代名君，尤麗新，文連奎，*，殷涌光

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林長(zhǎng)春130118；2.長(zhǎng)春科技學(xué)院生物食品學(xué)院，吉林長(zhǎng)春130600；3.吉林大學(xué)生物與農(nóng)業(yè)工程學(xué)院，吉林長(zhǎng)春130022）

高壓脈沖電場(chǎng)輔助提取葛花黃酮工藝優(yōu)化

代名君1，尤麗新2，文連奎1，*，殷涌光3

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林長(zhǎng)春130118；2.長(zhǎng)春科技學(xué)院生物食品學(xué)院，吉林長(zhǎng)春130600；3.吉林大學(xué)生物與農(nóng)業(yè)工程學(xué)院，吉林長(zhǎng)春130022）

以乙醇為溶劑，采用高壓脈沖電場(chǎng)輔助提取葛花黃酮，以黃酮得率為指標(biāo)，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面法考察乙醇濃度、料液比、電場(chǎng)強(qiáng)度、脈沖數(shù)對(duì)葛花黃酮得率的影響并確定最佳工藝條件。試驗(yàn)結(jié)果表明：乙醇濃度60%，料液比1∶32（g/mL），電場(chǎng)強(qiáng)度16 kV/cm，脈沖數(shù)8個(gè)，此時(shí)黃酮得率為10.373%。

高壓脈沖電場(chǎng)；提取；葛花；黃酮

葛花（Pueraria lobata）為豆科植物葛的干花蕾，又名葛條花，是我國(guó)的傳統(tǒng)藥物[1]。葛花性味甘涼，含有黃酮類(lèi)、皂苷類(lèi)、甾醇類(lèi)、香豆素類(lèi)以及生物堿類(lèi)等活性成分，并含有多種無(wú)機(jī)元素及揮發(fā)油成分。研究表明，葛花具有解酒醒脾[2]，降血糖降血脂[3-4]、改善學(xué)習(xí)記憶等功效[5-6]。葛花中的黃酮類(lèi)、皂苷類(lèi)等有效成分具有良好的生理活性[7]，在免疫系統(tǒng)及內(nèi)分泌系統(tǒng)中發(fā)揮協(xié)調(diào)作用，可有效改善因酒精引起的新陳代謝異常等情況。

傳統(tǒng)工藝對(duì)葛花黃酮的提取方法有：有機(jī)溶劑提取法[8-9]、微波輔助提取法[10]、超聲波提取法[11]。高壓脈沖電場(chǎng)是一種具有非熱特性的新型技術(shù)，它穿透力強(qiáng)，對(duì)食品處理均勻、徹底[12-13]，因在常溫常壓條件下，可通過(guò)瞬時(shí)破壁使細(xì)胞膜通透性發(fā)生變化，從而使物質(zhì)溶出，故可利用其提取植物有效成分[14]，但未見(jiàn)高壓脈沖電場(chǎng)提取葛花黃酮的報(bào)道。本文采用高壓脈沖電

場(chǎng)法提取葛花黃酮，并對(duì)葛花黃酮的提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化，從而保留黃酮的生物活性，以期為合理利用葛花資源及功能性保健食品的研發(fā)，提供科學(xué)的數(shù)據(jù)，奠定堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

葛花：市售無(wú)霉變干制品；鳶尾苷標(biāo)準(zhǔn)品：阿拉丁試劑（上海）有限公司；無(wú)水乙醇：北京化工廠。

1.2 主要儀器與設(shè)備

高壓脈沖電場(chǎng)設(shè)備：吉林大學(xué)研制；JY92-II超聲波細(xì)胞破碎儀：寧波新芝生物科技股份有限公司；紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（UV2100型）：UNICO公司；大容量多管離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；FW100型高速萬(wàn)能粉碎機(jī)：天津市泰斯特儀器有點(diǎn)公司；YD4002型電子天平：上海佑科儀器儀表有限公司；HH-4A數(shù)顯恒溫水浴鍋：常州普天儀器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 高壓脈沖電場(chǎng)法提取葛花黃酮得率的測(cè)定

