王 蕊 劉 娟 蘇曉慧 陳劍鈺 楊 芬 李 婷

(澳門科技大學(xué)中藥質(zhì)量研究國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，澳門藥物與健康應(yīng)用研究院，澳門999078)

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二氫楊梅素抗感染性休克的作用與機(jī)制研究①

王 蕊 劉 娟 蘇曉慧 陳劍鈺 楊 芬 李 婷

(澳門科技大學(xué)中藥質(zhì)量研究國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，澳門藥物與健康應(yīng)用研究院，澳門999078)

目的：探討二氫楊梅素(Dihydromyricetin,DMY)抗內(nèi)毒素休克的作用及其機(jī)制。方法：小鼠給予DMY處理 7 d后，腹腔注射脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)建立小鼠休克模型，在LPS刺激24、48、72、96、120、144、168 h后統(tǒng)計(jì)小鼠的死亡率。體外培養(yǎng)RAW264.7細(xì)胞,以DMY(10、50、100 μmol/L)預(yù)處理細(xì)胞1 h 后給予LPS 100 ng/ml刺激細(xì)胞。利用Western blot技術(shù)檢測P-ERK、ERK、P-JNK、JNK、P-p38、p38蛋白的表達(dá)，免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)檢測RAW264.7 巨噬細(xì)胞中c-Jun，c-Fos 的核轉(zhuǎn)錄。結(jié)果：與LPS誘導(dǎo)組相比，DMY明顯降低了LPS誘導(dǎo)小鼠感染性休克的死亡率；同時(shí)體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示， DMY不僅可劑量依賴性抑制LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞P-ERK 、P-JNK、P-p38和蛋白表達(dá)水平的上調(diào)。還可明顯抑制LPS誘導(dǎo)引起的RAW264.7細(xì)胞c-Jun，c-Fos蛋白核轉(zhuǎn)錄。結(jié)論：DMY可通過抑制 MAPK信號(hào)通路的磷酸化水平從而抑制c-Jun和c-Fos的激活，降低LPS誘導(dǎo)的小鼠感染性休克的死亡率。

二氫楊梅素；RAW264.7細(xì)胞；MAPK；脂多糖

廣西藤茶[Ampelopsis grossedentata (Hand.-Mazz) W.T.Wang]是葡萄科蛇葡萄植物顯齒葡萄的莖葉，是一種應(yīng)用廣泛的藥用植物，具有清熱利濕、活血通絡(luò)、平肝降壓的功效。二氫楊梅素(dihydromyricetin,DMY)是廣西藤茶中的主要活性成分，具有抗氧化、抗炎、降血脂以及預(yù)防酒精肝等藥理作用[1-3]。據(jù)報(bào)道，其藥理作用與抑制葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4(Glucose transporter 4,GLUT4)的核轉(zhuǎn)移、促進(jìn)AMPKα(AMP-activated protein kinase α)的磷酸化以及對(duì)抗超氧陰離子自由基引起的氧化性損傷有關(guān)[4，5]。最近研究報(bào)道，DMY作為IKK的抑制劑，通過抑制T細(xì)胞活化，對(duì)小鼠遲發(fā)性超敏反應(yīng)和大鼠關(guān)節(jié)炎發(fā)揮抑制作用[6]。但目前該化合物對(duì)LPS誘導(dǎo)的小鼠感染性休克尚無相關(guān)報(bào)道，其作用機(jī)理亦不清楚。

