馬琳?qǐng)@ 隋 御 馬 璐 李 昕 李元杰 徐 方

(寧夏醫(yī)科大學(xué)寧夏回族自治區(qū)生殖與遺傳重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，銀川750004)

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MMS2和P53基因?qū)Y(jié)腸癌細(xì)胞增殖與凋亡的影響①

馬琳?qǐng)@ 隋 御 馬 璐 李 昕 李元杰 徐 方

(寧夏醫(yī)科大學(xué)寧夏回族自治區(qū)生殖與遺傳重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，銀川750004)

目的：探討MMS2 siRNA 與P53 siRNA 對(duì)人高分化結(jié)腸癌細(xì)胞(THC-8307)的增殖與凋亡的相互調(diào)控作用。方法：以實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)、蛋白印跡法(Western blot)分析檢測細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率，選擇沉默效率具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的THC-8307細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)組，同時(shí)將未作處理的THC-8307作為空白對(duì)照，轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒細(xì)胞作為陰性對(duì)照。采用qRT-PCR及Western blot分別檢測干擾各組目的基因后其兩基因相互關(guān)系及表達(dá)量。采用流式細(xì)胞術(shù)檢測各組細(xì)胞的凋亡率，以明確其對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖與凋亡的作用。結(jié)果：實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比，分別沉默MMS2基因與P53基因的結(jié)腸癌細(xì)胞內(nèi)P53與MMS2的 mRNA與蛋白水平顯著升高(P<0.05)。沉默MMS2實(shí)驗(yàn)組其早期凋亡與晚期凋亡率增加(P<0.05)。結(jié)論：MMS2和P53在結(jié)腸癌細(xì)胞增殖與凋亡方面起反向調(diào)控作用。

MMS2;P53;RNA干擾;人結(jié)腸癌細(xì)胞;細(xì)胞凋亡

結(jié)腸癌(Colorectal cancer,CRC)是常見的惡性腫瘤之一。據(jù)最新統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示，全球范圍內(nèi)，結(jié)腸癌的發(fā)病率和死亡率均位列第三位[1]，新增病例以每年超過100萬例的速度遞增[2]。在我國，結(jié)腸癌是最常見的惡性腫瘤,僅次于胃癌和食道癌并且逐年來其發(fā)病率呈上升趨勢 ，在部分發(fā)達(dá)城市甚至已經(jīng)達(dá)到消化道腫瘤的第二位[3,4]。既往研究表明，致癌物的暴露所導(dǎo)致的基因突變以及由基因突變累積引起的細(xì)胞突變是結(jié)直腸癌發(fā)生的根本原因[5],機(jī)體對(duì)此會(huì)進(jìn)行自我修復(fù)——DNA損傷耐受修復(fù)(DNA-damage tolerance，DDT)，曾經(jīng)被稱為復(fù)制后修復(fù)(Post replication repair，PRR)。根據(jù)基因分析，DDT被劃分為兩個(gè)途徑，一條是易誤性修復(fù)(Error-prone)，另外一個(gè)是無誤性修復(fù)(Error-free)[6]。其中MMS2是無誤性途徑中的主要基因之一，它與腫瘤的形成和發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，已有實(shí)驗(yàn)提示在哺乳動(dòng)物模型中MMS2與UBC13所形成的復(fù)合物在P53介導(dǎo)的DNA損傷應(yīng)答中起重要作用，主要是調(diào)節(jié)癌細(xì)胞的增殖和凋亡[7]。為證實(shí)這一實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象，并闡明機(jī)理，本實(shí)驗(yàn)擬用RNA干擾技術(shù)分別靶向降低MMS2基因和P53基因在結(jié)腸癌細(xì)胞THC-8307中的表達(dá)，觀測其相互關(guān)系，檢測其對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響，為結(jié)腸癌的臨床治療提供前期理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑 實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(上海風(fēng)嶺，中國)；電泳儀、凝膠成像儀(Bio-Rad，美國)；DNA提取試劑盒(TIAN-GEN);超敏型二步法免疫細(xì)胞化學(xué)試劑(一抗 Abcam，美國)；HRP 標(biāo)記二抗(中杉金橋生物技術(shù)有限公司，北京)；全蛋白提取試劑盒；lipo3000(Invitrogen，美國)；Annexin V-FITC/PI雙染細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(BestBio 中國)等。

