譚德敏 向 陽(yáng) 譚千林

(湖北民族學(xué)院附屬民大醫(yī)院,恩施445000)

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狼瘡性腎炎患者外周血樹(shù)突狀細(xì)胞功能的研究

譚德敏 向 陽(yáng) 譚千林

(湖北民族學(xué)院附屬民大醫(yī)院,恩施445000)

目的： 體外培養(yǎng)狼瘡性腎炎患者外周血樹(shù)突狀細(xì)胞，并從細(xì)胞的表型和功能方面觀察與對(duì)照組樹(shù)突狀細(xì)胞的不同，從而探討樹(shù)突狀細(xì)胞在狼瘡性腎炎疾病的發(fā)病機(jī)理。方法：選取50例健康對(duì)照者與50例狼瘡性腎炎患者，收集狼瘡性腎炎患者 及健康對(duì)照組的外周血 ，體外給予10 ng/ml GM-CSF及IL-4的血清培養(yǎng)液培養(yǎng)，并在第7天，收集細(xì)胞及上清，運(yùn)用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)DCs表型表達(dá)，ELISA方法檢測(cè)細(xì)胞上清TNF-α、 IL-12含量變化，檢測(cè)樹(shù)突狀細(xì)胞刺激淋巴細(xì)胞增殖的能力。結(jié)果：與對(duì)照組相比，狼瘡性腎炎患者外周血樹(shù)突狀細(xì)胞表面表達(dá)的CD80、CD86、CD40及MHCⅡ數(shù)量明顯高于對(duì)照組，差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；樹(shù)突狀細(xì)胞分泌的TNF-α、 IL-12明顯高于對(duì)照組，差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；樹(shù)突狀細(xì)胞刺激淋巴細(xì)胞增值反應(yīng)能力明顯高于對(duì)照組，差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論：相比于健康對(duì)照組，狼瘡性腎炎患者外周血樹(shù)突狀細(xì)胞呈現(xiàn)較成熟的狀態(tài)，提示樹(shù)突狀細(xì)胞與狼瘡性腎炎疾病具有很大的相關(guān)性。

樹(shù)突狀細(xì)胞；狼瘡性腎炎；成熟

狼瘡性腎炎(Lupus nephritis，LN)是一種多種因素導(dǎo)致的復(fù)雜性疾病，其致病機(jī)制至今未明，但多種研究認(rèn)為其與免疫因素密切相關(guān)[1]。樹(shù)突狀細(xì)胞(Dendritic cells,DCs)作為機(jī)體內(nèi)最重要的抗原遞呈細(xì)胞，在機(jī)體起著重要作用。成熟的樹(shù)突狀細(xì)胞可以高表達(dá)多種共刺激因子，如CD86、CD80、CD40、MHCⅡ等，高分泌多種細(xì)胞因子，如IL-12、TNF-γ，誘導(dǎo)幼稚的T細(xì)胞分化成熟，促進(jìn)T細(xì)胞向Th1/Th2極化，從而激活免疫應(yīng)答[2-4]。鑒于DCs在免疫系統(tǒng)中的重要作用，我們推測(cè)DCs在LN患者的發(fā)病機(jī)制中起到了重要的作用。因此，本研究提取LN患者的外周血，分離純化得到DCs，觀察DCs的表型和功能的變化，來(lái)探討DCs在LN疾病發(fā)生發(fā)展的意義。

1 對(duì)象與方法

1.1 材料

1.1.1 一般資料 (1)實(shí)驗(yàn)組：選取2013年1月到2015年6月在我院腎內(nèi)科就診的LN患者50例，其中男性30例，女性20例，年齡為27～64歲，平均(37.9±7.6)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：①病情符合1982年美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)會(huì)修訂的LN診斷標(biāo)準(zhǔn)，并經(jīng)腎活檢病理檢查確診為L(zhǎng)N的患者；②患者年齡在75歲以下，心肝功能基本正常。排除標(biāo)準(zhǔn)：①患者自身存在風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性血管炎等其他風(fēng)濕性免疫性疾病，病毒性肝炎、心梗、糖尿病等影響免疫系統(tǒng)的疾??；②入院前3個(gè)月內(nèi)使用過(guò)激素或免疫性藥物的患者；③妊娠及哺乳期婦女；④合并有心腦造血系統(tǒng)及精神系統(tǒng)的患者。⑵對(duì)照組：選取健康志愿者50例，其中男性28例，女性22例，年齡為26～67，平均(38.2±6.5)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：①不存在LN的臨床癥狀，并且影像學(xué)檢查未見(jiàn)異常；②患者年齡在75歲以下，心肝功能基本正常。排除標(biāo)準(zhǔn)同實(shí)驗(yàn)組。實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組在性別、年齡等方面差異不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。本調(diào)查程序符合本單位的倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)并得到批準(zhǔn)，且已得到患者與家屬的知情同意。

