙醇-10mmol/L乙酸銨-0.1%半胱氨酸,pH 7.50,流速為1.0mL/min,進樣體積為10μL。

        1.2.3.2 電感耦合等離子體質譜(ICP-MS)條件

        2 結果與討論

        2.1 樣品前處理優(yōu)化

        樣品前處理過程中保證待測組分形態(tài)的穩(wěn)定和提取完全是檢測結果準確的重要因素之一。魚類水產(chǎn)品由于富含蛋白質、脂肪等有機物,基質比較復雜。本試驗通過在提取前加入少量丙酮去除樣品中的脂肪,有效避免直接提取過程產(chǎn)生的乳化現(xiàn)象。酸、堿提取是常見的汞提取方法,在強酸強堿作用下,結合在魚肉樣品蛋白質巰基上的脂溶性有機汞可得到有效釋放[10-12]。由于強堿提取過程中更容易發(fā)生甲基汞和汞之間的形態(tài)轉化[10]。因此,本試驗確定在樣品經(jīng)丙酮脫

        脂后,借鑒Reye等人的研究結果[13],選擇以5mol/L的鹽酸作為提取劑。

        2.2 提取條件的選擇

        2.2.1 絡合劑的選擇

        在反相HPLC分離汞化合物時,需要加入少量的絡合劑與待測物形成不同極性的復合物,有機硫化合物如L-半胱氨酸、2-巰基乙醇則是常用的絡合劑[14]。不同絡合劑對3種形態(tài)汞的色譜圖影響見圖1。

        圖1 不同絡合劑對3種形態(tài)汞的色譜圖影響Fig.1 Chromatogram sof Hg2+,methylmercury and ethylmercury w ith different complex agents in themobile phase

        由圖1可知,本研究采用5%體積比甲醇、10 mmol/L乙酸銨、0.12%質量體積比L-半胱氨酸為流動相時,大約5min就能實現(xiàn)3種汞化合物的完全分離;而當以巰基乙醇代替L-半胱氨酸時,Hg2+和甲基汞存在嚴重的峰重疊無法完全分離,乙基汞的出峰時間延長至30min。若以乙醇、乙腈代替甲醇,Hg2+和甲基汞的峰更是完全重合。除此之外,L-半胱氨酸作為流動相時的峰信號要明顯強于巰基乙醇,且?guī)€基乙醇具有強烈的惡臭味,綜合考慮選擇0.12%L-半胱氨酸作為絡合劑。

        2.2.2 有機相的選擇

        甲醇、乙腈是色譜分離中常用的有機相,乙醇則因為黏度大很少作為流動相。本研究分別比較了含有5%的甲醇、乙醇、乙腈3種有機相對3種汞化合物分離時間、采集信號強度及柱壓的影響。流動相中有機相組成對3種形態(tài)汞的色譜圖影響見圖2。

        圖2 流動相中有機相組成對3種形態(tài)汞的色譜圖影響Fig.2 Chromatogramsof Hg2+,methylm ercury and ethylmercury at thepresenceof differentorganic components in them obile phase

        由圖2發(fā)現(xiàn),以上3種有機相作為流動相組分均可以實現(xiàn)3種汞化合物的完全分離,但分離時間為甲醇>乙醇≈乙腈,對柱壓的影響為乙醇>甲醇>乙腈,等離子體質譜信號強度三者沒有顯著區(qū)別。由于流動相僅含有5%的有機相,由5%乙醇引起的色譜系統(tǒng)柱壓增加影響有限(62MPa增加至66MPa),但相比甲醇和乙腈,具有分離時間短、試劑消耗少、綠色環(huán)保等優(yōu)點,因此選擇5%的乙醇作為流動相中有機相。

        2.2.3 色譜柱的選擇

        分別采用ZORBAXSBC18和EclipseplusC18色譜柱對3種汞化合物進行比較分析,相應的譜圖見圖3。

        由圖3發(fā)現(xiàn),通過所確定的中性pH流動相,兩根色譜柱都能實現(xiàn)3種汞化合物的完全分離,且分離時間、出峰位置均無明顯區(qū)別(圖3),但ZORBAX SBC18色譜柱的耐水性更強,而流動相中有機相過高,容易引起ICP-MS錐口堵塞和等離子體火焰不穩(wěn)定而熄火,因此ZORBAX SBC18色譜柱更適用于本研究中僅含5%有機相的流動相體系。

        圖3 不同色譜柱對3種形態(tài)汞的色譜圖影響Fig.3 Chromatogramsof Hg2+,methylmercury and ethylm ercury under different chromatographic columns

        2.3 汞的形態(tài)分析

        2.3.1 標準曲線與檢出限

        配制0、1、5、10、20、40、100μg/L的無機汞(Hg2+)、甲基汞和乙基汞的混合標準溶液于最佳儀器條件下進行測試,以標準溶液濃度對積分面積進行線性擬合,繪制標準曲線。以3倍信噪比(S/N)確定無機汞(Hg2+)、甲基汞和乙基汞的檢出限。線性方程、相關系數(shù)及檢出限見表1。

