魏 亮, 楊 成, 張燕飛, 王 琦, 管宏新, 孫志揚(yáng)

(同濟(jì)大學(xué)附屬上海市東方醫(yī)院神經(jīng)外科，上海 200120；*通訊作者，E-mail: dfsunzy@126.com)

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Fli-1及其靶基因在顱內(nèi)動(dòng)脈瘤患者中的表達(dá)

魏 亮, 楊 成, 張燕飛, 王 琦, 管宏新, 孫志揚(yáng)*

(同濟(jì)大學(xué)附屬上海市東方醫(yī)院神經(jīng)外科，上海 200120；*通訊作者，E-mail: dfsunzy@126.com)

目的 探討Fli-1及其靶基因COL1A1、TNC在顱內(nèi)動(dòng)脈瘤患者血液?jiǎn)魏思?xì)胞中的表達(dá)及作用。 方法 研究納入41例顱內(nèi)動(dòng)脈瘤患者，其中25例動(dòng)脈瘤破裂患者，16例動(dòng)脈瘤未破裂患者；取病人的外周血，10例正常人外周血作為對(duì)照，分離血液?jiǎn)魏思?xì)胞，提取總RNA，根據(jù)之前生物信息預(yù)測(cè)結(jié)果，采用實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)Fli-1及其靶基因(COL1A1、TNC) 在疾病和健康人群中的表達(dá)差異。 結(jié)果 在檢測(cè)的Fli-1及靶基因COL1A1和TNC中，在顱內(nèi)動(dòng)脈瘤中差異表達(dá)的基因有2個(gè)，分別為Fli-1和COL1A1。進(jìn)一步分組發(fā)現(xiàn)，相比于未發(fā)生破裂的動(dòng)脈瘤患者，這兩個(gè)基因在破裂的顱內(nèi)動(dòng)脈瘤患者中的表達(dá)有顯著升高。 結(jié)論 破裂與未破裂顱內(nèi)動(dòng)脈瘤患者之間Fli-1及COL1A1的表達(dá)水平差異可能與動(dòng)脈瘤的破裂表現(xiàn)存在相關(guān)性。

顱內(nèi)動(dòng)脈瘤； 差異表達(dá)基因； Fli-1， COL1A1

顱內(nèi)動(dòng)脈瘤(intracranial aneurysm)是一種常見(jiàn)的多因素疾病，在全球范圍內(nèi)其發(fā)生率為3.2%[1]。未破裂的顱內(nèi)動(dòng)脈瘤典型為無(wú)癥狀性，而顱內(nèi)動(dòng)脈瘤的破裂能夠?qū)е轮刖W(wǎng)膜下隙出血，從而導(dǎo)致重癥殘疾[2]。 近年來(lái)基因組相關(guān)研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了多種與顱內(nèi)動(dòng)脈瘤相關(guān)的疾病基因位點(diǎn)，如染色體9p21位點(diǎn)[3]。此外，還發(fā)現(xiàn)了一些與動(dòng)脈瘤顯著相關(guān)的基因。 Friend白血病集成轉(zhuǎn)錄因子-1(Friend leukemia integration 1 transcription factor，F(xiàn)li-1)是ETS轉(zhuǎn)錄因子家族中的一員,首次發(fā)現(xiàn)在由小鼠白血病病毒 (F-MuLV)引起的紅白血病中。Fli-1在多種良性或惡性腫瘤中都呈現(xiàn)高表達(dá)。該基因已被發(fā)現(xiàn)在血管生成中起重要作用，因此被認(rèn)為是治療動(dòng)脈瘤的潛在的基因靶標(biāo)[4]。生物信息預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)Collagen Type Ⅰα1(COL1A1)、Tenascin C(TNC)是Fli-1調(diào)控的靶基因，與動(dòng)脈瘤的發(fā)生發(fā)展聯(lián)系緊密[5,6]。雖然這些研究已證實(shí)基因在顱內(nèi)動(dòng)脈瘤形成中的作用，然而這些基因在顱內(nèi)動(dòng)脈瘤形成和破裂的病理生理機(jī)制仍不完全明確。本研究通過(guò)收集破裂和未破裂的動(dòng)脈瘤患者外周血，并以健康人作為對(duì)照，分離獲得單個(gè)核細(xì)胞，采用實(shí)時(shí)定量PCR對(duì)分析差異表達(dá)的候選基因，以明確Fli-1及其靶基因在顱內(nèi)動(dòng)脈瘤患者血液?jiǎn)魏思?xì)胞中的表達(dá)情況。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

