張玉峰，劉瑩瑩，李叢勝，畢艷孟，申磊

（1.廊坊師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，河北廊坊065000；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，北京100193）

河北地區(qū)蚯蚓種群遺傳多樣性分析

張玉峰1，劉瑩瑩1，李叢勝1，畢艷孟2，申磊1

（1.廊坊師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，河北廊坊065000；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，北京100193）

為了探討蚯蚓遺傳多樣性與土壤環(huán)境的關(guān)系，2015年6～10月在河北地區(qū)進(jìn)行蚯蚓資源調(diào)查和樣品采集，利用PCR技術(shù)擴(kuò)增線粒體基因16S rDNA、ND1序列，分析了該區(qū)蚯蚓優(yōu)勢(shì)種類天錫杜拉蚓（Drawida gisti）的遺傳多樣性。結(jié)果表明：來(lái)自河北23個(gè)采集點(diǎn)的研究樣本，16S、ND1全部DNA序列的平均單倍型多樣性分別為0.76和0.64，平均核苷酸多樣性分別為0.042和0.039，群體間平均遺傳距離分別為0.045和0.054。土壤性質(zhì)顯著影響種群的遺傳變異水平。

蚯蚓；天錫杜拉蚓；遺傳多樣性；土壤性質(zhì)；河北地區(qū)

蚯蚓為大型土壤動(dòng)物，在土壤的許多理化過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，如，松動(dòng)土壤，增加土壤的通氣性和持水能力，促進(jìn)土壤有機(jī)質(zhì)的合成與分解。近些年，有關(guān)陸棲寡毛類動(dòng)物的分子生態(tài)學(xué)研究較少，King等[3]采用AFLP技術(shù)研究了英國(guó)正蚓科蚯蚓潛在的物種多樣性，證明地理隔離對(duì)促進(jìn)新種的形成具有重要影響；Buckley等[4]使用16S和28S rRNA對(duì)新西蘭環(huán)毛蚓的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系進(jìn)行了分析，并結(jié)合新西蘭地質(zhì)演化史上的一系列重大地質(zhì)事件，推斷了蚯蚓物種群間的遺傳分化時(shí)間以及地質(zhì)事件對(duì)生物多樣性的影響。在我國(guó)，有關(guān)土壤動(dòng)物分子生態(tài)學(xué)的研究鮮有報(bào)道[5～7]。天錫杜拉蚓（Drawida gisti）屬寡毛綱（Oligochaeta）鏈胃科（Moniligastridae）杜拉蚓屬（Drawdia），是我國(guó)一種常見(jiàn)的淺居型（epi-endogeic）蚯蚓，經(jīng)?；顒?dòng)于土壤表層，偏愛(ài)生境為農(nóng)家菜園和玉米地[1]。天錫杜拉蚓在我國(guó)分布范圍廣泛，吉林、安徽、湖北、江蘇等地均有分布[2]。2015年6～10月在河北地區(qū)進(jìn)行蚯蚓樣本的野外采集時(shí)，亦發(fā)現(xiàn)天錫杜拉蚓為該地區(qū)的優(yōu)勢(shì)種類。作者通過(guò)線粒體基因片段分析了天錫杜拉蚓的遺傳多樣性，并探究了土壤理化性質(zhì)對(duì)其種群遺傳多樣性的影響，以證明蚯蚓多樣性對(duì)土壤環(huán)境的依賴性。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

河北省地處華北平原，毗鄰內(nèi)蒙古高原，東臨渤海，西望太行山；區(qū)域內(nèi)環(huán)繞京、津兩大城市，東北

部與遼寧省交界，南部、東南部分別與河南和山東兩省接壤；地勢(shì)由西北向東南傾斜，地貌類型主要為平原、山地、高原等，土壤類型主要有褐土和潮土。該區(qū)氣候條件較好，四季分明，雨熱同期，屬于典型的溫帶大陸性季風(fēng)氣候；氣溫分布特征呈西、南高，東、北低；年降水量總趨勢(shì)是東南部地區(qū)多于西北部地區(qū)[8]。本研究的蚯蚓樣品采集點(diǎn)主要分布在平原地區(qū)，共23個(gè)（表1）。

表1 各研究地點(diǎn)的地理位置與土壤養(yǎng)分含量Table1 Geographic location and content of soil nutrient in each site

1.2 試驗(yàn)材料

蚯蚓分布的主要生境為農(nóng)田、果園、潮濕的枯枝落葉層等。在每采集點(diǎn)，均采用五點(diǎn)法取樣，樣方大小為50 cm（長(zhǎng)）×50 cm（寬）×20 cm（深），利用挖掘法采集蚯蚓。依據(jù)《中國(guó)陸棲蚯蚓》[2]進(jìn)行蚯蚓的形態(tài)學(xué)鑒定，選取形態(tài)特征明顯的性成熟天錫杜拉蚓作為研究群體。試驗(yàn)蚯蚓在采集當(dāng)日用70%酒精處死，保存于95%酒精中，備用。