1.1.2 標(biāo)本采集 分別收集對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組在血液標(biāo)本8 ml，肝素抗凝。

1.2 方法

1.2.1 DCs的分離培養(yǎng) 將血液標(biāo)本與PBS緩沖液倍比稀釋混勻，嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行步驟操作，將混合液輕輕置于淋巴細(xì)胞分離液上，4℃，3 000 r/min，離心30 min。輕輕取出離心管，此時(shí)會(huì)出現(xiàn)分層，將第二層白膜細(xì)胞洗出置于另一離心管中，加入PBS清洗，獲得單個(gè)核細(xì)胞備用。配置含有10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基，并加入GM-CSF及IL-4細(xì)胞因子(均購(gòu)于Peprotech公司)，終濃度均為10 ng/ml。將獲得的單個(gè)核細(xì)胞用上述聯(lián)合培養(yǎng)基重懸，于6孔板中培養(yǎng)，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。48 h后全量換液，棄去漂浮的細(xì)胞，并再加入上述聯(lián)合培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，隔天進(jìn)行半量換液。繼續(xù)培養(yǎng)至第7天，收集細(xì)胞及上清用于實(shí)驗(yàn)檢測(cè)。

1.2.2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表型 收集培養(yǎng)第7天的細(xì)胞，與用異硫氰酸酯(FITC)或藻紅沅素(PE)標(biāo)記的流式抗體CD80、CD86、CD40及MHCⅡ(均購(gòu)于eBioscience公司)混合，4℃孵育30 min，PBS洗滌2次后，每管加入300 μl的PBS溶液重懸后，上流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，記錄結(jié)果為陽(yáng)性細(xì)胞所占的比例。

1.2.3 細(xì)胞因子檢測(cè) 收集培養(yǎng)第7天的細(xì)胞上清，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)，應(yīng)用TNF-α、 IL-12 酶聯(lián)免疫試劑盒(均購(gòu)于eBioscience公司)，檢測(cè)上清細(xì)胞因子含量。

1.2.4 同種混合淋巴細(xì)胞反應(yīng) 取健康志愿者外周血10 ml，經(jīng)過(guò)淋巴細(xì)胞分離液梯度離心后獲取單個(gè)核細(xì)胞，PBS洗滌后，于培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，24 h后收集懸浮細(xì)胞，視其為淋巴細(xì)胞。將收集培養(yǎng)第7天的DCs用絲裂霉素C 25 μg/ml，處理 45 min后用PBS洗滌收集細(xì)胞，用10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106ml-1，取100 μl置于96孔板中。并將淋巴細(xì)胞也用10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106ml-1，也取100 μl置于96孔板中，使DCs與淋巴細(xì)胞混合的最終容積為200 μl，然后置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)72 h。于培養(yǎng)結(jié)束時(shí)向每孔加入20 μl的MTS/PMS混合液，培養(yǎng)3 h后，應(yīng)用光密度儀進(jìn)行光密度檢測(cè)，以O(shè)D值來(lái)反應(yīng)淋巴細(xì)胞增殖程度。

2 結(jié)果

2.1 各組對(duì)象外周血DCs表面共刺激分子表達(dá)LN患者與對(duì)照組相比，外周血DCs表面表達(dá)的CD80、CD86、CD40及MHCⅡ明顯高于對(duì)照組，各組均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，具體見(jiàn)表1。

2.2 各組對(duì)象外周血DCs細(xì)胞因子分泌LN患者與對(duì)照組相比，外周血DCs分泌的TNF-α、IL-12明顯高于對(duì)照組，各組均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，具體見(jiàn)表2。

2.3 各組對(duì)象外周血DCs刺激淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)LN組和對(duì)照組IL-12含量分為2.6±0.5、1.2±0.6，可見(jiàn)LN患者外周血DCs刺激淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)能力明顯高于對(duì)照組，各組均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

GroupsCD80CD86CD40MHCⅡLNgroup61.3±5.91)90.2±6.91)52.9±5.81)85.6±5.11)Normalcontrolgroup50.3±5.680.6±6.146.2±6.575.9±4.9

Note：Vs normal control group,1)P<0.05.

GroupsIL-12TNF-αLNgroup210.6±11.21)321.6±15.21)Normalcontrolgroup150.6±10.6150.8±14.9

Note：Vs normal control group,1)P<0.05.

