王媛媛，張夢凡，查麗麗，郭 雨

(蚌埠醫(yī)學(xué)院公共課程部，安徽蚌埠 233030)

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川牛膝和懷牛膝多糖提取工藝研究

王媛媛，張夢凡，查麗麗，郭 雨

(蚌埠醫(yī)學(xué)院公共課程部，安徽蚌埠 233030)

以苯酚—硫酸法檢測多糖含量，采用單因素考察、正交試驗探究水煮提取法中料液比、提取時間、提取次數(shù)對川牛膝和懷牛膝多糖得率的影響并進行比較。結(jié)果表明，川牛膝多糖的最佳提取工藝為料液比1∶13(g/mL)，提取時間2h，提取次數(shù)3次；懷牛膝多糖的最佳提取工藝為料液比1∶13(g/mL)，提取時間4h，提取次數(shù)3次。兩種多糖的最佳提取工藝條件不同，為后期的活性比較及入藥選擇研究奠定基礎(chǔ)，為其工業(yè)化生產(chǎn)提供技術(shù)支持。

川牛膝；懷牛膝；多糖；提取工藝

川牛膝為莧科植物川牛膝(Cyathulae Radix)的干燥根，味甘、微苦，主要分布于四川、云南、貴州等省份，懷牛膝為莧科植物牛膝(Achyranthis Bidentatae Radix)的干燥根，味苦、酸，主要分布在河北、河南[1]。牛膝多糖是從牛膝中提取分離得到的一類具有較高生物活性的多糖，具有增強免疫、抑制腫瘤轉(zhuǎn)移、升高白細胞和保護肝臟的功能，被廣泛應(yīng)用于免疫調(diào)節(jié)和腫瘤治療[2-6]。目前關(guān)于兩種牛膝藥材的鑒別工作模糊，入藥選擇混亂，兩種牛膝多糖的提取工藝及藥理活性區(qū)別鮮有報道，本研究通過單因素考察和正交試驗探究川牛膝、懷牛膝多糖的最佳水煮提取工藝條件，為其工業(yè)化生產(chǎn)提供技術(shù)支持，同時，明確兩種牛膝多糖提取工藝條件的差別，為兩者的藥理活性及入藥選擇研究做準(zhǔn)備。

1 儀器與實驗材料

1.1 儀器

紫外分光光度計(U-3900型，美國日立公司)；電加熱器(ZNHW型，上?？粕齼x器有限公司)；高速離心機(JW-3021H型，安徽嘉文儀器裝備有限公司)；旋渦混合器(XW-80A型，海門市其林貝爾有限公司)；移液器(Pipette型，上海盛創(chuàng)有限公司)；分析天平(FA2004型，天津天馬衡基儀器有限公司)；中草藥粉碎機(HK-02A型，廣州市旭朗機械設(shè)備有限公司)。

1.2 實驗材料

川牛膝飲片(20160101，產(chǎn)地四川，購于安徽亳州)；懷牛膝飲片(20160101，產(chǎn)地河南，購于安徽亳州)；苯酚(AR，20130811，天津市大茂化學(xué)試劑廠)；硫酸(AR，XK 13-011-00022，江蘇彤晟化學(xué)試劑有限公司)；D-無水葡萄糖(AR，20130808，天津市大茂化學(xué)試劑廠)；其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 苯酚—硫酸法測多糖含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線

精密吸取0.1g/L的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL，用去離子水補至2.0mL，依次加入1.0mL 5%苯酚溶液，5.0mL硫酸，用旋渦混合器振蕩5min，室溫下靜置30min，波長為490nm處分別測各樣品的吸光度值，以濃度作為橫坐標(biāo)(X)，吸光度值作為縱坐標(biāo)(Y)繪制葡萄糖含量標(biāo)準(zhǔn)曲線。如圖1所示，得到線性回歸方程Y=11.114X+0.02814，R=0.9956，在0.00～0.05g/L濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2 單因素實驗考察多糖提取的最佳條件

