譚家余 黃 湘 陳敬林 鐘裕恒

(南方醫(yī)科大學(xué)第三臨床醫(yī)學(xué)院 南方醫(yī)科大學(xué)附屬中山博愛醫(yī)院，中山528403)

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·生物治療·

HSPC238對HMOX1、RPS27a、MT2A、UBB調(diào)節(jié)的初步研究①

譚家余 黃 湘 陳敬林 鐘裕恒

(南方醫(yī)科大學(xué)第三臨床醫(yī)學(xué)院 南方醫(yī)科大學(xué)附屬中山博愛醫(yī)院，中山528403)

目的：探討HSPC238過表達(dá)或低表達(dá)對目標(biāo)蛋白(HMOX1、MT2A、UBB、RPS27a)的調(diào)節(jié)作用及其調(diào)節(jié)途徑。方法：分別構(gòu)建HSPC238的干擾載體及高表達(dá)載體，脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染HEPG2細(xì)胞株，RT-PCR、Western blot檢測HSPC238及目標(biāo)蛋白的mRNA、蛋白的表達(dá)量；進(jìn)一步用目標(biāo)蛋白的高表達(dá)質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染低表達(dá)及高表達(dá)HSPC238的HEPG2細(xì)胞株，實(shí)驗(yàn)組另以蛋白酶體抑制劑MG132處理細(xì)胞，鎳柱純化目標(biāo)蛋白，以HSPC238做免疫印跡，檢測目標(biāo)蛋白累積情況。結(jié)果：外源性干擾HSPC238后HMOX1、MT2A、RPS27a表達(dá)下調(diào)較明顯，外源性過表達(dá)HSPC238后MT2A、UBB、RPS27a表達(dá)水平明顯上調(diào)；目標(biāo)蛋白的高表達(dá)質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染低表達(dá)及高表達(dá)HSPC238的HEPG2細(xì)胞株，實(shí)驗(yàn)組以蛋白酶體抑制劑MG132處理細(xì)胞后，與對照組比較，泛素化的目標(biāo)蛋白條帶明顯增加。結(jié)論：過表達(dá)HSPC238可上調(diào)MT2A、UBB、RPS27a的表達(dá)，干擾HSPC238可下調(diào)HMOX1、MT2A、RPS27a的表達(dá)；HSPC238可能通過泛素蛋白酶體途徑(Ubiquitin-proteasome pathway，UPP)對目標(biāo)蛋白發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。

HSPC238；泛素蛋白酶體途徑；目標(biāo)蛋白

HSPC238蛋白(hypothetical protein LOC51255，ring finger protein 181，NP_057578)是由LOC51255基因(NM_016494)編碼的含153個氨基酸的，包含RING指(RING-type zinc finger)結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)，屬于C3HC4型鋅指蛋白，其特殊的結(jié)構(gòu)提示該蛋白可能參與泛素蛋白酶體途徑。本課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn)，HSPC238蛋白在體內(nèi)外均可明顯抑制肝癌細(xì)胞的生長[1]，并進(jìn)一步通過酵母雙雜交的方法篩選到了與HSPC238相互作用的目標(biāo)蛋白(HMOX1、MT2A、UBB、RPS27a)[2]。本研究擬進(jìn)一步探討HSPC238對目標(biāo)蛋白的調(diào)節(jié)及其調(diào)節(jié)途徑，為深入研究HSPC238在肝癌發(fā)生中的作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒及細(xì)胞株 pCDNA3.1-HSPC238-Flag；pCDNA3.1-HMOX1-His；pCDNA3.1-MT2A-His；pC-DNA3.1-RPL5-His；pCDNA3.1-UBB-His；pCDNA-3.1-RPS27A-His、HEPG2細(xì)胞株等由本課題組前期已合成。

1.1.2 抗體 HSPC238、HMOX、RPS27A、MT2A、UBB、Goat-anti-mouse-HRP、Goat-anti-Rabbit-HRP、mouse anti-Flag mAb、兔抗Ubiquitin B、兔抗MT2A、兔抗RPS27、兔抗HMOX1均購自ABCLONAL;mouse anti-actin(Epitomics);羊抗鼠和羊抗兔二抗(Abmart)。