3 討論

LN作為一種嚴(yán)重危害人類健康的自身免疫性疾病，多種致病因素均可誘導(dǎo)其發(fā)病，其確切病因至今未明，但多種研究認(rèn)為四大因素是LN的主要發(fā)病因素：①遺傳缺陷：研究發(fā)現(xiàn)LN發(fā)病具有家族聚集性，存在多種易感基因，其發(fā)生補(bǔ)體基因缺陷的頻率較高，存在較多的凋亡基因及免疫球蛋白受體基因，均可導(dǎo)致疾病的發(fā)生發(fā)展；②環(huán)境因素：其中紫外線、化學(xué)損傷，如含鉛苯的化學(xué)試劑，可疑刺激因素，如感染和飲食等；③性激素異常：均可導(dǎo)致免疫功能紊亂，從而影響LN發(fā)?。虎苊庖咭蛩兀憾喾N細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子及自身抗體都參與了疾病的進(jìn)展[5-7]，多項(xiàng)研究表明Th1/Th2細(xì)胞的極化在LN發(fā)病過(guò)程中起著重要作用。

DCs起源于骨髓造血干細(xì)胞，為目前已知的功能最強(qiáng)的專職抗原提呈細(xì)胞(Antigen Presenting Cells，APC)，具有獨(dú)特的刺激 na?ve T 細(xì)胞活化的能力，是連接固有免疫和適應(yīng)性免疫的“橋梁”。近年來(lái)，隨著 DCs 生物學(xué)特性和功能的深入研究，發(fā)現(xiàn)DCs 的成熟狀態(tài)是決定其有效呈遞抗原的關(guān)鍵因素，會(huì)直接影響免疫應(yīng)答的反應(yīng)，從而影響機(jī)體的各種生命活動(dòng)[8,9]。正常機(jī)體絕大多數(shù)DCs處于未成熟狀態(tài)，多位于實(shí)體器官及非淋巴組織的上皮，具有較強(qiáng)的抗原攝取能力，但抗原遞呈及表達(dá)協(xié)同刺激分子能力較弱。未成熟DCs攝取抗原后，遷移到引流淋巴結(jié)，逐漸發(fā)育成熟，成為成熟DCs，高表達(dá)MHC類分子及CD80、CD86、CD40等共刺激分子，分泌IL-12、TNF-α等炎性細(xì)胞因子，激活T細(xì)胞應(yīng)答，誘導(dǎo)免疫反應(yīng)[10]。然而，樹(shù)突狀細(xì)胞也可以分泌抗炎性細(xì)胞因子，如IL-10，可通過(guò)誘導(dǎo)免疫耐受，或是促進(jìn)Th2細(xì)胞分化來(lái)影響免疫反應(yīng)[11]。

本研究可以看出，與健康對(duì)照組相比，LN患者外周血DCs表面表達(dá)的共刺激分子CD80、CD86、CD40及MHCⅡ數(shù)量明顯升高(P<0.05)；DCs分泌的TNF-α、 IL-12致炎性因子明顯升高(P<0.05)；DCs刺激淋巴細(xì)胞增值反應(yīng)能力明顯升高(P<0.05)。即與健康對(duì)照組相比，LN患者外周血DCs呈現(xiàn)較成熟的狀態(tài)，可誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞增值，推測(cè)其在調(diào)節(jié) Th1/Th2平衡中可能起到重要作用，但仍需進(jìn)一步研究探討。

綜上所述，相對(duì)于健康對(duì)照者，LN患者外周血DCs呈現(xiàn)一種較成熟的狀態(tài)，即DCs參與了LN疾病的發(fā)生與發(fā)展，并在其中起著重要作用，因此臨床可開(kāi)展針對(duì)DCs的干預(yù)來(lái)治療或改善LN的病程。

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[收稿2015-07-09 修回2015-07-21]

(編輯 許四平)

Study on immune function of blood dendritic cells in patients with lupus nephritis

TAN De-Min,XIANG Yang,TAN Qian-Lin.University Hospital of Hubei University for Nationalities,Enshi 445000,China

Objective:To investigate the different function of dendritic cells between patients with lupus nephritis and healthy control,and discuss the pathogenesis of the disease.Methods: Choose 50 healthy controls,50 patients with lupus nephritis,and isolation of blood dendritic cells. Then samples were induced with GM-CSF and IL-4,and cells were collected on day 7. DC maturity was evaluated using the following methods:fluorescence-activated cell sorting analysis for cell surface markers;enzyme-linked immunosorbent assay for cytokine production;cell proliferation assay for induction of T cell proliferation.Results: Compared with the control group,lupus nephritis group had increased MHC Ⅱ,CD86,CD80,and CD40 expression(P<0.05);displayed the increased IL-12 and TNF-α levels(P<0.05);displayed a increased ability to drive lymphocyte cells proliferation(P<0.05).Conclusion: Compared with the control group,dendritic cells in lupus nephritis group displayed the mature condition,which indicates that dendritic cells play the important role in the pathogenesis of lupus nephritis.

Dendritic cells;Lupus nephritis;Maturation

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.04.027

譚德敏(1980年-)，男，在讀碩士，主要從事風(fēng)濕腎病方面的研究，E-mail：tanminde_22@163.com。

R593.242

A

1000-484X(2016)04-0570-03