2.2.1 最佳料液比

稱取10g粉碎后的川牛膝、懷牛膝飲片各5份，料液比(g/mL)分別為：1∶8、1∶10、1∶12、1∶14、1∶16，100℃下加熱回流1h進行水煮提取，提取液蒸發(fā)濃縮，用去離子水定容到100mL。取200uL進行苯酚-硫酸法顯色反應(yīng)，計算兩種多糖得率，如圖2所示。結(jié)果表明，川牛膝多糖最佳料液比為1∶14，懷牛膝多糖最佳料液比為1∶12。

圖2 料液比對多糖得率的影響

2.2.2 最佳提取時間

稱取10g粉碎后的川牛膝、懷牛膝飲片各5份，川牛膝料液比(g/mL)1∶14，懷牛膝料液比(g/mL)1∶12在100℃下分別加熱回流1h、2h、3h、4h、5h，提取液蒸發(fā)濃縮，用去離子水定容到100mL。取200uL進行苯酚-硫酸法顯色反應(yīng)，計算兩種多糖得率，如圖3所示。結(jié)果表明，川牛膝最佳提取時間為2h，懷牛膝最佳提取時間為4h。

圖3 提取時間對多糖得率的影響

2.2.3 最佳提取次數(shù)

稱取10g粉碎后的川牛膝、懷牛膝飲片藥材各5份，川牛膝料液比(g/mL)1∶14，100℃下加熱回流2h，懷牛膝料液比(g/mL)1∶12，100℃下加熱回流4h，分別提取1、2、3、4、5次，合并提取液，蒸發(fā)濃縮，用去離子水定容到100mL。取200uL進行苯酚-硫酸法顯色反應(yīng)，計算兩種多糖得率，如圖4所示。結(jié)果表明，川牛膝最佳提取次數(shù)2次，懷牛膝最佳提取次數(shù)為1次。

圖4 提取次數(shù)對多糖得率的影響

2.2.4 正交試驗考察多糖提取的最佳條件

因素水平設(shè)定見表1，設(shè)計L9(34)正交實驗，稱取川牛膝、懷牛膝飲片粉碎后樣品10g各九份，以一定的料液比、提取時間及次數(shù)，分別在100℃下加熱回流，合并提取液，蒸發(fā)濃縮，用去離子水定容到100mL。取200uL進行苯酚-硫酸法顯色反應(yīng)，計算兩種多糖得率并進行比較，結(jié)果如表2、表3所示。

表1 兩種多糖提取的因素水平表

表2 兩種多糖提取的正交試驗結(jié)果

表3 兩種多糖提取的方差分析表

川牛膝多糖：F0.05(2,2)=19.000，F(xiàn)0.1(2,2)=9.0000

懷牛膝多糖：F0.05(2,4)=6.9443，F(xiàn)0.1(2,4)=18.0000

由表2極差分析結(jié)果表明，川牛膝多糖：影響因素C>A>B，即對多糖得率的影響因素中，提取次數(shù)>料液比>提取時間，最佳提取條件為A1B2C3，即料液比1∶13，提取時間2h，提取次數(shù)為3次；懷牛膝多糖：影響因素C>B>A，即對多糖得率的影響因素中，提取次數(shù)>提取時間>料液比，最佳提取條件為A3B2C3，即料液比1∶13，提取時間4h，提取次數(shù)為3次，D是空白因素水平，可以在一定程度上反應(yīng)出實驗誤差對實驗結(jié)果的影響。

由表3方差分析結(jié)果表明，所選取的各因素中，提取次數(shù)為多糖得率的顯著性影響因素，這一結(jié)果和極差分析結(jié)果一致，即提取次數(shù)是多糖得率的主要影響因素。

3 討論

單因素考察結(jié)果表明，川牛膝多糖最佳料液比為1∶14，最佳提取時間為2h，最佳提取次數(shù)為2次，懷牛膝多糖最佳料液比為1∶12，最佳提取時間為4h，最佳提取次數(shù)為1次。根據(jù)此考察結(jié)果制定正交試驗設(shè)計的因素水平表。