1.1.3 基礎(chǔ)試劑 細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基、FBS胎牛血清、雙抗、Lipfecti mine 2000轉(zhuǎn)染試劑、MG132、Ni-NTA sefinose Resin(生工生物工程)；Tricine Lipofecta mine 2000、PMSCV-puro、嘌呤霉素、DMEM/高糖基礎(chǔ)培養(yǎng)基，F(xiàn)BS。逆轉(zhuǎn)錄酶，Real-time PCR試劑盒、TRIZOL購自鐘鼎生物；氯仿、異丙醇(分析純)；RNA溶解液(全式金)；DEPC(PMSF Amresco)；引物合成(上海生工)，cocktail(上海源葉生物科技有限公司)；PBS(pH7.0,自配)；脫脂奶粉(伊利)，DMEM/高糖培養(yǎng)基，購自Gibco公司；FBS、Penicillin和Streptomycin購自Hyclone公司；Trypsogen購自Worthington公司。

1.2 方法

1.2.1 穩(wěn)定過表達(dá)及低表達(dá)HSPC238蛋白細(xì)胞株的篩選 轉(zhuǎn)染前24 h，將細(xì)胞接種于5 ml不含抗生素的H-DMEM培養(yǎng)基中，使其在轉(zhuǎn)染時長至70%～80%融合。參照Lipofecta mineTM2000產(chǎn)品說明書，分別將目的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至六孔板培養(yǎng)基，37℃、5% CO2孵育6 h后，換用新鮮完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h后加入2 μg/ml嘌呤霉素篩選。初期每天更換新鮮含有2 μg/ml培養(yǎng)基,5 d后視培養(yǎng)基顏色變化來換液，當(dāng)出現(xiàn)克隆后挑出克隆，擴(kuò)增培養(yǎng)，并細(xì)胞凍存以便后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 總RNA提取及RT-PCR實(shí)驗(yàn) 收集擴(kuò)增培養(yǎng)72 h后的各組細(xì)胞(分成兩份，一份用于RT-PCR、一份用于WB)，按照總RNA提取試劑盒說明書提取細(xì)胞總RNA。采用SYBR Green法進(jìn)行RT-PCR實(shí)驗(yàn)，各個目的基因引物序列及產(chǎn)物大小見下表。

反應(yīng)程序：95℃，3 min；95℃，30 s；55℃，20 s；72℃，20 s；72℃，10 min；共35個循環(huán)，同一實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用的是相對定量，采用RQ=2-△CT計(jì)算相對表達(dá)量，EXCLE分析數(shù)據(jù)，Graphpad prism 5軟件作圖。

1.2.3 蛋白提取及WB實(shí)驗(yàn) 收集擴(kuò)增培養(yǎng)72 h后的各組細(xì)胞(分成兩份，一份用于RT-PCR、一份用于WB)，加入細(xì)胞裂解液提取總蛋白，采用BCA法測定蛋白濃度。加入SDS上樣緩沖液100℃，處理5 min；每孔上樣100 μg，70 V恒壓SDS-Page電泳，100 V冰水混浴，電轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%的脫脂牛奶室溫封閉1 h，加入一抗(六種抗體分別稀釋為1∶500；β-actin為1∶1 000)，4℃冰箱過夜，次日TBST漂洗10 min×3次，加入HRP標(biāo)記的二抗(羊抗鼠1∶5 000，羊抗兔1∶2 000)，室溫孵育1 h，TBST漂洗10 min×3次，ECL化學(xué)發(fā)光顯影。