1.3 試驗(yàn)方法

以蚯蚓尾部體壁組織為材料，利用試劑盒DNeasy Tissue&Blood kit（QIAGEN）提取DNA。

PCR擴(kuò)增與DNA測(cè)序。16S引物序列：上游CTT AAA GAT TTT GGC GGT GTC，下游CTC TTG CAC GGT TAG GAT AC；ND1引物序列：上游GAA TAG TGC CAC AGG TTT AAA C，下游TTA ACG TCA TCA GAG TTA TC。PCR反應(yīng)體系組分與反應(yīng)條件見(jiàn)張玉峰[6]。采用1%瓊脂糖凝膠電泳，檢測(cè)PCR產(chǎn)物質(zhì)量。測(cè)序工作由北京金唯智公司完成，DNA測(cè)序引物與PCR上游引物相同。對(duì)測(cè)序峰圖雜亂的DNA樣品，進(jìn)行重復(fù)擴(kuò)增與測(cè)序。

通過(guò)DNASTAR v.7.1.0軟件中的SeqMan應(yīng)用程序，對(duì)DNA序列進(jìn)行觀察、對(duì)齊、刪除空隙和兩端雜亂序列信號(hào)并轉(zhuǎn)換.ab1格式結(jié)果為FASTA格式。將測(cè)序結(jié)果經(jīng)BLAST在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行序列相似性搜索，與其相匹配的序列是蚯蚓16S rRNA、ND1等基因序列，并且匹配度均＞90%，說(shuō)明擴(kuò)增和測(cè)序結(jié)果準(zhǔn)確可靠。利用分子遺傳軟件MEGA 5.0[10]計(jì)算各地理群體之間的遺傳距離（Kimura 2-Pairwise distance），分析各組DNA序列的堿基頻率、保守位點(diǎn)和變異位點(diǎn)。利用DNaSP 5.0軟件[11]，分析單倍型多樣性指數(shù)（h）、單倍型數(shù)量（H）與分布、核苷酸多樣性指數(shù)（Pi）。

利用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件，對(duì)天錫杜拉蚓的遺傳多樣性與土壤環(huán)境要素進(jìn)行相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA序列組成與多態(tài)性

16S、ND1全部DNA序列的平均單倍型多樣性分別為0.76和0.64，平均核苷酸多樣性分別為0.042和0.039。從各地理種群的單倍型多樣性和核苷酸多樣性信息（表2）可以看出，不同地理群體中，16S片段、ND1片段的單倍型多樣性范圍分別為0.12～0.90和0.15～1.00，核苷酸多樣性范圍分別為0～0.050和0～0.380。對(duì)DNA序列進(jìn)行編輯、剪接，結(jié)果顯示，16S rRNA有效片段長(zhǎng)度為524 bp，ND1序列有效長(zhǎng)度為685 bp。ND1序列中有392個(gè)變異位點(diǎn)，其中，簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)186個(gè)，單核苷酸多態(tài)位點(diǎn)206個(gè)；16S序列中有363個(gè)變異位點(diǎn)，其中，簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)247個(gè)，單核苷酸多態(tài)位點(diǎn)116個(gè)。廊坊群體的DNA隔離位點(diǎn)與堿基顛換數(shù)較高，而承德群體的堿基轉(zhuǎn)換數(shù)較高。DNA序列變異位點(diǎn)比例分別為14.8%（ND1）、13.0%（16S）。16S和ND1序列中腺嘌呤和胸腺嘧啶含量豐富（64.6%，65.4%）。群體間平均遺傳距離（表3）分別為0.045（16S）、0.054（ND1）。

表2 蚯蚓測(cè)序樣本的遺傳多樣性Table2 Genetic diversity of earthworm sequencing samples

表3 地理群體間K2-P遺傳距離Table3 Kimura 2-Pairwise Genetic distances between geographic groups

2.2 蚯蚓遺傳多樣性與土壤養(yǎng)分含量的相關(guān)性

ND1序列的單倍型數(shù)量與土壤有機(jī)碳含量呈極顯著正相關(guān)（r=2.167，P＜0.01）、與全氮含量呈顯著正相關(guān)（r=8.648，P＜0.05），獨(dú)享單倍型數(shù)量和單倍型多樣性均與土壤速效磷含量呈顯著負(fù)相關(guān)（r分別為-0.070 6和-0.013 3，P均＜0.05）；其他遺傳多樣性