臨床上感染性休克主要源于LPS對(duì)巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞的過度活化[7]。作為一種重要免疫細(xì)胞，巨噬細(xì)胞參與很多種慢性炎癥反應(yīng)疾病如：動(dòng)脈粥樣硬化、神經(jīng)退行性疾病等，并且在腫瘤發(fā)生、衰老的生理病理過程中具有重要作用。在外界因素的刺激下絲裂原蛋白激酶(Mitogen activation protein，MAPK)及IKK-NF-κB信號(hào)通路被激活，促進(jìn)趨化因子的分泌，進(jìn)一步造成IL-6和TNF-α，誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)、環(huán)氧化酶-2(Cyclooxygenase-2,COX-2)等細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)的分泌。RAW264.7細(xì)胞是一種鼠源性的單核巨噬細(xì)胞系，在受到外界因素如脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)刺激時(shí)能夠合成并釋放大量的炎癥介質(zhì)和炎癥因子，作為一種炎癥細(xì)胞模型而被廣泛用于炎癥研究。因此，本研究擬通過建立LPS誘導(dǎo)小鼠休克模型進(jìn)行整體動(dòng)物研究，同時(shí)建立LPS激活RAW264.7巨噬細(xì)胞的炎癥實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ吞接?DMY的抗炎作用分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 6～8周齡的雄性C57/BL6小鼠，購自廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.1.2 細(xì)胞株 小鼠來源的巨噬細(xì)胞株(RAW264.7)購自ATCC。

1.1.3 主要試劑 DMY分析標(biāo)準(zhǔn)品，HPLC≥98%(南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司)；脂多糖 (LPS)、地塞米松(Sigma 公司)；c-Jun、c-Fos、P-ERK、ERK、P-JNK、JNK、P-p38、p38、辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗(Cell signaling公司)；β-actin(Santa Cruz公司)；胎牛血清、DMEM(Gibco公司)； 羊抗兔熒光二抗(Invitrogen公司)。

1.2 方法

1.2.1 小鼠感染性休克模型的建立和分組 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物被隨機(jī)分空白對(duì)照組、模型組、DMY組、DEX組。DMY組腹腔注射給藥7 d，在第7天DMY給藥1 h以及DEX給藥30 min后分別腹腔注射LPS(40 mg/kg)制備小鼠感染性休克模型[8]。之后每隔24 h觀察一次行為變化及死亡率，連續(xù)觀察7 d。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng) 細(xì)胞用 DMEM 完全培養(yǎng)液(含10% 胎牛血清，含青霉素、鏈霉素各1 000 U/L)于5% CO2、37℃培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)。細(xì)胞生長至80%融合后用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 DMY作用于LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞 將處于對(duì)數(shù)生長期的RAW264.7細(xì)胞按1×106個(gè)/孔接種于6孔板中。24 h后待細(xì)胞生長至80%融合狀態(tài)，加入DMY至終濃度為10、50、100 μmol/L干預(yù)1 h，之后LPS刺激組和DMY給藥組均加入LPS，使其終濃度為100 ng/ml，正常對(duì)照組加入相同體積的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)1 h后，收集細(xì)胞提取蛋白。

1.2.4 Western blot 檢測P-ERK、ERK、P-JNK、JNK、P-p38、p38蛋白的表達(dá) 10%SDS-PAGE膠電泳分離蛋白、電轉(zhuǎn)移法使蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用含5%脫脂奶粉的TBST (Tris Buffered Saline with Tween 20) 室溫下封閉后加入相應(yīng)蛋白的一抗，4℃過夜。TBST洗膜后以辣根過氧化物酶(Horseradish peroxidase,HRP)標(biāo)記的二抗(1∶2 000)孵育2 h，TBST洗膜后加ECL曝光顯影。

1.2.5 免疫熒光 在培養(yǎng)板中將已爬好細(xì)胞的玻片用磷酸鹽緩沖溶液(Phosphate buffer saline,PBS)浸洗3次之后用4%的多聚甲醛固定15 min，PBS浸洗3次×3 min。0.5%Triton X-100破膜5 min，PBS浸洗3次×3 min。每張玻片滴加DAPI(1∶200)，室溫避光孵育30 min后PBS浸洗3次×3 min。每張玻片滴加稀釋好的c-Fos 或 c-Jun抗體(1∶500)，37℃孵育2 h，PBS浸洗3次×3 min。滴加稀釋好的熒光二抗，室溫孵育1 h，PBS浸洗3次×3 min。避光封片，拍照。

