張宏梅，昌盛，崔佰吉，李曉光

（吉林醫(yī)藥學院藥學院，吉林吉林132013）

苦瓜總黃酮的提取及其體外抗氧化活性分析

張宏梅，昌盛，崔佰吉，李曉光*

（吉林醫(yī)藥學院藥學院，吉林吉林132013）

研究苦瓜中總黃酮提取工藝及其體外抗氧化作用。采用乙醇回流提取法提取苦瓜中總黃酮，利用紫外分光光度法對其進行鑒定，采用正交試驗設計優(yōu)化苦瓜中總黃酮的提取工藝；通過其清除1，1-二苯基苦基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH自由基）、羥自由基（·OH）、超氧陰離子自由基（O2－·）效果來考察苦瓜總黃酮的體外抗氧化能力。最佳提取工藝條件為：溫度80℃，時間3 h，乙醇濃度80%，料液比1∶30（g/mL），提取次數3次。總黃酮平均含量為4.12mg/g?？喙峡傸S酮對DPPH自由基、·OH、O2－·均有較強的清除能力，呈現出量效關系，其IC50值分別為0.79、0.49、0.54mg/mL，表明苦瓜總黃酮具有較強的體外抗氧化能力。

苦瓜；黃酮；提??；體外抗氧化

苦瓜（Momordica charantia L.），又稱癩瓜、涼瓜，癲葡萄、錦荔枝等，是葫蘆科苦瓜屬植物，苦瓜屬一年生攀援草本苦瓜的果實。它味苦性寒，具有利尿、消暑解熱、明目解毒、滋養(yǎng)強壯、降壓、降血脂、舒張血管、抗心率失常、抗癌等作用，對提高機體的免疫能力，防治濕疹等皮膚病，抑制正常細胞的癌變和促進突變細胞的回復過程[1-2]。

黃酮類化合物廣泛分布于自然界，為植物多酚類的代謝物[3]。具有治療人類疾病及營養(yǎng)保健功效，對人類健康有著不可低估的作用[4]。黃酮類化合物的基本骨架由15個碳原子組成（C6-C3-C6）[5-7]。具有降血脂、降低血糖、降血壓，抗菌、抗炎，免疫，保肝，清除氧自由基，抗衰老等作用[8-11]。因此，建立苦瓜中總黃酮的最佳提取工藝及其體外抗氧化的研究意義重大。本試驗采用回流提取法提取苦瓜中的總黃酮，優(yōu)化其最佳的提取工藝條件，并考察其體外抗氧化的能力，旨在為苦瓜總黃酮的進一步研究開發(fā)，提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 原料

苦瓜：市售。

1.2 試劑

濃鹽酸（批號：20120801）：哈爾濱試劑化工廠；鄰苯三酚（批號：20121225）：天津市瑞金特化學品有限公司；亞硝酸鈉（批號：20130604）：沈陽市華東試劑廠；硝酸鋁（批號：20121204）、氫氧化鈉（批號：20080528）、鄰二氮菲（批號：20140702）：天津市大茂化學試劑廠；雙氧水（批號：20150109）、硫酸亞鐵（批號：20130111）：天津市永大化學試劑有限公司；磷酸二氫鉀（批號：20091212）：天津市恒興化學試劑制造有限公司；二苯代苦味肼自由基（DPPH·）（批號：WM0510EA14）：上海源葉生物科技有限公司；三羥甲基氨基甲烷（Tris）（批號：TM0311CA14）：上海源葉生物科技有限公司；抗壞血酸（VC）（批號：20120618）上海實驗試劑有限公司；均為AR試劑；蘆丁對照品（100080-201409）：中國食品藥品檢定研究院。

1.3 儀器設備

RE-3000旋轉蒸發(fā)儀：鄭州市亞榮儀器有限公司；UV1800紫外分光光度計：日本島津；CAP225D電子天平：Sartorius；Scientz-12SN冷凍干燥機：寧波生物科技股份有限公司。

1.4 方法

1.4.1 原料處理

取新鮮苦瓜，洗凈后晾干，去掉瓜籽，切成小塊，在55℃的恒溫干燥箱中烘干，粉碎，過80目篩，稱取一定量處理好的苦瓜粉末，用濾紙包包好，置于索氏提取器中，加入石油醚（30℃～60℃），置水浴鍋中索氏提取，將溫度控制在55℃左右，直至索氏提取器中有機溶劑變?yōu)闊o色，然后取出濾紙包并打開，將物料上的石油醚自然風干，備用。

1.4.2 苦瓜總黃酮含量測定[12-16]