1.2.4 HSPC238對目標(biāo)蛋白的泛素化調(diào)節(jié) 接種步驟1.2.1中的HepG2穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株，0.25%胰酶消化至細(xì)胞密度為60%～70%。參照Lipofecta mineTM2000產(chǎn)品說明書，將目標(biāo)質(zhì)粒(pcDNA3.1/HMOX1/MT2A/RPS27A/UBB)分別轉(zhuǎn)染至細(xì)胞，37℃吸附5 h，更換新鮮完全培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，加入MG132濃度10 μmol/L，孵育3 h。裂解細(xì)胞提取總蛋白，采用BCA法測定蛋白濃度。鎳柱純化，收集洗脫液。BCA法測定洗液、洗脫液各組分蛋白濃度，加入5×SDS上樣緩沖液100℃，處理5 min；每孔上樣100 μg，15 mA恒流SDS-PAGE電泳，電轉(zhuǎn)至PVDF膜，麗春紅染色5 min，預(yù)留目標(biāo)蛋白所在范圍，剪膜水洗使得條帶消失。5%的脫脂牛奶+TBST室溫封閉1 h，加入一抗(六種抗體分別稀釋為1∶500；β-actin為1∶1 000)，4℃冰箱過夜，次日TBST漂洗10 min×3次，加入HRP標(biāo)記的二抗(羊抗鼠1∶5 000，羊抗兔1∶2 000)，室溫孵育1 h，TBST漂洗10 min×3次，ECL化學(xué)發(fā)光顯影。

表1 目的基因的引物序列及產(chǎn)物大小

Tab.1 Primer sequence and product size of target gene

PrimerSequenceProductsizehHSPC238_FTGCCAAGACTGTGGTTGAGA95bphHSPC238_RCAAAAGACACACGGGGCACThActin_FGATGAGATTGGCATGGCTTT105bphActin_RGTCACCTTCACCGTTCCAGThUBB_FAGCCTTTCTTACGGCTATGAGG136bphUBB_RGTTGCGTCACTTATCACCCChMT2A_FAAAGAACGCGACTTCCACAA70bphMT2A_RAGGAATATAGCAAACGGTCACGhHMOX1_FCGAGCATAAATGTGACCGGC139bphHMOX1_RTGCTGTCGGGTTGCGGAhRPS27a_FTGTGAAATGCCCAGGATGCTA78bphRPS27a_RGAGCAGCCAACACACAAAACT

2 結(jié)果

2.1 過表達(dá)及干擾HSPC238對HEPG2細(xì)胞內(nèi)HSPC238及目標(biāo)蛋白的影響 HEPG2細(xì)胞過表達(dá)HSPC238及干擾HSPC238后，分別通過RT-PCR和WB檢測內(nèi)源性HSPC238及目標(biāo)蛋白的mRNA和蛋白表達(dá)水平。內(nèi)源性HSPC238、RPS27、UBB、HMOX1在HEPG2細(xì)胞中表達(dá)量相對較高，MT2A的表達(dá)水平較低；外源性干擾HSPC238后HMOX1、MT2A、RPS27表達(dá)下調(diào)較明顯，外源性過表達(dá)HSPC238后MT2A、UBB、RPS27表達(dá)水平也隨之上調(diào)，見圖1。

2.2 過表達(dá)目標(biāo)蛋白對穩(wěn)定高表達(dá)HSPC238細(xì)胞株內(nèi)目標(biāo)蛋白的影響 分別轉(zhuǎn)染pcDNA3.1/HMOX-1/RPS27A/MT2A/UBB各實(shí)驗(yàn)組于穩(wěn)定高表達(dá)HSPC238細(xì)胞株，鎳柱純化目標(biāo)蛋白，以HSPC238做免疫印跡，結(jié)果表明約20 kD左右有正確大小條帶，即HSPC238與各目的蛋白結(jié)合，另外以MG132(10 μmol/L)處理細(xì)胞，較未處理細(xì)胞組條帶增加，表明泛素化的目標(biāo)蛋白在MG132抑制蛋白酶體活性后大量累積，見圖2。