本研究經(jīng)倫理委員會(huì)同意，所有患者均來(lái)自2014-01～2015-12期間在本院神經(jīng)外科經(jīng)數(shù)字減影血管造影診斷為顱內(nèi)動(dòng)脈瘤，年齡31-84歲，男性14例，女性27例。同時(shí)從我院體檢中心募集健康對(duì)照者10名。實(shí)驗(yàn)前，所有患者均簽訂了本院提供的知情同意書。

1.2 試劑與儀器

高速低溫離心機(jī)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，生物安全柜購(gòu)自美國(guó)Thermo公司，低速自動(dòng)平衡離心機(jī)購(gòu)自湖南湘儀，酶標(biāo)儀購(gòu)自TECAN公司，熒光定量PCR儀購(gòu)自美國(guó)ABI公司；人淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)自達(dá)科為公司，RNA抽提試劑Trizol購(gòu)自美國(guó)Life Technology公司，RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自日本Takara公司，SYBR Green試劑盒購(gòu)自美國(guó)ABI公司，PCR引物由上海生工生物合成。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 人外周血淋巴細(xì)胞分離 取新鮮全血，用等體積的0.9%NaCl/PBS稀釋血液后，按照1∶1的比例加入適量的淋巴細(xì)胞分離液，隨后輕輕將稀釋后的血液加在分離液的上方，避免混合。1 500 r/min離心30 min后，吸棄干凈最上層的黃色血清，將中間層的溶液(白色)轉(zhuǎn)移至15 ml離心管中，加入等量的PBS/1640培養(yǎng)基，混勻后，離心(1 000 r/min，5 min)。如還可見(jiàn)紅細(xì)胞，離心后去上清，用3 ml紅細(xì)胞裂解液反應(yīng)1 min左右，1 000 r/min離心5 min，用PBS洗滌2遍。計(jì)數(shù)培養(yǎng)，保存于-80 ℃。

1.3.2 RNA提取 將上述獲得的細(xì)胞加1 ml Trizol混勻，室溫放置15 min，使其充分裂解，然后轉(zhuǎn)入1.5 ml離心管。加入0.2 ml氯仿，振蕩混勻后室溫放置15 min。4 ℃ 12 000×g離心15 min。吸取上層水相，至另一離心管中。加入0.5 ml異丙醇混勻，-20 ℃沉淀。4 ℃ 12 000×g離心10 min，棄上清，RNA沉于管底。用75%乙醇洗滌RNA沉淀，每使用1 ml Trizol加入1 ml 75%乙醇，溫和振蕩離心管，懸浮沉淀。4 ℃ 12 000×g離心5 min，盡量棄上清。室溫晾干或真空干燥5-10 min。用20 μl DEPC H2O溶解RNA樣品，55-60 ℃，5-10 min。RNA純度的測(cè)定和RNA的定量采用NanoDrop 2000進(jìn)行，以相應(yīng)溶劑為對(duì)照(Blank)，取2 μl RNA溶液于酶標(biāo)儀上檢測(cè)樣本濃度和質(zhì)量。

1.3.3 實(shí)時(shí)定量RT-PCR實(shí)驗(yàn) 將上述獲得的總RNA，以O(shè)ligo dT12作為引物，每份加入1-5 μg RNA按照Takara公司PrimeScript RT逆轉(zhuǎn)錄試劑盒的說(shuō)明書操作進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)采用SYBR Green染料進(jìn)行，以GAPDH作為內(nèi)參基因，檢測(cè)基因Fli-1，COL1A1及TNC，這些基因的引物序列的設(shè)計(jì)根據(jù)GeneBank公布的cDNA序列進(jìn)行設(shè)計(jì)，具體見(jiàn)表1。定量PCR的反應(yīng)體系如下：SYBR Premix Ex Taq(2×)10 μl，前向引物和反向引物1 μl，cDNA 2 μl，10×Buffer 2 μl, dNTP 2 μl,加ddH2O至總體積20 μl。反應(yīng)條件為50 ℃保持3 min；95 ℃熱變性3 min；95 ℃變性10 s；60 ℃復(fù)性30 s；40個(gè)循環(huán)，并于60-95 ℃時(shí)取溶解曲線。隨機(jī)軟件自動(dòng)地計(jì)算出最適合的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程式，并根據(jù)域值算出各樣品Ct值與拷貝數(shù)，結(jié)果應(yīng)用2-ΔΔCt法[7]進(jìn)行分析。