精密稱取蘆丁對照品16.42mg，置10mL量瓶中，加甲醇溶解，并稀釋至刻度，得對照品儲備液。精密吸取對照品儲備液1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0mg置于10mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，定容。分別精密吸取各對照品溶液1.0mL置25mL量瓶中，分別加入30%乙醇5mL，混勻，加入1mL濃度為5%的亞硝酸鈉溶液，混勻，放置室溫6min，加入1mL濃度為5%的硝酸鋁溶液，混勻，放置室溫6min，再分別加入濃度為4%的氫氧化鈉溶液10.0mL，混勻，用30%乙醇稀釋至刻度，混勻，室溫放置15min后于波長510 nm處測定吸光度。蘆丁對照品的濃度C為橫坐標，吸光度A為縱坐標，繪制標準曲線，得回歸方程A=0.481 8C+ 0.056 2（R=0.9993），表明蘆丁在0.16mg/mL～0.64mg/mL的范圍內線性關系良好。

供試品制備：取供試品溶液適量加入30%乙醇溶液5mL，后續(xù)操作與標準曲線的測定過程相同。

1.4.3 苦瓜總黃酮的提取及供試品的制備

取一定量預先處理好的苦瓜小顆粒，置于三頸瓶中，加入一定量某一濃度的乙醇溶液。浸泡過夜，將溫度控制在一定條件，在水浴鍋中進行回流提取，回流提取結束后，提取液抽濾，得到提取液，提取液減壓濃縮，冷凍干燥，得苦瓜總黃酮提取物粉末。

取提取物粉末適量，置25mL量瓶中，加80%乙醇20mL，超聲提取30min，防冷置室溫，用80%乙醇定容至刻度，過濾，取續(xù)濾液即得。

1.4.4 正交試驗優(yōu)化苦瓜總黃酮的提取工藝

按照預試驗的試驗結果，選取提取時間、乙醇濃度、料液比、提取溫度和提取次數5個因素，采用五因素四水平進行L16（45）正交設計表進行試驗設計，以苦瓜提取液中的總黃酮含量為考察指標，優(yōu)選最佳提取工藝條件，因素水平表見表1。

表1 因素與水平Table1 Factorsand levels

1.4.5 體外抗氧化活性測定

取苦瓜總黃酮提取物適量，加甲醇制成含有總黃酮為0.1、0.2、0.3、0.4 mg/mL的溶液作為供試品溶液，取VC粉末適量，加甲醇制成VC溶液（0.1、0.2、0.3、0.4mg/mL）作為參比溶液。

1.4.5.1 對羥基自由基的清除

取0.5mL 0.75mmol/L鄰二氮菲無水乙醇溶液置試管中，依次加入1 mL 0.15mol/L磷酸鹽緩沖液（PBS，pH7.4）和0.5mL水，充分混勻后，加入0.5mL 0.75 mmol/L硫酸亞鐵溶液（FeSO4），混勻后，加入0.5mL 0.01%雙氧水（H2O2），于37℃水浴保溫60min，測定吸光度A損；未損傷：以0.5mL水代替雙氧水，同法測定吸光度A未；樣品管：0.5mL樣品代替0.5mL水，同法測定吸光度A樣。

1.4.5.2 對DPPH自由基的清除

取不同濃度的樣品0.1mL，加入1×10-4mol/LDPPH乙醇溶液2.8mL，混勻后在室溫下避光反應20min，

4 000 r/min離心10min，取上清液測定吸光度A1，空白組以等體積乙醇代替DPPH溶液，同法操作，測定吸光度Aj。對照組以等體積蒸餾水代替樣品溶液，同法操作，測定吸光度A0。

調零空白液：蒸餾水+乙醇溶液（1∶1）

1.4.5.3 對超氧陰離子自由基的清除

取0.1molLpH8.2Tris-HCL緩沖液2.8mL（其中含有2mmol/L EDTA），加0.1mL不同濃度的樣品溶液，混合均勻，于25℃水浴中保溫10min，然后加入25℃保溫狀態(tài)的3mmol/L的鄰苯三酚0.1mL，混勻后迅速于干燥的石英比色皿中，在320 nm下每30 s測定一次吸光度值，測定3min結束。

