□ 鞠佳玥　趙玉靜　煙臺大學

病毒對蘋果香氣成分影響的探究

□ 鞠佳玥趙玉靜煙臺大學

以脫毒蘋果和未脫毒蘋果為原料，采用HS-SPME技術萃取蘋果中的香氣成分，GC-MS技術測定蘋果中的香氣成分，通過比較脫毒蘋果與未脫毒蘋果香氣成分的含量和種類的差異，找出脫毒蘋果的特征香氣，得出病毒侵染對蘋果香氣成分的影響。經(jīng)研究，脫毒蘋果香氣成分主要有酯類、醇類、酸類、醛類、酰胺類、烯類和其他類化合物，未脫毒蘋果的香氣成分主要是酸類、酯類和醇類和烯類和其他類化合物。脫毒蘋果特有的香氣成分為：丙酸芳樟酯、乙酸異戊酯、苯甲酸乙酯、癸酸乙酯、1,2－苯二甲酸二酯、月桂酸乙酯、己酸乙酯、月桂醇、正己醇、十一醇、丁二醇、2－甲基－2－丁醇、6－甲基－3－庚醇、4－甲基甘露醇、雪松醇、3－酞酰亞氨甲基苯甲酸、碳酸等。病毒侵染使得蘋果的香氣物質種類減少，含量下降。

脫毒蘋果 未脫毒蘋果 香氣成分

1　蘋果的經(jīng)濟價值及社會地位

蘋果為薔薇科落葉喬木，是世界上種植面積最廣的一種果樹，我國蘋果的種植面積和產(chǎn)量都居世界第一。蘋果果實含有大量的營養(yǎng)物質，如糖分、膳食纖維、鈣、鐵、維生素C、維生素B1、維生素B2等30多種人體所需物質[1]。

2　蘋果病毒概述及目前的預防研究

蘋果病毒在我國廣泛發(fā)生，已成為限制我國蘋果優(yōu)質高產(chǎn)的關鍵因素[1]。目前已在我國發(fā)現(xiàn)并鑒定的蘋果病毒有：蘋果花葉病毒(Apple mosaic virus,ApMV)、蘋果褪綠葉斑病毒(Apple chlorotic leaf spot virus,ACLSV)、蘋果凹果類病毒(Apple dimple fruit viroid,ADFVd)[2]，蘋果一旦感染上病毒就很難治愈。由于蘋果病毒是通過嫁接傳染，無傳毒介體，所以栽培無毒苗木是防治的主要途徑[3]，蘋果病毒的危害日益受到栽培者的重視[4]。針對這種情況，近年來，宋來慶、李元軍、趙玲玲等人[5]采用熱處理的方法培育出脫毒“煙富3號”蘋果苗木，成為近年來最暢銷的蘋果苗木之一。但大眾無法區(qū)分脫毒蘋果與非脫毒蘋果，容易造成兩種蘋果的混淆。目前，科學工作者通過對其多項指標進行檢測來區(qū)分，但操作復雜，涉及的步驟較多，實驗數(shù)據(jù)龐大，處理數(shù)據(jù)消耗時間較長，不僅浪費資金，而且緩慢的檢測速度不能滿足廣大市場對蘋果的需求。

3　蘋果香氣成分探究的目的及意義

果實香氣是反映果實風味品質的重要指標之一，研究蘋果香氣物質對提高蘋果品質、進行優(yōu)選育種及其深加工具有重要意義。果實香氣源于某些揮發(fā)性物質，目前，蘋果香氣中已鑒定出350多種成分，但只有含量超過其味感閾值的物質成分才會對果實風味的形成起重要作用，同一個果實的不同部位，致香物質的含量也有差異[6]。本次探究主要針對病毒對蘋果果實及其葉子揮發(fā)性成分的影響，通過比較脫毒蘋果與非脫毒蘋果香氣成分種類和含量的差別，找出脫毒蘋果具有的特征香氣成分，將其轉化為一項或簡單的幾項指標，通過該特征香氣來判斷樣品蘋果是“脫毒蘋果”還是非脫毒蘋果，為蘋果的病毒檢測提供一種新手段。