1.2 方法

1.2.1 質(zhì)粒構(gòu)建 人高分化結(jié)腸癌細(xì)胞(THC-8307)由天津醫(yī)科大學(xué)生命科學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室湯華教授惠贈(zèng)。根據(jù)Genebank查閱MMS2和P53基因已知基因序列，設(shè)計(jì)siRNA序列(表1)。重組質(zhì)粒由上海松正生物科技有限公司構(gòu)建完成。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組處理 將THC-8307細(xì)胞用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液，傳代培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，按照Lipofecta mineTM3000 試劑盒(Invitrogen)說明書進(jìn)行操作。實(shí)驗(yàn)分為三組，將含有MMS2干擾片段的質(zhì)粒(pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-MMS2)含有P53干擾片段的質(zhì)粒(pcDNA6.2-GW/EmRFP-miR-P53)轉(zhuǎn)染至THC-8307細(xì)胞中作為實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞，同時(shí)轉(zhuǎn)染相應(yīng)陰性質(zhì)粒作為對(duì)照組，不做任何處理的THC-8307細(xì)胞作為空白對(duì)照組。同樣條件下培養(yǎng)48 h，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 熒光定量PCR法檢測MMS2、P53 mRNA的表達(dá) 在Pubmed數(shù)據(jù)庫中查詢MMS2和P53基因以得到其編碼序列，采用Premier 5.0設(shè)計(jì)相關(guān)引物(表2)。為避免基因組DNA污染，引物設(shè)計(jì)原則為上下游引物跨兩個(gè)外顯子[8]。將提取的各組細(xì)胞總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書反轉(zhuǎn)錄為cDNA,逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件為：42℃ 60 min，70℃ 5 min。再以cDNA為模板進(jìn)行熒光定量PCR,反應(yīng)條件為：95℃10 min；95℃ 15 s；58℃ 30 s；72℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。3次實(shí)驗(yàn)結(jié)果通過比較CT值法(2-△△CT)進(jìn)行相對(duì)定量分析。

1.2.4 Western blot 檢測MMS2、P53蛋白的表達(dá) 采用蛋白裂解液提取細(xì)胞的全蛋白，取20 μl進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，PVDF膜轉(zhuǎn)膜1 h后，用5%脫脂奶粉37℃封閉1 h。將膜與anti-MMS2和anti-P53于4℃孵育過夜，HRP標(biāo)記二抗室溫孵育1 h，于凝膠成像儀上成像分析，以β-actin為內(nèi)參，計(jì)算MMS2和P53與內(nèi)參β-actin灰度值的比較，進(jìn)行分析。

1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 各處理組細(xì)胞按照Annexin V-FITC/PI雙染細(xì)胞凋亡檢測試劑盒操作說明收集細(xì)胞并進(jìn)行染色操作后，迅速用流式細(xì)胞儀進(jìn)行凋亡率檢測。經(jīng)FCM分析結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1siRNA-MMS2和siRNA-P53轉(zhuǎn)染效率檢測 用LipofectamineTM3000 轉(zhuǎn)染siRNA-MMS2和siRNA-P53于THC-8307細(xì)胞，24h后用倒置顯微鏡觀察可分別見綠色和紅色熒光分散在細(xì)胞質(zhì)中說明轉(zhuǎn)染成功(圖1)

2.2siRNA-MMS2干擾效能鑒定

2.2.1 MMS2基因在細(xì)胞中mRNA表達(dá)量的變化qRT-PCR結(jié)果顯示：siRNA-MMS2轉(zhuǎn)染進(jìn)入THC-8307細(xì)胞48h后，細(xì)胞中MMS2基因量明顯低于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組(P<0.05，圖2)，而兩對(duì)照組之間則無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)果表明：小RNA干擾片段成功抑制實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞MMS2基因的表達(dá)，而陰性質(zhì)粒對(duì)MMS2基因的表達(dá)無多少影響。