調零液：0.1mol/L pH8.2Tris-HCL緩沖液2.8mL（其中含有2mmol/LEDTA）

對照組：等體積水代替樣品。

方法：做吸光度-時間曲線，求回歸方程，斜率即為鄰苯三酚自氧化速率V。

2 結果與分析

2.1 乙醇回流法提取工藝研究

正交試驗結果表見表2。

表2 正交試驗設計及結果Table2 Resultsof orthogonalarray design

從表2分析可知，各因素對苦瓜總黃酮得率影響的主次順序為：B>C>D>A>E，即5種因素中，乙醇濃度對苦瓜總黃酮提取率的影響最大，其次是料液比、提取溫度、提取時間、提取次數。而對于每一個單因素的極差分析可知，提取時間（A）：k3>k2>k4>k1，乙醇濃度（B）：k3>k4>k2>k1，料液比（C）：k4>k3>k2>k1，提取溫度（D）：k3>k4>k2>k1，提取次數（E）：k3>k4>k2>k1。因此，得出最優(yōu)因素水平組合為A3B3C4D3E3，即提取時間：3 h，乙醇濃度：80%，料液比：1∶30（g/mL），提取溫度：80℃，提取次數：3次。

按照最佳的提取條件進行工藝驗證試驗，工藝驗證試驗表明，本方法重現性良好，總黃酮平均含量為4.12mg/g，可以用作苦瓜總黃酮的提取方法。

2.2 對羥基自由基的清除作用

由試驗結果可知不同濃度的苦瓜總黃酮提取物，其清除羥基自由基的能力具有明顯的量效關系，在低濃度情況下，苦瓜總黃酮和VC的清除能力相差不大，隨著濃度的升高，二者的清除能力都有所增加，但苦瓜總黃酮的清除能力均沒有超過VC，經計算其純化前后的IC50值均為：0.49mg/mL，測定結果見圖1。

圖1 苦瓜總黃酮、VC對羥基自由基的清除作用Fig.1 Scavenging activity effectsof flavonoids from balsam pear and VCagainsthydroxyl radical

2.3 對DPPH自由基的清除作用

由試驗結果可知，苦瓜總黃酮和VC清除DPPH自由基的能力有差異，苦瓜總黃酮的清除能力明顯低于VC溶液，但清除能力也表現出一定的量效關系，但是隨著濃度的增加，二者清除能力的差異性也越來越大，經計算其純化前后的IC50值分別為：0.79mg/mL，測定結果見圖2。

2.4 對超氧陰離子自由基的清除作用

由試驗結果可知，苦瓜總黃酮與VC清除超氧陰離子自由基的能力相當，雖然苦瓜總黃酮的清除能力沒有VC的作用強，但是在一定的范圍內二者的差異性較

小，且在范圍內苦瓜總黃酮的清除能力也存在明顯的量效關系，經計算其純化前后的IC50值分別為：0.54mg/mL，測定結果見圖3。

圖2 苦瓜總黃酮、VC對DPPH自由基的清除作用Fig.2 Scavenging activity effectsof flavonoids from balsam pear and VCagainstDPPH radical

圖3 苦瓜總黃酮、VC對超氧陰離子自由基的清除作用Fig.3 Scavenging activity effectsof flavonoids from balsam pear and VCagainst superoxideanion radical

3 結論

乙醇回流法提取苦瓜中總黃酮的最佳工藝為：提取時間3 h，乙醇濃度80%，料液比1∶30（g/mL），提取溫度80℃，提取次數3次。按照最佳的提取條件進行工藝驗證試驗，總黃酮平均含量為4.12mg/g。乙醇濃度對苦瓜總黃酮提取率的影響最大，其次是料液比、提取溫度、提取時間、提取次數。

苦瓜總黃酮的體外抗氧化研究表明，苦瓜總黃酮對DPPH自由基、·OH均有一定的清除能力，但清除能力與同濃度的VC溶液相比，還有一定的差距，但在一定的范圍內呈現明顯的量效關系，且隨著濃度的升高，清除能力逐漸增強；苦瓜總黃酮對O2－·的清除能力與同濃度的VC差異不是很大，但是隨著濃度的增加，清除能力的增加沒有VC增加的幅度大，但是對比苦瓜總黃酮和VC清除DPPH自由基、·OH清除能力發(fā)現，隨著濃度的增加，苦瓜總黃酮與VC的清除能力的差別相對較小，說明苦瓜總黃酮清除O2－·的能力要高于清除DPPH自由基和·OH的能力，但是總體來說清除能力低于同等濃度下Vc的清除能力，經過計算苦瓜總黃酮清除DPPH自由基、·OH和O2－·的IC50值分別為0.79、0.49、0.54mg/mL，整體的量效關系比較明顯，隨著濃度的增加，對3種自由基的清除能力逐漸增加，說明苦瓜總黃酮具有一定的體外抗氧化的能力?？茖W已經證明，與自由基有關的疾病有上百種之多，苦瓜為藥食同源類植物，開發(fā)其有效成分的提取對于醫(yī)療和保健產品的開發(fā)必將具有一定的積極作用，特別是對于疾病的預防，日常保健有著重要的意義。