2.3 過表達(dá)目標(biāo)蛋白對穩(wěn)定低表達(dá)HSPC238細(xì)胞株內(nèi)目標(biāo)蛋白的影響 分別轉(zhuǎn)染pcDNA3.1/HMOX-1/RPS27A/MT2A/UBB各實(shí)驗(yàn)組于穩(wěn)定低表達(dá)HSPC238細(xì)胞株，鎳柱純化目標(biāo)蛋白，以HSPC238做免疫印跡，結(jié)果表明約20 kD有正確大小微弱條帶，另外以MG132(10 μmol/L)處理細(xì)胞，較未處理細(xì)胞組條帶增加，顯示被泛素化的蛋白累積增加，見圖3。

圖1 外源干擾或過表達(dá)HSPC238后HEPG2細(xì)胞株內(nèi)HSPC238及目標(biāo)蛋白的mRNA和蛋白表達(dá)變化的影響Fig.1 Effect on expression of mRNA and protein of HSPC238 and target proteins in HEPG2 cell lines after interference or over expression of HSPC238 exogenous

圖2 轉(zhuǎn)染過表達(dá)目標(biāo)蛋白的質(zhì)粒于高表達(dá)HSPC238的HEPG2細(xì)胞株內(nèi)，MG132處理后，觀察目標(biāo)蛋白的代謝變化Fig.2 Transfect overexpression plasmid of target proteins into HEPG2 cell lines which was high expression of HSPC238,after MG132 treatment,observe metabolic changes of target protein

圖3 轉(zhuǎn)染過表達(dá)目標(biāo)蛋白的質(zhì)粒于低表達(dá)HSPC238的HEPG2細(xì)胞株內(nèi)，MG132處理后，觀察目標(biāo)蛋白的表達(dá)變化Fig.3 Transfect overexpression plasmid of target proteins into HEPG2 cell lines which was low expression of HSPC238,after MG132 treatment,observe metabolic changes of target protein

3 討論

本課題組在前期研究中已經(jīng)證實(shí)，HSPC238在體內(nèi)外均可以抑制肝癌細(xì)胞的生長[1]，進(jìn)一步通過酵母雙雜交、免疫共沉淀、pull-down等系列實(shí)驗(yàn)篩選到與其相互作用的目標(biāo)蛋白(HMOX-1、RPS27A、MT2A、UBB)[2]，在此研究基礎(chǔ)上，本實(shí)驗(yàn)初步探討HSPC238對上述四種目標(biāo)蛋的調(diào)節(jié)作用及其調(diào)節(jié)途徑。

為明確HSPC238及其目標(biāo)蛋白的內(nèi)源性表達(dá)水平，本研究檢測了HEPG2細(xì)胞株內(nèi)HSPC238及目標(biāo)蛋白的mRNA和蛋白表達(dá)水平，結(jié)果表明HSPC238、HMOX1、RPS27a、UBB在HEPG2細(xì)胞中的內(nèi)源性表達(dá)量相對較高，而MT2A蛋白的內(nèi)源性表達(dá)水平較低；有研究表明，在肝細(xì)胞肝癌組織中HMOX1表達(dá)水平較高[3]，而RPS27a、MT2A表達(dá)水平較低[4,5]，目前尚未見UBB蛋白在肝癌組織中的表達(dá)及其與肝癌關(guān)系的相關(guān)研究報道。

為初步探討HSPC238對目標(biāo)蛋白是否存在調(diào)節(jié)作用，本研究分別將HSPC238的過表達(dá)及干擾載體轉(zhuǎn)染入HEPG2細(xì)胞株，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)HEPG2細(xì)胞株轉(zhuǎn)染HSPC238干擾載體后HMOX1、MT2A、RPS27a表達(dá)下調(diào)較明顯，而轉(zhuǎn)染HSPC238過表達(dá)載體后MT2A、UBB、RPS27a表達(dá)水平也隨之上調(diào)。表明HSPC238對目標(biāo)蛋白存在某種調(diào)節(jié)作用。