表1 實(shí)時(shí)定量PCR引物序列

Table 1 The primer sequences for real-time quantification PCR

基因名稱前向引物(5'-3')反向引物(5'-3')Fli-1 GCGACGACCAGTCCCTCTTT GCTGATTGATCCACTCCTGCTCOL1A1 GCAAGGTGTTGTGCGATGACG TTGGTCGGTGGGTGACTCTGTNC GAGCAATCCAGCGACCATCA GAGACTGTAATTGAGGCGGTAGAPDH TGACAACTTTGGTATCGTG-GAAGG AGGCAGGGATGATGTTCTG-GAGAG

2 結(jié)果

2.1 外周血RNA的濃度和純度

采用Trizol法從顱內(nèi)動(dòng)脈瘤患者及健康對(duì)照外周血單個(gè)核細(xì)胞樣本中抽提的總RNAA260/A280比例在1.8-2.1之間，結(jié)果見(jiàn)表2。

2.2 實(shí)時(shí)定量RT-PCR結(jié)果

我們對(duì)3種候選基因采用實(shí)時(shí)定量PCR進(jìn)行了檢測(cè)，可見(jiàn)在顱內(nèi)動(dòng)脈瘤中差異表達(dá)的基因有2個(gè)，分別為Fli-1和COL1A1。經(jīng)進(jìn)一步分組發(fā)現(xiàn)，相比于未發(fā)生破裂的動(dòng)脈瘤患者，基因Fli-1(破裂組vs未破裂組為1.75±0.81vs1.25±0.56)和COL1A1(破裂組vs未破裂組為3.76±4.01vs2.00±2.90)在破裂的顱內(nèi)動(dòng)脈瘤患者中的表達(dá)有顯著升高(P<0.05，見(jiàn)圖1，2)。

表2 顱內(nèi)動(dòng)脈瘤患者和健康對(duì)照者外周血單核細(xì)胞RNA純度和濃度

Table 2 The RNA purity and concentration of peripheral blood mononuclear cells in intracranial aneurysm patients and controls

樣本A260A280A260/A280濃度(ng/μl)C10.5590.2782.011447.52C20.270.1381.956215.76C31.040.5431.915832.16C41.7230.9051.9031378.32C50.5560.2891.924444.72C72.41.2551.9121920.24C80.6430.3212.003514.56C90.6520.3152.070521.36C100.5820.2981.953465.36P10.5990.311.932479.12P20.8530.4361.956682.64P30.4110.2111.948328.72P40.2910.1452.007232.48P51.130.631.793432.24P60.790.3792.082134.18P70.5010.2352.132505.14P81.2710.622.050441.23P91.9540.9612.0321335.1P100.7870.3782.082456.12P112.6311.32.0241222.11P120.8740.4212.0731345.36P130.6130.3261.880566.32P140.7930.3912.028421.55P150.5330.2711.967564.3P161.0840.5262.059112.4P170.6020.3151.911354.1P180.5220.2651.970223.1P191.3610.6652.047199.6P201.0210.4952.063456.4P210.7320.3512.088299.9P221.5020.7362.042289.59P230.4850.2571.8871100.3P241.1140.5412.057784.3P251.0440.5062.061232.48W11.0610.5152.0601159.3W21.3150.6422.0481044.9W30.8730.4212.074877.6W40.7530.3612.086766.35W51.5920.782.040544.23W61.2520.612.051599.1W70.9630.4662.067225.32W81.7330.8512.03644.48W92.4161.1922.02618.56W101.2490.6092.051641.58W111.0930.5611.948877.63W121.3450.6572.047344.56W131.2750.6222.050655.48W141.2920.632.049832.48W151.5460.7871.964198.75W160.8970.4941.816222.89

C.健康對(duì)照組；P.動(dòng)脈瘤破裂患者； W.動(dòng)脈瘤未破裂患者

對(duì)照組 ∶未破裂組∶破裂組=1.05(0.34) ∶1.25(0.56) ∶1.75(0.81);與其他兩組比較,*P<0.05圖1 PCR檢測(cè)Fli-1基因在顱內(nèi)動(dòng)脈瘤患者和健康者中的相對(duì)表達(dá)量 Figure 1 The relative expression of Fli-1 in intracranial aneurysm patients and controls by PCR

對(duì)照組 ∶未破裂組 ∶破裂組=1.12(0.53) ∶2.00(2.90) ∶3.76(4.01);與其他兩組比較，*P<0.05圖2 PCR檢測(cè)COL1A1基因在顱內(nèi)動(dòng)脈瘤患者和健康者中的相對(duì)表達(dá)量Figure 2 The relative expression of COL1A1 in intracranial aneurysm patients and healthy controls by PCR