[1]文良娟,劉葦芬.苦瓜黃酮的提取條件及其抗氧化活性研究[J].食品科學2007,28(9):183-186

[2]申湘忠,楊民生,劉志成.苦瓜植株各部分黃酮的提取與粗黃酮含量的測定[J].食品與生物技術學報,2007,26(1):60-64

[3]王長遠,吳洪奎,于長青,等.黃酮類化合物研究進展[J].黑龍江八一農墾大學學報,2007,19(2):75-78

[4]馬森林,陳四平.天然黃酮類化合物分離方法研究進展[J],中國醫(yī)藥導報,2011,8(21):8-10

[5] 陳顥,李麗娟,李良,等.中藥材中黃酮類化合物的提取及藥理作用研究進展[J].云南化工,2011,38(4):50-53

[6]計紅芳,張令文,孫科祥.苦瓜總黃酮的提取工藝[J].食品工藝與開發(fā)2009,30(9):77-80

[7]萬明,宋永鋼,楊菠.黃酮類化合物的藥理作用及其在食品工業(yè)中的應用[J],江西食品工業(yè),2007(3):49-52

[8]阮俊,黃永林.野菊花總黃酮提取方法研究[J].中成藥,2004,26(2): 153-155

[9]張紀寧,歐陽艷.黃酮類化合物的提取工藝研究進展[J].伊犁師范學院學報(自然科學版),2008(6):27-28

[10]魏朝良,于德紅,安利佳.黃酮類化合物及清除自由基機制的探究[J].中成藥,2005,27(2):239-241

[11]申湘忠,楊民生,劉志成.苦瓜植株各部分黃銅的提取與粗黃酮含量的測定[J].食品與生物技術學報,2007,26(1):60-64

[12]李淑玲,凌愛霞.表面活性劑協同提取苦瓜中總黃酮的研究[J].濟寧醫(yī)學院學報,2012,35(5):325-327

[13]李憲平,申湘忠.微波法提取苦瓜葉中總黃酮[J].邵陽學院學報(自然科學版),2007,4(3):86-89

[14]李洪雄,彭志遠,鄒海英.葛根黃酮的提取與應用[J].吉首大學學報(自然科學版),2006,27(3):113-116

[15]謝建華,單斌,彭云.超臨界CO2流體萃取苦瓜總黃酮工藝及其抗氧化活性[J].生物加工過程,2010,8(1):66-71

[16]李星彩.微波萃取苦瓜中黃酮類化合物的工藝研究[J].安徽農業(yè)科學,2010,38(21):11472-11473

Extraction and Antioxidant Activity in vitro of Flavonoids from Balsam Pear

ZHANGHong-mei，CHANGSheng，CUIBai-ji，LIXiao-guang*
（CollegeofPharmacy，Jilin MedicalUniversity，Jilin 132013，Jilin，China）

To investigate the extraction and antioxidanteffectsof flavonoids from balsam pear.Flavonoidswere extracted from balsam pearwith ethanol.The extractwasanalyzed qualitatively by UV-visible absorption spectroscopy.Theoptimum extraction conditionswere determined by orthogonalarray design.The antioxidantactivity of flavonoids from balsam pear investigated by comparing the reducing power and radical scavenging effects againstDPPH，hydroxyland superoxide anion radicalswith those of VCin vitro.The optimum extraction conditionswereas follows：ethanolconcentration 80%，solid/solventratio1∶30（g/mL），extraction time3 hours，temperature 80℃and 3 times.Under the optimized conditions，the yield of total flavonoids from balsam pearwas 4.12mg/g in one extraction cycle.Theextracted flavonoidshad potent radical scavengingactivity in a dose-dependentmanneragainstDPPH，hydroxyland superoxideanion radicals，and its IC50was0.79、0.49、0.54mg/mL，respectively.Flavonoids from balsam pearhad strongantioxidanteffects in vitro.

balsam pear；flavonoids；extraction；antioxidanteffects in vitro

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.23.015

2016-07-31

張宏梅（1982—），女（漢），講師，碩士，研究方向：中藥新劑型及保健食品的開發(fā)。

*通信作者：李曉光（1963—），女（漢），教授，本科，研究方向：天然藥物及保健食品的開發(fā)。