1.3.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確稱取5mg鳶尾苷標(biāo)準(zhǔn)品，用70%乙醇配制成濃度為200μg/mL鳶尾苷標(biāo)準(zhǔn)溶液，準(zhǔn)確吸取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2mL于10mL棕色容量瓶中，用70%乙醇溶液定容刻度，以70%乙醇溶液為空白對(duì)照樣，在266 nm處測(cè)定吸光度。

1.3.1.2 葛花黃酮得率的計(jì)算

將經(jīng)過(guò)提取的葛花溶液加入60%乙醇溶液定容于100mL，離心分離后，取適量溶液進(jìn)行稀釋后，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作方法測(cè)定樣品的吸光度值，并根據(jù)公式（1）計(jì)算葛花黃酮得率。

式中：Y為葛花黃酮得率，%；C為根據(jù)樣品吸光度值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算得到的葛花黃酮含量，μg/mL；V為葛花提取液體積，mL；N為稀釋倍數(shù)；M為葛花質(zhì)量，g。

1.3.2 高壓脈沖電場(chǎng)提取葛花黃酮試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.2.1 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1）乙醇濃度對(duì)葛花黃酮得率的影響：在料液比為1∶30（g/mL），電場(chǎng)強(qiáng)度為15 kV/cm，脈沖數(shù)為8個(gè)的條件下，考察乙醇濃度為50%、55%、60%、65%、70%時(shí)對(duì)葛花黃酮得率的影響。

2）料液比對(duì)葛花黃酮得率的影響：在乙醇濃度為60%的條件下，設(shè)定電場(chǎng)強(qiáng)度為15 kV/cm，脈沖數(shù)為8個(gè)進(jìn)行試驗(yàn)，考察料液比為1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40（g/mL）時(shí)對(duì)葛花黃酮得率的影響。

3）電場(chǎng)強(qiáng)度對(duì)葛花黃酮得率的影響：當(dāng)乙醇濃度為60%，料液比為1∶30（g/mL）時(shí)，將脈沖個(gè)數(shù)設(shè)定為8個(gè)進(jìn)行試驗(yàn)，考察電場(chǎng)強(qiáng)度為5、10、15、20、25 kv/cm時(shí)對(duì)葛花黃酮得率的影響。

4）脈沖數(shù)對(duì)葛花黃酮得率的影響：在乙醇濃度為60%，料液比為1∶30（g/mL），電場(chǎng)強(qiáng)度為15 kV/cm的條件下，考察脈沖數(shù)為4、6、8、10、12個(gè)時(shí)對(duì)葛花黃酮得率的影響。

1.3.2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用四因素三水平Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，選取最優(yōu)水平進(jìn)行響應(yīng)面分析，以葛花黃酮得率為考核指標(biāo)，確定最佳提取工藝條件。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

以鳶尾苷標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為橫坐標(biāo)，以吸光值A(chǔ)為縱坐標(biāo)，制得標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示，回歸方程為Y= 0.063 2X-0.020 9，R2=0.998 3。

鳶尾苷標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖1。

圖1 鳶尾苷標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve for tectoridin

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果及分析

2.2.1 乙醇濃度對(duì)葛花黃酮得率的影響

乙醇濃度對(duì)葛花黃酮得率的影響見(jiàn)圖2。

圖2 乙醇濃度對(duì)黃酮得率的影響Fig.2 Effectsof theethanolconcentration rateon total flavonoids yield

由圖2可知，當(dāng)乙醇濃度為60%時(shí)，葛花黃酮的得率最高。適當(dāng)?shù)囊掖紳舛瓤梢约铀俑鸹S酮的溶出，但當(dāng)乙醇濃度高于60%時(shí)，黃酮得率反而有所降低，再綜合考慮試劑浪費(fèi)等問(wèn)題，因此，選擇乙醇濃度55%～65%為最適范圍。