為探討HSPC238對目標(biāo)蛋白的調(diào)節(jié)機(jī)制，本研究分別將目標(biāo)蛋白的高表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染于穩(wěn)定高(低)表達(dá)HSPC238的細(xì)胞株，鎳柱純化目標(biāo)蛋白，以HSPC238做免疫印跡，均有目標(biāo)條帶出現(xiàn)，表明HSPC238與目標(biāo)蛋白存在結(jié)合。再以蛋白酶體抑制劑MG132處理細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)一段時間后進(jìn)一步裂解細(xì)胞做免疫印跡，結(jié)果表明，MG132處理組與未處理細(xì)胞組比較，條帶明顯增加，表明被泛素化的蛋白累積增加，即目標(biāo)蛋白通過UPP途徑代謝。

UPP途徑是體內(nèi)多數(shù)蛋白質(zhì)的代謝通路，主要降解胞內(nèi)蛋白，我們的前期研究已經(jīng)證實(shí)目標(biāo)蛋白均存在于胞質(zhì)中[6,7]，而又有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)HSPC238蛋白具有E3酶活性，且HMOX1、RPS27a、UBB、MT2A四種目標(biāo)蛋白均與腫瘤存在密切關(guān)系[8-16]。因此我們推測HSPC238蛋白扮演E3角色通過UPP途徑來調(diào)節(jié)目標(biāo)蛋白的代謝，其具體代謝及調(diào)節(jié)作用機(jī)制，有待進(jìn)一步研究證實(shí)。

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[收稿2015-10-01 修回2015-11-05]

(編輯 張曉舟)

A preliminary study on regulation of HMOX1,RPS27a,MT2A and UBB by HSPC238

TAN Jia-Yu，HUANG Xiang，CHEN Jing-Lin，ZHONG Yu-Heng.The Third Clinical College of Southern Medical University,Boai Hospital Affiliated to Southern Medical University ,Zhongshan 528403,China

Objective:To investigate the effect of HSPC238 overexpression or low expression on the regulation of the target protein (HMOX1，MT2A，UBB，RPS27a) and the regulation pathways.Methods: To construct the interference vector and overexpression vector of HSPC238 respectively，transfected the HEPG2 cell lines by the liposome method，detect the expression of mRNA and protein of the HSPC238 and the target proteins by the RT-PCR and Western blot，further to transfer the overexpression plasmids of the target proteins into the HEPG2 cell lines which had been transfected with interference vector and overexpression vector of HSPC238，the experimental group cell lines were treated with proteasome inhibitor MG132，to purify the target proteins with nickel column，do immunoblotting with HSPC238 to detect the accumulation situation of the target proteins.Results: The HMOX1,MT2A,RPS27a were downregulated obviously when the HSPC238 was interfered exogenous;and the MT2A,UBB,RPS27a were up-regulated after the HSPC238 overexpressed.The overexpression plasmid of target proteins were transfected into the HEPG2 cell lines which have been transfected with interference vector and overexpression vector of HSPC238，compared with the control group,the target protein band in the experimental group was significantly increased after treatment with the proteasome inhibitor MG132.Conclusion: The HSPC238 overexpression can upregulate the expression of MT2A,UBB and RPS27a,and interfering HSPC238 can downregulate the expression of HMOX1,MT2A and RPS27a;the HSPC238 target protein may play a regulatory role through the UPP pathway；the HSPC238 may play a regulatory role on the target proteins through the UPP pathway.

HSPC238；Ubiquitin-proteasome pathway；Target protein

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.04.013

①本文受國家自然科學(xué)基金(81101534)、廣東省自然科學(xué)基金(S2012010010824)和廣東省醫(yī)學(xué)科研基金(A2013875)項(xiàng)目資助。

譚家余(1969年-)，男，博士，主要從事腫瘤免疫學(xué)相關(guān)研究，E-mail：842630809@qq.com。

及指導(dǎo)教師：黃 湘(1971年-)，女，博士，主任技師，碩士生導(dǎo)師，主要從事腫瘤免疫學(xué)相關(guān)研究，E-mail：340382761@qq.com。

R392.1

A

1000-484X(2016)04-0509-04