表1 RNA干擾序列

Tab.1 RNA interference sequence

RNAinterferencesequenceMMS2F:5'-TGCTGCTTGGTGGCCCAATAATCATGGTTTTGGCCACTGACTGACCATGATTAGGGCCACCAAG-3'R:5'-CCTGCTTGGTGGCCCTAATCATGGTCAGTCAGTGGCCAAAACCATGATTATTGGGCCACCAAGC-3'P53F:5'-TGCTGAGTAGATTACCACTGGAGTCTGTTTTGGCCACTGACTGACAGACTCCAGGTAATCTACT-3'R:5'-CCTGAGTAGATTACCTGGAGTCTGTCAGTCAGTGGCCAAAACAGACTCCAGTGGTAATCTACTC-3'

表2 熒光引物

Tab.2 Fluorescence primer

FluorescenceprimerMMS2F:5'-CGGTCTCCACAGGAGTTAAAGT-3'R:5'-TGTCCAGGTCATGTTTACCAGC-3'P53F:5'-GCTCTGACTGTACCACCATCCACTA-3'R:5'-TCTTGCGAAGATTCTCTTCCTCTGT-3'

2.2.2MMS2基因在細(xì)胞中蛋白表達(dá)量的變化 細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，Western blot檢測THC-8307細(xì)胞中MMS2蛋白的表達(dá)(圖3)，顯示實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞MMS2表達(dá)量明顯低于兩對(duì)照組(P<0.05)，而兩對(duì)照組之間則無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明：在蛋白水平上MMS2基因成功被沉默，而陰性質(zhì)粒對(duì)其表達(dá)無影響。

2.3 siRNA-P53干擾效能鑒定

圖1 siRNA-MMS2與siRNA-P53熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率(10×20)Fig.1 Observed transfection efficiency under fluorescence micriscope(10×20)Note: Figure A and B were transfected into siRNA-MMS2 cells by fluorescence inverted microscope and ordinary optical field of vision.Figure C and D were transfected into siRNA-P53 cells by fluorescence inverted microscope and ordinary optical field of vision.Figure A and C,the white arrow indicates that the THC-8307 cells were transfected successfully.

圖2 siRNA干擾MMS2 mRNA 的相對(duì)表達(dá)水平Fig.2 Relative expression of MMS2 mRNA after silenced by siRNA determined by RT-qPCRNote: Control.Blank control group；Negative.Conditional control group；MMS2-siRNA.Experimental group； *.P<0.05,vs control group.

2.3.1P53基因在細(xì)胞中mRNA表達(dá)量的變化 qRT-PCR結(jié)果表明：siRNA-P53轉(zhuǎn)染進(jìn)入細(xì)胞48 h后，細(xì)胞中P53基因量明顯低于兩對(duì)照組(P<0.05，圖4)，而陰性對(duì)照組與空白對(duì)照組之間則無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)果表明：小RNA干擾片段成功抑制實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞P53基因mRNA表達(dá)，而陰性質(zhì)粒對(duì)P53 mRNA的表達(dá)并無多少影響。

2.3.2P53基因在細(xì)胞中蛋白表達(dá)量的變化 細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，Western blot檢測THC-8307細(xì)胞中P53蛋白的表達(dá)(圖5)，顯示實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞P53表達(dá)量明顯低于兩對(duì)照組(P<0.05)，而兩對(duì)照組之間的差異則無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)本實(shí)驗(yàn)說明：在蛋白水平上P53基因下調(diào)成功，而陰性質(zhì)粒對(duì)其表達(dá)無影響。

2.4 下調(diào)MMS2對(duì)THC-8307細(xì)胞P53表達(dá)量的影響

圖3 siRNA干擾MMS2蛋白的相對(duì)表達(dá)水平Fig.3 Relative expression of MMS2 protein after silenced by siRNA determined by Western blotNote: Control.Blank control group；Negative.Conditional control group；MMS2-siRNA.Experimental group； *.P<0.05,vs control group.