        表1 無機汞(Hg2+)、甲基汞和乙基汞的線性方程、相關系數(shù)及檢出限Table1 Regression equations,correlation coefficientsand detection lim itsof Hg2+,m ethylm ercury and ethylmercury

        2.3.2 精密度和回收率

        精密稱取同一魚肉樣品和紫菜樣品各12份,分別進行高、中、低兩個濃度的加標回收試驗,按照1.2.3的方法測定,結果見表2。

        由表2可知,高、中、低加標濃度水平下,不同樣品基質(動物性基質魚肉和植物性基質紫菜)中3種形態(tài)汞加標回收率分別為79.84%~88.60%和82.40%~92.76%,相對標準偏差(n=6)為2.99%~6.72%和2.86%~5.61%,表明該方法具有較高的回收率和精密度,適合動、植物性水產(chǎn)品汞形態(tài)的分析檢測。

        表2 不同樣品基質下3種形態(tài)汞的加標回收率Table2 Recoveriesof Hg2+,m ethylmercury and ethylmercury with differentsam plematrixesspiked at two levels(n=6)

        2.4 樣品的分析

        將采集的12種水產(chǎn)樣品經(jīng)上述前處理后,用原子熒光光譜法測定水產(chǎn)品中的總汞含量,同時采用本研究的HPLC-ICP-MS方法分析水產(chǎn)品中的汞形態(tài),并比較總汞含量與各形態(tài)汞含量的加和值,結果見表3。

        表3 水產(chǎn)樣品中3種形態(tài)汞化合物及總汞含量測定結果Table3 Contentsof Hg2+,methylmercury,ethylm ercury and total m ercuy in aquatic samples

        由結果可知,兩種結果比值在85.2%~120.4%之間,測定魚肉及紫菜海帶等樣品中總汞含量較低,其中汞的形態(tài)以甲基汞為主,同時存在少量無機汞。根據(jù)我國食品安全國家標準的規(guī)定,水產(chǎn)動物中甲基汞衛(wèi)生限量為0.5mg/kg,肉食性魚類及制品為1.0mg/kg[15]。本研究所測水產(chǎn)品中甲基汞的含量均未超標。

        3 結論

        高效液相色譜-電感耦合等離子體質譜已逐漸成為重金屬形態(tài)分析的重要技術手段。本研究在以往研究的基礎上,通過對樣品前處理過程進行適當優(yōu)化,并以無毒的乙醇代替常用的甲醇、乙腈等作為有機相,以L-半胱氨酸作為絡合劑,5min內(nèi)實現(xiàn)Hg2+、甲基汞、乙基汞3種汞形態(tài)的分析,具有分離時間短、綠色環(huán)保、靈敏度高、回收率滿意等優(yōu)點,適用于水產(chǎn)品中汞的形態(tài)分析。

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        Determ ination of M ercury Species in Aquatic Products by HPLC-ICP-MS

        CHENYan1,2,LIU Yong-tao3,4,ZHAOXiao-li1,YANGHui1,2,GENGAn-jing1,WANG Fu-hua1,2,3,*
        (1.Public Monitoring Center for Agro-product,Guangdong Academy of Agricultural Science,Guangzhou 510640,Guangdong,China;2.Laboratory ofQuality&Safety Risk Assessment for Agro-product(Guangzhou),Ministry of Agriculture,Guangzhou 510640,Guangdong,China;3.Key Laboratory of Testing and Evaluation for Agro-productSafety and Quality,Ministry ofAgriculture,Guangzhou 510640,Guangdong,China;4.Yangtze River FisheriesResearch Institute,Chinese Academy of Fishery Sciences,Wuhan 430223,Hubei,China)

        HPLC-ICP-MS technique for determination of threemecury species in aquatic productswas developed.Fat in the aquatic sampleswas firstly removed by acetone,different speciation ofmercury was then extracted by 5mol/L hydrochloric acid solution for 60min with the assistof ultrasound bath.The separation was carried outon a C18 column(4.6mm×150mm,5μm)with 95%A phase containing 10mmol/L ammonium acetate and 0.12%L-cysteine and 5%ethanol.202Hgwas selected as detection ion of ICP-MS.Threemercury species was completely separated in fiveminutes.The calibration curves were linear within the range of 0-100μg/L(r≥0.999 3),and the detection limits were 0.11μg/L-0.19μg/L.The recoveries for Hg2+,methylmercuryand ethylmercurywere79.84%-92.76%,and relative standard deviations(RSD)were2.86%-6.72%(n=6).Themethod has the characteristicsofshortseparation time,green,high sensitivity,and satisfactory recovery rate.

        high performance liquid chromatography;inductively coupled plasma mass spectrometry;mercury;ultrasonic-assisted extraction;speciation analysis

        10.3969/j.issn.1005-6521.2016.23.030

        2016-02-22

        國家自然科學基金項目(41401367);廣東省農(nóng)業(yè)攻關項目(2012A020100002);廣東省促進科技服務業(yè)發(fā)展計劃項目(2012B040302012)

        陳巖(1982—),男(漢),助理研究員,博士研究生,研究方向:食品安全檢測及標準法規(guī)研究。

        *通信作者:王富華(1962—),男(漢),研究員,研究方向:農(nóng)產(chǎn)品質量安全。

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