2.2.2 液料比對(duì)葛花黃酮得率的影響

液料比對(duì)葛花黃酮得率的影響見(jiàn)圖3。

圖3 液料比對(duì)黃酮得率的影響Fig.3 Effectsof the stuff-liquid ratio rateon total flavonoidsyield

由圖3可知，葛花黃酮得率隨著料液比的升高而增大，當(dāng)液料比為1∶30（g/mL）時(shí)，葛花黃酮得率最高，隨后得率基本穩(wěn)定。適當(dāng)料液比可以加速葛花黃酮的溶出，這可能是因?yàn)殡S著料液比的增加，使得葛花粉與溶劑接觸面的濃度差增大，因此提高了傳質(zhì)速率[15]。但當(dāng)料液比高于1∶30（g/mL）時(shí)黃酮得率增減幅度減小，隨后不再增加，再綜合考慮能源消耗等問(wèn)題，因此選擇料液比為1∶25（g/mL）～1∶35（g/mL）為最適水平范圍。

2.2.3 電場(chǎng)強(qiáng)度對(duì)葛花黃酮得率的影響

電場(chǎng)強(qiáng)度對(duì)葛花黃酮得率的影響見(jiàn)圖4。

圖4 電場(chǎng)強(qiáng)度對(duì)黃酮得率的影響Fig.4 Effectsof theelectric field intensity rateon total flavonoids yield

適當(dāng)?shù)耐饧与妶?chǎng)作用，可以降低細(xì)胞膜的保護(hù)作用，使其結(jié)構(gòu)紊亂，從而致使細(xì)胞膜破裂，提高通透性[16]。由圖4可知，隨著電場(chǎng)強(qiáng)度的增加，葛花黃酮的得率升高，當(dāng)電場(chǎng)強(qiáng)度為15 kV/cm時(shí)，黃酮得率達(dá)到最大值。這是由于極性溶劑隨著電場(chǎng)強(qiáng)度增加，運(yùn)動(dòng)速度加快，使更多的溶劑進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)，從而細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)能夠更容易地滲透出來(lái)；另一方面可能是因?yàn)槲锪祥g內(nèi)外的電場(chǎng)強(qiáng)度差異作用使得細(xì)胞膜被破壞[17]，細(xì)胞穿孔，葛花中的黃酮物質(zhì)更易溶出。但隨著電場(chǎng)強(qiáng)度的增大，葛花黃酮的得率反而有所下降，這可能是由于過(guò)大的電場(chǎng)強(qiáng)度使得黃酮結(jié)構(gòu)發(fā)生了破壞，并且場(chǎng)強(qiáng)過(guò)大對(duì)機(jī)器有一定的損害，可能會(huì)有打火現(xiàn)象的發(fā)生。

2.2.4 脈沖數(shù)對(duì)葛花黃酮得率的影響

脈沖數(shù)對(duì)葛花黃酮得率的影響見(jiàn)圖5。

圖5 脈沖數(shù)對(duì)黃酮得率的影響Fig.5 Effectsof theelectric pulsenumber rateon total flavonoidsyield

圖5 可知，當(dāng)脈沖數(shù)為8個(gè)時(shí)，葛花黃酮得率最大。脈沖數(shù)過(guò)小，對(duì)細(xì)胞的破壞程度不明顯，不利于黃酮的溶出，得率低。增大脈沖數(shù)，電場(chǎng)的作用頻率增強(qiáng)，使得細(xì)胞的破壞程度與數(shù)量增大，得率升高。但脈沖數(shù)過(guò)大，由于電場(chǎng)對(duì)物料作用頻率過(guò)大，時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，產(chǎn)生了不穩(wěn)定因素，使得黃酮結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，從而影響葛花黃酮得率。

2.4 高壓脈沖電場(chǎng)提取葛花黃酮工藝優(yōu)化

2.4.1 數(shù)學(xué)模型的建立與方差分析

通過(guò)單因素試驗(yàn)，應(yīng)用Box-Behnken中心組合進(jìn)行四因素三水平的試驗(yàn)設(shè)計(jì)，試驗(yàn)因素及水平安排見(jiàn)表1根據(jù)中心組合試驗(yàn)與Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理[18]，得響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2，方差分析結(jié)果見(jiàn)表3，可信度分析結(jié)果見(jiàn)表4。