圖4 siRNA干擾P53 mRNA 的相對(duì)表達(dá)水平Fig.4 Relative expression of P53 mRNA after silenced by siRNA determined by RT-qPCRNote: Control.Blank control group；Negative.Conditional control group；P53-siRNA.Experimental group； *.P<0.05,vs control group.

2.4.1 下調(diào)MMS2的實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，用qRT-PCR檢測THC-8307細(xì)胞P53 mRNA表達(dá)量，顯示實(shí)驗(yàn)組P53 mRNA表達(dá)量明顯高于空白對(duì)照組與陰性對(duì)照組(P<0.05)，而兩對(duì)照組之間則無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，見圖6。

2.4.2 以Western Blot檢測下調(diào)MMS2 48 h之后THC-8307細(xì)胞中P53蛋白表達(dá)量，結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組P53蛋白表達(dá)量顯著高于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組(P<0.05)，而兩對(duì)照組之間則無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，見圖7。

2.5 下調(diào)P53對(duì)THC-8307細(xì)胞MMS2表達(dá)量的影響

2.5.1 用下調(diào)P53之后繼續(xù)培養(yǎng)48 h的THC-8307細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，以qRT-PCR檢測細(xì)胞中MMS2 mRNA的表達(dá)量，結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組MMS2mRNA表達(dá)顯著高于空白對(duì)照組與陰性對(duì)照組(P<0.05),而兩對(duì)照組之間則無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)(見圖8)。

圖5 siRNA干擾P53蛋白的相對(duì)表達(dá)水平Fig.5 Relative expression of P53 protein after silenced by siRNA determined by Western blotNote: Control.Blank control group；Negative.Conditional control group；P53-siRNA.Experimental group；*.P<0.05,vs control group.

圖6 siRNA干擾MMS2后，P53 mRNA 的相對(duì)表達(dá)水平Fig.6 Relative expression of P53 mRNA after silenced by MMS2-siRNA determined by RT-qPCRNote: Control.Blank control group；Negative.Conditional control group MMS2-siRNA.Experimental group； *.P<0.05,vs control group.

2.5.2 以Western blot檢測下調(diào)P53 48 h之后THC-8307細(xì)胞中MMS2蛋白表達(dá)量，結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組MMS2蛋白表達(dá)量顯著高于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組(P<0.05),而兩對(duì)照組之間則無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，見圖9。

2.6 下調(diào)MMS2基因?qū)?xì)胞增殖和凋亡的影響

2.6.1 流式細(xì)胞術(shù)分析Annexin V-FITC/PI 熒光染色結(jié)果 經(jīng)轉(zhuǎn)染48 h后，將THC-8307細(xì)胞置入流式細(xì)胞分析儀中，結(jié)果顯示，與兩對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組早期凋亡率和晚期凋亡率均增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，空白對(duì)照組與陰性對(duì)照組之間則無顯著性差異(P>0.05)，見圖10。

圖7 siRNA干擾MMS2后，P53蛋白的相對(duì)表達(dá)水平Fig.7 Relative expression of P53 protein after silenced by MMS2-siRNA determined Western blotNote: Control.Blank control group；Negative.Conditional control group MMS2-siRNA.Experimental group；*.P<0.05,vs control group.

圖8 siRNA干擾P53后，MMS2 mRNA 的相對(duì)表達(dá)水平Fig.8 Relative expression of MMS2 mRNA after silenced by P53-siRNA determined by RT-qPCRNote: Control.Blank control group；Negative.Conditional control group；P53-siRNA.Experimental group；*.P<0.05,vs control group.

圖9 siRNA干擾P53后，MMS2蛋白的相對(duì)表達(dá)水平Fig.9 Relative expression of MMS2 protein after silenced by P53-siRNA determined by Western blotNote: Control.Blank control group；Negative.Conditional control group；P53-siRNA.Experimental group；*.P<0.05,vs control group.