4　研究方法

4.1頂空固相微萃?。℉S-SPME）

頂空固相微萃取是一種無溶劑萃取技術，它集采樣、萃取、濃縮、進樣于一體，具有簡單、快速、高效、無污染、便攜、靈敏度高[7]、易于與其他儀器聯(lián)用等優(yōu)點，已被廣泛應用于揮發(fā)性成分分析[8]。該方法優(yōu)化了分析條件，建立了快速測定香氣物質的方法，在常見香氣物質的質量濃度范圍內有良好的線性關系，對常見香氣物質的定量比較準確[9]?？煽焖贆z測出蘋果所含的幾百種香氣成分，具有高效、便捷、快速、準確的特點。

4.2 氣相色譜質譜聯(lián)用(GC-MS)

色譜法一般是由固定相和流動相組成。氣相色譜法的流動相是氣體，因此要求樣品應在色譜柱內轉化成氣體。根據(jù)分配系數(shù)的差異，使樣品在固定相與氣相之間分離。通過峰的形狀、大小對物質進行定性分析，通過保留時間、峰面積、內標物的峰面積及濃度來對物質進行定量分析。質譜法是利用電磁學、質核比(m/z)對物質進行分離分析的一種方式。采用SPME與GC-MS結合，對揮發(fā)性物質進行鑒定分析，并優(yōu)化了SPME條件，為進一步研究揮發(fā)性物質的種類和含量提供理論和數(shù)據(jù)支持[10]。此方法可以快速處理大量實驗數(shù)據(jù)，找出脫毒蘋果和非脫毒蘋果的香氣成分區(qū)別。

5　實驗儀器及試劑

5.1實驗儀器

GC-MS-2010q氣質聯(lián)用儀：日本島津公司；SPME纖維萃取頭CAR/DVB/PDMS（50μm/30μm）：美國Supelco公司；SPME手動進樣手柄：美國Supelco公司；DB-Wax色譜柱（30m×0.25mm×0.25μm）：美國Agilent公司；DF-101Z集熱式恒溫加熱磁力攪拌器：河南省予華儀器有限公司；分析天平：福州華志科學儀器有限公司；微量進樣器（10μL）：上海市安亭微量進樣器廠；移液管：5mL、10mL。

5.2實驗樣品和試劑

喬納金蘋果葉、嘎啦蘋果葉：煙臺市棲霞蘋果園采摘；脫毒蘋果葉：煙臺農(nóng)科院提供；NaCl（分析純）：上海國藥集團；3-辛醇（色譜純）：美國Sigma-Aldrich公司。

6　實驗方法

6.1樣品預處理

將已采集的嘎啦、喬納金及脫毒蘋果的蘋果葉進行剪碎，并放入研缽中研碎。利用分析天平稱量，每組等分后做2份樣品（約0.5g/份），將已分好的樣品放入保鮮膜中密封保存，并貼好標簽備用，依次為1～6號。

6.2萃取條件的設定

在之前實驗的研究基礎上對萃取的條件進行設定[11]。

萃取時間5min，萃取溫度50℃，預平衡時間5min，解析時間5min。

6.3GC-MS條件的設定

在之前實驗的研究基礎上對氣相色譜-質譜聯(lián)用儀的參數(shù)進行設定[12]。

GC條件：色譜柱為DB-Wax（30m×0.25mm× 0.25μm）；進樣口溫度：230℃；檢測器溫度230℃；載氣：He；流速：3mL/min；分流比為50.0。

升溫程序：初始溫度（起始柱溫）40℃，保持2min，后以6℃/min的速度升溫至100℃，再以5℃/min的速度升溫至200℃，最后再以10℃/min的速度升到230℃，保持5min。