3 討論

近來(lái)全基因組關(guān)聯(lián)研究已經(jīng)明確多個(gè)與顱內(nèi)動(dòng)脈瘤風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)的基因位點(diǎn)和基因[8,9]。目前研究中最常報(bào)道的基因變異體位點(diǎn)位于染色體9p21[10]。與動(dòng)脈瘤相關(guān)的基因如：基質(zhì)分解素-1(Stromelysin-1) 被證實(shí)在動(dòng)脈瘤患者中過(guò)表達(dá)，對(duì) Stromelysin-1的研究為動(dòng)脈瘤的發(fā)生發(fā)展、診斷及治療起到重大的作用。這些研究證實(shí)基因在顱內(nèi)動(dòng)脈瘤形成中的作用，然而有關(guān)顱內(nèi)動(dòng)脈瘤形成和破裂的病理生理機(jī)制仍不完全明確。在破裂和未破裂的顱內(nèi)動(dòng)脈瘤中對(duì)基因表達(dá)水平進(jìn)行比較將為導(dǎo)致顱內(nèi)動(dòng)脈瘤破裂的生理機(jī)制的闡明提供強(qiáng)大的工具，這為臨床醫(yī)生為患者選擇優(yōu)化的治療方案提供了可能。之前相關(guān)基因芯片分析的結(jié)果顯示多種生物學(xué)通路包括炎癥應(yīng)答、免疫系統(tǒng)、細(xì)胞外基質(zhì)及細(xì)胞凋亡等均參與到顱內(nèi)動(dòng)脈瘤的形成、進(jìn)展及破裂中。由于動(dòng)脈瘤的生物學(xué)狀態(tài)具有異生性，因此比較破裂顱內(nèi)動(dòng)脈瘤及未破裂顱內(nèi)動(dòng)脈瘤的基因表達(dá)差異存在一定的難度[11,12]。在本研究中，我們通過(guò)收集破裂與未破裂的顱內(nèi)動(dòng)脈瘤患者的外周血，并以正常人外周血作為對(duì)照，分離血液?jiǎn)魏思?xì)胞，提取總RNA，實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)候選基因的表達(dá)差異。我們的結(jié)果顯示在檢測(cè)的Fli-1和2個(gè)靶基因中，F(xiàn)li-1和COL1A1基因在顱內(nèi)動(dòng)脈瘤中顯著差異表達(dá)。經(jīng)進(jìn)一步分組發(fā)現(xiàn)，相比于未發(fā)生破裂的動(dòng)脈瘤患者，這兩個(gè)基因在破裂的顱內(nèi)動(dòng)脈瘤患者中的表達(dá)有顯著升高。我們認(rèn)為破裂與未破裂顱內(nèi)動(dòng)脈瘤患者之間Fli-1及COL1A1的表達(dá)水平差異可能與動(dòng)脈瘤的破裂存在相關(guān)性。

Fli-1是Ets家族轉(zhuǎn)錄因子，其能夠與GGA(A/T)一致核心基序結(jié)合來(lái)調(diào)控靶基因的表達(dá)[13]。Fli-1最先被認(rèn)為能夠整合到Friend鼠白血病病毒的位點(diǎn)上。隨著數(shù)據(jù)的累積，F(xiàn)li-1被發(fā)現(xiàn)能夠作為調(diào)控者參與到多種細(xì)胞過(guò)程中，如細(xì)胞的發(fā)育、分化和增殖[13]。正常生理?xiàng)l件下，F(xiàn)li-1主要在造血干細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)，F(xiàn)li-1基因的過(guò)表達(dá)能夠促進(jìn)血液瘤和實(shí)體瘤的發(fā)生[14]。此外，F(xiàn)li-1表達(dá)失調(diào)還與自身免疫病的發(fā)生有關(guān)[15]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)li-1在血管生成中起重要作用，可以將其作為動(dòng)脈瘤診斷及治療的新靶點(diǎn)。例如有研究發(fā)現(xiàn)Fli-1基因缺失的小鼠，在胚胎期中即出現(xiàn)血管發(fā)育不完整，從而導(dǎo)致顱內(nèi)出血，表明Fli-1在血管生成、重構(gòu)的基因調(diào)控中起關(guān)鍵的作用[16]。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)Fli-1基因在破裂的顱內(nèi)動(dòng)脈瘤患者中的表達(dá)有顯著升高，該結(jié)果提示Fli-1參與到顱內(nèi)動(dòng)脈瘤的病情進(jìn)展中。Fli-1的高表達(dá)可能增加了顱內(nèi)動(dòng)脈瘤破裂的風(fēng)險(xiǎn)。