圖10 流式細(xì)胞儀檢測THC-8307各組細(xì)胞凋亡率(%)Fig.10 Quantitative analysis of THC-8307 cells apoptotic determined by FACS(%)Note: A and C represent apoptosis of cells after silencing MMS2；B and D represent apoptosis of cells after silencing P53.Control.Blank control group；Negative.Conditional control group；MMS2-siRNA.Experimental group；P53-siRNA.Experimental group； *.P<0.05,vs control group.

3 討論

結(jié)腸癌的傳統(tǒng)治療方法是以手術(shù)加放/化療為主，由于其對(duì)患者機(jī)體損傷較大，且不能從本質(zhì)上根治結(jié)腸癌，有約40%～50%的患者會(huì)出現(xiàn)術(shù)后復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移,其中大多數(shù)患者失去再治愈的機(jī)會(huì)[9]。因此以RNA干擾為主的生物技術(shù)手段就成為臨床治療的主攻方向。MMS2是一種泛素結(jié)合酶樣蛋白基因，在結(jié)構(gòu)上，MMS2對(duì)UBC13介導(dǎo)的lys63連接聚泛素化鏈的長度的調(diào)節(jié)作用，在功能上，UBC13-MMS2復(fù)合物作用于DNA損傷修復(fù)，即DNA損傷耐受通路DDT(DNA damage tolerate)通路中的無誤性(error-free)修復(fù)途徑[10]。損傷耐受可以發(fā)生在復(fù)制叉或者復(fù)制叉后，以防止復(fù)制叉崩潰和潛在的細(xì)胞死亡，因?yàn)樗闹饕饔檬潜ＷC復(fù)制的進(jìn)行而不是等待損壞的模板進(jìn)行修復(fù)[11]。同時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)UV損傷引起嘧啶二聚體導(dǎo)致單鏈DNA缺口，經(jīng)過復(fù)制后修復(fù)這些缺口依然長期存在，表明PRR只是繞過損傷而不是修復(fù)它[12]，DNA損傷途徑與細(xì)胞突變及腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[13]。其分子機(jī)制可能與下游基因的同源重組有關(guān)[14,15]。研究發(fā)現(xiàn)，人類MMS2與酵母MMS2同源，定位于人染色體8p，MMS2是正常細(xì)胞生長所必需的[16]。本實(shí)驗(yàn)室前期實(shí)驗(yàn)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，沉默MMS2基因表達(dá)可以促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞自發(fā)凋亡，抑制增殖，提示TLS介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞損傷后修復(fù)過程可能有凋亡機(jī)制的參與[17]。這與Knobel[18]發(fā)現(xiàn)TLS可以對(duì)P53凋亡信號(hào)通路中的調(diào)控分子表達(dá)和功能失常引起腫瘤細(xì)胞凋亡的報(bào)道相一致。推測，在沉默MMS2誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞THC-8307凋亡過程中P53發(fā)揮重要作用。