指標(biāo)與土壤養(yǎng)分含量的相關(guān)性均不顯著。

3 結(jié)論與討論

Edwards[1]指出陸棲蚯蚓的分布與土壤性質(zhì)具有密切關(guān)系，其與同事們首次提出了環(huán)境因子可能對(duì)陸棲蚯蚓的遺傳多樣性產(chǎn)生影響，蚯蚓種群遺傳變異與土壤因子之間具有一定的相關(guān)性，因此，可能起因于祖先種在土壤環(huán)境中的遷移、定居所形成的現(xiàn)有種群格局是在環(huán)境因子的作用下所形成的遺傳格局，而不是形態(tài)學(xué)格局。Novo等[12]研究表明，基于COI序列的西班牙陸棲蚯蚓（Hormogaster elisae）遺傳距離與土壤類型具有顯著的相關(guān)性，而遺傳距離、土壤理化性質(zhì)與蚯蚓體長(zhǎng)之間的相關(guān)性均不明顯。本研究結(jié)果顯示，D.gisti種群內(nèi)遺傳距離與土壤因子之間的相關(guān)性不顯著，而地理群體的單倍型數(shù)量、核苷酸多樣性與土壤理化性質(zhì)（有機(jī)碳、全氮、速效磷含量）之間具有顯著的相關(guān)性。雖然這些研究類群和研究結(jié)果略有不同，但在土壤性質(zhì)影響蚯蚓種群遺傳多樣性的研究結(jié)論上均較為一致。然而，背暗流蚓（Aporrectodea caliginosa）單倍型的分布狀況與土壤因子之間并沒(méi)有顯著的相關(guān)性[13]。正蚓科蚯蚓，如背暗流蚓為表?xiàng)停╡pigeic）蚯蚓，可能是由于長(zhǎng)期生活在土壤表面的潮濕枯枝落葉層下，并未深入到土壤中生活，所以土壤性質(zhì)的改變對(duì)其遺傳變異的影響較小；而天錫杜拉蚓隸屬鏈胃蚓科，為淺居型或上食下居型（epiendogeic）。因此，蚯蚓種類的分類學(xué)差異、生態(tài)習(xí)性以及對(duì)土壤偏愛(ài)程度的差異可能是上述結(jié)論存在差異的主要原因。Novo等[12]利用地理距離隔離模型（IBD）解釋了西班牙陸棲蚯蚓高度的遺傳變異，地理種群之間距離越遠(yuǎn)，其遺傳變異程度越高。此外，不同的分類地位、生活習(xí)性差異、基因片段長(zhǎng)度也是遺傳差異的重要因素。

本研究運(yùn)用線粒體部分基因片段對(duì)河北地區(qū)蚯蚓種群多樣性進(jìn)行分析，并探究了多樣性的影響因素，結(jié)果表明：（1）基于線粒體16S基因的天錫杜拉蚓種群遺傳變異水平略低于ND1基因；（2）遺傳多樣性與部分土壤理化指標(biāo)具有顯著的相關(guān)性。這為我國(guó)蚯蚓分子生態(tài)學(xué)的發(fā)展提供了重要的基礎(chǔ)資料。

但是，本次研究仍有如下問(wèn)題有待后續(xù)深入探索。（1）各采集地點(diǎn)蚯蚓樣本數(shù)量差異是對(duì)種群遺傳多樣性，尤其是單倍型分布以及多樣性分析的一個(gè)重要影響因素。因此，進(jìn)一步拓展蚯蚓的采集地點(diǎn)，是未來(lái)研究中值得重視的問(wèn)題。（2）利用16S、ND1序列等引物可以對(duì)天錫杜拉蚓擴(kuò)增出有效片段，而COI通用引物以及重新設(shè)計(jì)的引物均不能有效地?cái)U(kuò)增出相應(yīng)的PCR產(chǎn)物，因此，優(yōu)化已知基因PCR反應(yīng)所需的擴(kuò)增引物，也是未來(lái)需要解決的一個(gè)熱點(diǎn)問(wèn)題。

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Analysis of Genetic Diversity of Drawida gisti and Soil Properties

ZHANG Yu-feng1，LIU Ying-ying1，LI Cong-sheng1，BI Yan-meng2，SHEN Lei1
（1.College of life Sciences，Langfang Teachers University，Langfang 065000，China；2.College of Resources and Environmental Sciences，China Agricultural University，Beijing 100193，China）

The study aimed to discussing relation between earthworm genetic diversity and soil environment.Based on field studies conducted from July to October 2015，it was analyzed the genetic diversity of Drawida gisti using mitochondrial 16S and ND1 genes which were amplified by PCR in samples obtained from twenty-three localities，DNA polymorphism within and between groups was analyzed.The average haplotye diversity based on 16S and ND1 genes were 0.76 and 0.64，respectively，mean nucleotide diversity were 0.042 and 0.039，respectively，mean genetic distance between groups were 0.045 and 0.054，respectively.Genetic variation was significantly influenced by soil properties.

Earthworm；Drawida gisti；Genetic diversity；Soil properties；Hebei District

Q958

A

1008-1631（2016）04-0045-04

2016-01-06

河北省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（C2015408038）；河北省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練項(xiàng)目(201510100034)；河北省高等學(xué)?？茖W(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目（QN2014055）；廊坊師范學(xué)院博士自然科學(xué)基金項(xiàng)目（LSBS201305）

張玉峰（1982-），男，河北滄州人，講師，博士，主要從事土壤動(dòng)物生態(tài)學(xué)工作。E-mail：805758301@qq.com。