表1 響應(yīng)面分析因素和水平表Table1 The tableof factorsand levelsused in response surface analysis

根據(jù)Design-Expert軟件，對(duì)結(jié)果進(jìn)行多元回歸擬合、方差分析及顯著性檢驗(yàn)，得到以黃酮得率為目標(biāo)函數(shù)，進(jìn)行方差分析及顯著性檢驗(yàn)，得到各條件編碼

值的二元回歸方程為：

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果Table2 Resultsof corresponding experimental

表3 回歸模型的方差分析Table3 Varianceanalysis for the developed regressionmodel

續(xù)表3 回歸模型的方差分析Continue table3 Varianceanalysis for the developed regression m odel

表4 回歸模型的可信度分析Table4 Reliability analysisof theestablished regressionmodel

對(duì)響應(yīng)面結(jié)果進(jìn)行回歸分析，各因素對(duì)試驗(yàn)的影響是否顯著可以通過(guò)P[19]值確定。由上述表中結(jié)果可知，回歸方差分析顯著性檢驗(yàn)表明，該模型（P＜0.000 1）具有高度顯著性，說(shuō)明該模型成立，該模型的失擬項(xiàng)（P=0.071＞0.05）并不顯著，說(shuō)明模型與真實(shí)情況之間無(wú)顯著性差異，這兩者同時(shí)表明該模型的擬合性較好。上述回歸方程的相關(guān)系數(shù)為R2=0.985 7，說(shuō)明模型與實(shí)際擬合較好，該試驗(yàn)方法可靠[20]。該模型的變異系數(shù)C.V.%=0.76，說(shuō)明該模型的重復(fù)性良好。在回歸模型中，一次項(xiàng)A、B、C、D，交互項(xiàng)AC、AD、BC、BD、CD，二次項(xiàng)A2、B2、C2、D2均表現(xiàn)出了顯著水平。通過(guò)F值的比較，得出該模型各因素對(duì)響應(yīng)值影響的顯著性大小為：料液比＞電場(chǎng)強(qiáng)度＞乙醇濃度＞脈沖數(shù)，兩兩交互作用對(duì)黃酮提取影響大小為AD>BC>AC>BD>CD>AB。2.4.2 各因素的交互作用對(duì)葛花黃酮提取的響應(yīng)面分析

各因素之間兩兩交互作用見(jiàn)圖6。

圖6 三因素的交互作用Fig.6 Respanse surfacechartof three factors

由圖6中可以看出各圖均成開(kāi)口向下、凸形的曲面，并且都具有極值。由a可以看出，乙醇濃度（A）和料液比（B）等高線成圓形，說(shuō)明兩者之間交互作用不顯著，在試驗(yàn)范圍內(nèi)隨著乙醇濃度（A）和料液比（B）的不斷增大，黃酮得率均呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)。從圖中可以看出當(dāng)乙醇濃度（A）在59%～61%、料液比（B）為1∶31（g/mL）～1∶33（g/mL）時(shí)黃酮的得率達(dá)到峰值。b、d、e、f等高線均成橢圓形，說(shuō)明兩兩交互作用極為顯著，并且黃酮得率隨著各因素值的不斷增大，均先增大后減小。由c可以看出，乙醇濃度（A）和脈沖數(shù)（D）交互作用較顯著，隨著兩者不斷增大，黃酮的得率呈現(xiàn)先增大后小。當(dāng)乙醇濃度（A）處于較低水平時(shí)，黃酮得率隨著脈沖數(shù)（D）的增長(zhǎng)不斷提高。當(dāng)乙醇濃度超過(guò)60%以后，黃酮得率雖然隨著脈沖數(shù)（D）的增大而增加，但增加的幅度較小，當(dāng)乙醇濃度（A）處于高水平時(shí)黃酮的得率有所下降。當(dāng)脈沖數(shù)（D）較小時(shí)，得率隨著乙醇濃度（A）的增大而增加，當(dāng)脈沖數(shù)（D）高于9以后，得率隨著脈沖數(shù)（D）的增加變化幅度逐漸變小。