正交試驗設(shè)計結(jié)果表明，所選取的因素中，提取次數(shù)對兩種多糖的得率具有顯著性影響，川牛膝多糖最佳提取工藝為：料液比1∶13，提取時間2h，提取次數(shù)為3次；懷牛膝多糖最佳提取工藝為：料液比1∶13，提取時間4h，提取次數(shù)為3次。川牛膝和懷牛膝多糖提取工藝明顯不同，揭示在兩種多糖的工業(yè)生產(chǎn)過程中應(yīng)注重兩種藥材的鑒別及提取方法的區(qū)別，同時，深入探究兩種多糖最佳的提取工藝，提高原藥材利用率，可為后期活性評價研究及入藥選擇工作奠定基礎(chǔ)。

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(2015年版 一部)[M].北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2015:38,72.

[2]Feng H B,Du X G,Cao X H,et al.Enhancement of the immune responses to ovalbumin in mice by oral administration of the extract from Radix Cyathulae(RC)[J].Journal of Medicinal Plants Research,2013(19):1272-1279.

[3]Chen C,Wu H,Xu X J,et al.Chain conformation and anti-tumor activity of derivatives of polysaccharide from Rhizoma Panacis Japonici[J].Carbohydrate Polymers: Scientific and Technological Aspects of Industrially Important Polysaccharides,2014(1):308-316.

[4]Xie F,Sakwiwatkul K,Zhang C R,et al.Atractylodis macrocephalae Koidz. polysaccharides enhance both serum IgG response and gut mucosal immunity[J].Carbohydrate Polymers: Scientific and Technological Aspects of Industrially Important Polysaccharides,2013(1):68-73.

[5]Liu T,Ye L G,Guan X Q,et al.Immunopontentiating and antitumor activities of a polysaccharide from Pulsatillachinensis (Bunge) Regel[J].International Journal of Biological Macromolecules: Structure,Function and Interactions,2013(3):225-229.

[6]王艷星.牛膝多糖免疫調(diào)節(jié)作用及其機制的研究[D].溫州:溫州醫(yī)科大學(xué),2014

Research on the Extraction Process of Polysaccharides in Cyathulae Radix and Achyranthis Bidentatae Radix

WANG Yuan-yuan,ZHANG Meng-fan,ZHA Li-li,GUO Yu

(Department of Public Courses,Bengbu Medical College,Bengbu Anhui 233030,China)

The different factors that affecting the yield of polysaccharides in Cyathulae Radix and Achyranthis Bidentatae Radix by water decocting extraction,including the ratio of solid to liquid,extraction time and extraction times,were detected and compared by the single factor investigation and the orthogonal experiment,while the contents of polysaccharides were detected by phenol-sulfuric acid method. The results showed that the best extraction process of the polysaccharide in Cyathulae Radix was as followes: the ratio of solid-liquid was 1∶13(g/mL),extracted for 2h and repeated for 3times,and the best extraction process of the polysaccharide in Achyranthis Bidentatae Radix was as followed: the ratio of solid-liquid was 1∶13(g/mL),extracted for 4h and repeated for 3times. The optimum conditions of the two kinds of polysaccharides are different,which will lay a foundation for the further studies such as active comparison and selection of medicine of the two polysaccharides,and the results could also provide technical support for industrialize production of the two polysaccharides.

Cyathulae Radix;Achyranthis Bidentatae Radix;polysaccharide;extraction process

2016-08-26

安徽省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目“兩種牛膝多糖的制備及免疫調(diào)節(jié)活性比較”(201510367001)；蚌埠醫(yī)學(xué)院自然科學(xué)研究項目“兩種牛膝藥材多糖的制備及抗炎、免疫調(diào)節(jié)活性比較研究”(BYKY1658)。

王媛媛(1988- )，女，助教，碩士，從事天然產(chǎn)物分析與應(yīng)用研究。

R917

A

2095-7602(2016)10-0077-05