MS條件：EI電離源；電子能量70eV；離子源溫度200℃；接口溫度230℃；掃描范圍m/z 30～500。

6.4實驗步驟

①將已預處理好的樣品1號喬納金蘋果葉加入到15mL棕色萃取瓶（內含轉子）中，利用5mL移液管取4mL氯化鈉飽和溶液加入，再利用10μL的微量進樣器取3-辛醇加入（3-辛醇濃度為101mg/L）。

②將15mL棕色萃取瓶放入恒溫加熱磁力攪拌器中，設定萃取溫度50℃，預平衡時間5min并采用秒表計時，然后先將涂有PDMS涂層的纖維萃取頭調到2cm刻度處，插入到萃取瓶后再將黑柄推下進行萃取，注意針頭不要接觸液面，采用秒表計時5min。

③萃取完畢后，先將黑柄往上提再將纖維萃取頭拔出，并調至2.6cm刻度處，待氣質聯(lián)用儀的電腦顯示綠色Ready，則進針于GC-MS中，再按start鍵開始測定，解析時間5min后將針提出，運行時間40min。

④樣品2～6號重復上述步驟進行測定。

⑤將各個樣品的總離子流色譜圖和揮發(fā)性成分種類圖的數(shù)據(jù)進行完善并保存。

6.5揮發(fā)性成分的定量計算方法

采用內標物（本實驗為3-辛醇）計算出各個揮發(fā)性物質的相對含量，計算公式為：

7　結果與討論

脫毒葉子與不脫毒葉子最大的揮發(fā)性成分差異為：醛類物質所占的比重遠遠超過普通葉子為20%以上，而普通葉子醛類的比重均在10%以下，這可能與通過一定手段對蘋果樹脫毒有關；脫毒葉子酯類、醇類和醛類所占比重均在20%左右，為揮發(fā)性成分的主要種類；酸類物質所占的比重較普通葉子略高；肼類物質略有下降，低于普通葉子；脫毒葉子出現(xiàn)苯類物質，占2%左右。對于喬納金、嘎啦及脫毒蘋果葉這3種品種中所檢測出來的揮發(fā)性成分的主要物質來看，有約10種物質在脫毒葉子中未檢測到。

圖1　不同種類蘋果葉揮發(fā)性成分所占比重

8　結論

對于喬納金、嘎啦及脫毒蘋果葉這3種樣品，經(jīng)HSSPME萃取后再經(jīng)GC-MS方法分析確定了其主要揮發(fā)性成分，并采用峰面積歸一化法比較脫毒與不脫毒葉子之間的差異，對于監(jiān)控蘋果的健康狀況、提高或改善蘋果的品相品質具有重要意義。

從各種類的香氣成分所占比重來分析，脫毒葉子中醛類物質所占的比重遠遠超過普通葉子為20%以上，而普通葉子醛類的比重均在10%以下；脫毒葉子揮發(fā)性成分主要種類為酯類、醇類和醛類，所占比重均在20%左右；酸類物質所占的比重較普通葉子略高；肼類物質略有下降，低于普通葉子；脫毒葉子出現(xiàn)苯類物質，占2%左右。

從具體的揮發(fā)性物質來分析，喬納金與嘎啦蘋果葉中所共有的十種成分在脫毒蘋果葉中未檢出，為6-甲基3-庚醇、3-辛烯-1-醇、氨基草酰肼、1,1-二甲基乙基肼、5-甲基-2-（1-甲基乙基）反式環(huán)己酮、五氟酸庚酯、乙醇醛二聚體、2-辛醇、5-甲基-2-（1-甲基乙基）-環(huán)己醇。

通過結合以上兩種手段，可以建立一種檢測果樹是否感染病毒的方法和理論體系，對于檢測果樹的健康成長以及指導農(nóng)業(yè)生產(chǎn)具有積極的作用。

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