Peters等[17]之前研究采用SAGE-Lite對(duì)一名3歲的顱內(nèi)動(dòng)脈瘤女孩的組織進(jìn)行了基因表達(dá)檢測(cè)，結(jié)果顯示編碼細(xì)胞外基質(zhì)組分的基因過(guò)表達(dá)，此外還有細(xì)胞外基質(zhì)降解，細(xì)胞黏附和抗黏附，細(xì)胞因子生成及細(xì)胞遷移的基因也發(fā)生顯著改變，在這些基因中包括了COL1A1基因。此外，在COL1A1突變的小鼠體內(nèi)，顱內(nèi)血管壁發(fā)育不良的概率要比正常對(duì)照組高[18]。結(jié)果表明COL1A1基因突變可能與顱內(nèi)囊性動(dòng)脈瘤相關(guān)發(fā)生發(fā)展相關(guān)。我們的結(jié)果顯示COL1A1基因在破裂的顱內(nèi)動(dòng)脈瘤患者中的表達(dá)有顯著升高，該結(jié)果提示COL1A1可能參與到顱內(nèi)動(dòng)脈瘤的病情進(jìn)展中。

本文也有一些不足之處:第一,患者數(shù)量相對(duì)較少，因此可能對(duì)基因的表達(dá)水平檢測(cè)的結(jié)果存在偏倚。第二，由于時(shí)間緊促，我們未對(duì)這些基因在顱內(nèi)動(dòng)脈瘤發(fā)生和發(fā)展中的具體作用及機(jī)制進(jìn)行明確，這需要在不遠(yuǎn)的未來(lái)通過(guò)進(jìn)一步的研究來(lái)證實(shí)。

綜上所述，我們的結(jié)果顯示破裂與未破裂顱內(nèi)動(dòng)脈瘤患者之間Fli-1及COL1A1的表達(dá)水平差異可能與動(dòng)脈瘤的破裂表現(xiàn)存在相關(guān)性?？筛鶕?jù)關(guān)鍵基因在患者體內(nèi)的表達(dá)水平，預(yù)測(cè)發(fā)生動(dòng)脈瘤破裂的可能性，這兩個(gè)基因可能在臨床上作為顱內(nèi)動(dòng)脈瘤是否破裂的預(yù)測(cè)因子。對(duì)于動(dòng)脈瘤患者能夠早發(fā)現(xiàn)、早預(yù)防、早治療，緩解疾病對(duì)病人造成的嚴(yán)重精神壓力和心理恐慌。也為早期診斷顱內(nèi)動(dòng)脈瘤，防止動(dòng)脈瘤破裂，在合適時(shí)間采取合適治療手段提供理論上的參考價(jià)值。

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(P>0.05), but correlated with the tumor size and subtotal resection(P<0.05).For the patients with positive COL6A1 expression in GBM, the overall survival time was obviously shorter than those with negative COL6A1 expression(P<0.05).ConclusionCOL6A1 may be involved in GBM development and progression, and it is considered as a new therapeutic target for GBM.

Key words: Collagen-Ⅵ-alpha-1； gliobastoma； survival

Differential expression of Fli-1 and its target genes in patients with intracranial aneurysm

WEI Liang, YANG Cheng, ZHANG Yanfei, WANG Qi, GUAN Hongxin, SUN Zhiyang*

(DepartmentofNeurosurgery,EastHospital,TongjiUniversitySchoolofMedicine,Shanghai200120,China；*Correspondingauthor,E-mail:dfsunzy@126.com)

ObjectiveTo investigate the expression of Fli-1 and its target genes in patients with intracranial aneurysm.MethodsBlood samples from 41 intracranial aneurysm patients(25 ruptured and 16 unruptured) and 10 healthy controls were collected. Peripheral blood mononuclear cells(PBMCs) were isolated for total RNA exaction. The expression of 3 candidate genes predicted by informatics method were assessed by real-time quantitative PCR.ResultsOf the 4 candidate genes, 2 differential expressed genes such as Fli-1 and COL1A1 were found in patients with intracranial aneurysm. Further analysis revealed that the expression of Fli-1 and COL1A1 gene was significantly increased in patients with ruptured intracranial aneurysm compared with those in unruptured patients.ConclusionDifferential expression of Fli-1 and COL1A1 between patients with and without ruptured intracranial aneurysm may be correlated with the ruptured phenotype in patients with intracranial aneurysm.

intracranial aneurysm; differential expressed genes; Fli-1; COL1A1

上海市衛(wèi)計(jì)委基金面上基金資助項(xiàng)目(201440319)

魏亮，男，1978-01生，碩士，副主任醫(yī)師，E-mail:weiliangdf@163.com

2016-09-03

R739.41

A

1007-6611(2016)11-1012-05

10.13753/j.issn.1007-6611.2016.11.013