本研究通過開展qRT-PCR、Western blot等實(shí)驗(yàn)研究和相關(guān)文獻(xiàn)分析，發(fā)現(xiàn)下調(diào)MMS2之后，結(jié)腸癌細(xì)胞中P53表達(dá)量顯著升高，細(xì)胞在早期與晚期凋亡量增加，提示P53所在的凋亡信號(hào)通路在該過程中發(fā)揮一定作用。與此同時(shí)，我們還發(fā)現(xiàn)下調(diào)P53之后，結(jié)腸癌細(xì)胞THC-8307中MMS2在轉(zhuǎn)錄水平與蛋白水平表達(dá)量會(huì)顯著上升，但是結(jié)腸癌細(xì)胞THC-8307的早期凋亡與晚期凋亡卻沒有明顯的改變。這些實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象提示，下調(diào)MMS2誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞THC-8307凋亡或許就是通過激活P53實(shí)現(xiàn)的。這也與Wen和 Li等[7]在2012年研究發(fā)現(xiàn)脊椎動(dòng)物的MMS2基因具有高度保守性，并且指出斑馬魚DrMMS2基因是一個(gè)與哺乳動(dòng)物MMS2基因真正同源的基因,在以斑馬魚為脊椎動(dòng)物代表的實(shí)驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn)，在斑馬魚細(xì)胞中P53介導(dǎo)的DNA損傷反應(yīng)，需要DrMMS2和UBC13形成穩(wěn)定的絡(luò)合物,且發(fā)現(xiàn)敲除DrMMS2基因的細(xì)胞，P53的表達(dá)量顯著上升，并得出結(jié)論斑馬魚DrMMS2基因在反向調(diào)控P53基因活性方面起重要作用的報(bào)道相一致。同時(shí)，另有報(bào)道指出[19]，MMS2與UBC13復(fù)合物介導(dǎo)K63連接聚泛素化的P53，有利于單體P53的形成，還可以降低P53的轉(zhuǎn)錄活性，而這種調(diào)控作用在DNA損傷時(shí)減弱，使P53激活，且MMS2編碼產(chǎn)物在大多正常組織中表達(dá)量極低，但是在一些腫瘤組織中呈不同水平的高表達(dá)[13]。有實(shí)驗(yàn)指出P53低表達(dá)可能參與了結(jié)腸癌的形成過程，其低表達(dá)的結(jié)腸癌細(xì)胞更具有惡性分化潛能[20]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)MMS2不但參與DNA損傷修復(fù)，而且還與遺傳不穩(wěn)定性及其腫瘤的發(fā)生有關(guān)[16,21]，而P53在基因穩(wěn)定性方面又被稱作是“基因守護(hù)衛(wèi)士”[22]，同時(shí)，周期檢測位點(diǎn)與TLS通路密切相關(guān)，其對(duì)于無論是無誤性修復(fù)通路還是易誤性修復(fù)通路都非常重要[23]。以上研究一定程度上證實(shí)，在結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡中,MMS2和P53基因在轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平其相互間似乎是起反向調(diào)控作用，該作用可能與TLS對(duì)細(xì)胞周期檢測位點(diǎn)的調(diào)控有關(guān)，具體機(jī)制尚需后續(xù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究。

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[收稿2015-10-20 修回2015-12-10]

(編輯 張曉舟)

Interaction between MMS2 and P53 on proliferation and apoptosis of colon cancer cells

MA Lin-Yuan,SUI Yu,MA Lu,LI Xin,LI Yuan-Jie,XU Fang.Ningxia Medical University,Ningxia Key Laboratory of Reproductive and Genetic，Yinchuan 750004,China

Objective:To explore the regulatory effects of proliferation and apoptosis on THC-8307 byMMS2 siRNA andP53 siRNA. Methods: We experimentally suppressed theMMS2 andP53 expression in human colon cancer cells by the interference RNA technology(RNAi)as monitored by Real-time qRT-PCR and Western blot.THC-8307 cells that express rate significantly reduced were collected as case group,while using untreated cells as the blank control group,and mock-treated cells as the negative control group.After separately interfering the target genes in each group,test the relationship and expression level of the two genes.Utilizing flow cytometry techniques to test cells proliferation and apoptosis rate of each group.Results: Compared to the control group,colon cancer cells in whichMMS2 andP53 were silenced displayed significant increase ofP53,MMS2 mRNA and protein levels(P<0.05).MMS2-depleted cells displayed increase in apoptosis rates,for both early and later stages(P<0.05). Conclusion:MMS2 andP53 negatively regulate each other in colon cancer cells proliferation and apoptosis.

MMS2;P53;RNA-interference;Human colon cancer cells;Apoptosis

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.04.014

①本文為國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.313602501)。

馬琳?qǐng)@(1990年-)，女，在讀碩士，主要從事DNA損傷修復(fù)和腫瘤發(fā)生發(fā)展的研究。

及指導(dǎo)教師：徐 方(1962年-)，女，博士生導(dǎo)師，主要從事DNA損傷修復(fù)與腫瘤發(fā)生發(fā)展的研究。

R735.35

A

1000-484X(2016)04-0513-06