2.4.3 響應(yīng)面優(yōu)化最佳工藝參數(shù)

通過(guò)響應(yīng)面法對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行優(yōu)化后，通過(guò)分析可以得出葛花黃酮提取的最佳工藝參數(shù)為：乙醇濃度60.59%料液比1∶32.18（g/mL），電場(chǎng)強(qiáng)度16.66 kV/cm，脈沖數(shù)8.58個(gè)，此時(shí)黃酮得率為10.455%。

2.4.4 驗(yàn)證試驗(yàn)

為了驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果與實(shí)際情況是否一致，根據(jù)模型所給出的試驗(yàn)方案進(jìn)行驗(yàn)證性試驗(yàn)，考慮試驗(yàn)的方便情況，對(duì)結(jié)果進(jìn)行取整后得到的最佳工藝參數(shù)為：乙醇濃度60%、料液比1∶32（g/mL），電場(chǎng)強(qiáng)度16 kV/cm，脈沖數(shù)8個(gè)。在此條件下，實(shí)際測(cè)得的葛花黃酮得率為10.373%，理論值為10.455%，相差0.082%，因此，利用響應(yīng)面法對(duì)葛花黃酮提取條件進(jìn)行優(yōu)化是可行的，得到的葛花黃酮提取條件具有實(shí)際的應(yīng)用價(jià)值，為實(shí)際操作提供技術(shù)參考。

3 結(jié)論

高壓脈沖電場(chǎng)提取葛花黃酮具有能耗小、時(shí)間短、對(duì)熱敏性物質(zhì)的破壞程度較小等優(yōu)點(diǎn)。以葛花為原料，利用高壓脈沖電場(chǎng)技術(shù)提取葛花黃酮，通過(guò)響應(yīng)面試驗(yàn)，確定最佳提取條件為：乙醇濃度60%，料液比1∶32（g/mL），電場(chǎng)強(qiáng)度16 kV/cm，脈沖數(shù)8個(gè)，得率為10.373%。

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Technology Optim ization of Total Flavonoids Extraction from Pueraria lobata by the High-intensity Pulsed Electric Fields Assistance

DAIMing-jun1，YOU Li-xin2，WEN Lian-kui1，*，YINYong-guang3
（1.Collegeof Food Scienceand Engineering，Jilin AgriculturalUniversity，Changchun 130118，Jilin，China；2.College ofOrganism and Food，Changchun University ofScience and Technology，Changchun 130600，Jilin，China；3.Collegeof Biologicaland AgriculturalEngineering，Jilin University，Changchun 130022，Jilin，China）

Pueraria lobata wasused as rawmaterial toextract total flavonoidsby thehigh-intensity pulsed electric fields，with theyield of total flavonoidsas index，based on thissingle factorexperiment，the effectsofstuffliquid ratio，electric field intensity，and electric pulse number on the yield of total flavonoidswere discussed by respons surfacemethodology，and determined the bestextraction process parameters of these three factors.The results showed that，themost yield rate 10.373%by total flavonoidswas achieved under the following conditions theethanolconcentrations60%，ratioofstuff-liquid ratio1∶32（g/mL），electric field intensity16 kV/cm，electric pulsenumber8.

high-intensity pulsed electric fields；extraction；Pueraria lobata；flavonoids

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.23.023

2016-02-23

吉林省教育廳“十二五”科學(xué)技術(shù)項(xiàng)目：葛花解酒飲品的開(kāi)發(fā)研究（[2012]第517號(hào)）

代名君（1988—），男（漢），在讀碩士研究生，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品加工。

*通信作者：文連奎（1962—），男，教授，研究方向：長(zhǎng)白山野生資源的開(kāi)發(fā)利用。