2 結(jié)果

2.1DMY對(duì)LPS誘導(dǎo)的小鼠感染性休克模型的影響 結(jié)果如表1及圖1所示，模型組小鼠在給予致死劑量的LPS刺激后120h內(nèi)全部死亡，死亡率為100%；100mg/kg的DMY治療組中13只小鼠，在給予致死劑量的LPS刺激后，至第5天時(shí)死亡率為53.8% ，即有6只小鼠存活，在第7天小鼠死亡率仍為53.8%，表明在5d之后，仍然存活的6只小鼠身體狀態(tài)恢復(fù)正常。50mg/kg的DMY治療組第2天至第5天的死亡率為58.3%，至第7天時(shí)12只小鼠有11只死亡，死亡率為91.7%，這一結(jié)果表明，DMY可抑制LPS誘導(dǎo)的小鼠死亡并呈劑量依賴性。

2.2DMY對(duì)LPS誘導(dǎo)的MAPKs信號(hào)通路的影響 如圖2A結(jié)果所示，未被LPS刺激的RAW246.7細(xì)胞并不能表達(dá)P-ERK,P-JNK以及P-p38。該細(xì)胞在給予LPS刺激1h以后，P-ERK、P-JNK、P-p38蛋白的表達(dá)顯著提高，與空白對(duì)照組相比有顯著性差異。加入DMY干預(yù)以后與LPS組相比，DMY可劑量依賴性抑制LPS誘導(dǎo)引起的RAW264.7細(xì)胞P-JNK、P-p38蛋白表達(dá)水平的上調(diào)，尤其在100 μmol/L DMY作用下，這一抑制作用最為明顯，三次結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析如圖2B所示。但是該化合物對(duì)P-ERK則沒有明顯的抑制作用。雖然P-ERK、P-JNK及p38均屬于MAPKs家族，但是DMY對(duì)其抑制作用并不完全相同。

表1 DMY對(duì)LPS誘導(dǎo)的小鼠感染休克模型的影響

Tab.1 Effcet of DMY on LPS-induced septic shock model in mice

Mortalityrate24h48h72h96h120h144h168hModelgroup38.59%(5/13)61.5%(8/13)92.3%(12/13)92.3%(12/13)100%(13/13)100%(13/13)100%(13/13)DMY100mg/kggroup15.4%(2/13)23.1%(3/13)38.5%(5/13)46.2%(6/13)53.8%(7/13)53.8%(7/13)53.8%(7/13)DMY50mg/kggroup25%(3/12)58.3%(7/12)58.3%(7/12)58.3%(7/12)58.3%(7/12)75%(9/12)91.7%(11/12)DMY30mg/kggroup0%(0/12)0%(0/12)0%(0/12)0%(0/12)0%(0/12)0%(0/12)0%(0/12)

圖1 DMY對(duì)LPS誘導(dǎo)的小鼠感染性休克模型的影響Fig.1 Effect of DMY on LPS-induced septic shock model in mice

2.3 DMY對(duì)LPS誘導(dǎo)的c-Jun蛋白的影響 如上述結(jié)果所示，DMY能夠明顯抑制JNK磷酸化表達(dá)，而JNK可以調(diào)節(jié)核轉(zhuǎn)錄因子c-Jun的核轉(zhuǎn)移。因此在本研究中，我們進(jìn)一步觀察DMY是否對(duì)c-Jun的核轉(zhuǎn)移產(chǎn)生影響。研究中采用免疫熒光技術(shù)觀察c-Jun的核內(nèi)表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)中，帶有綠色熒光抗體用于標(biāo)記c-Jun，采用可與細(xì)胞核中雙鏈DNA結(jié)合而發(fā)揮標(biāo)記作用的DAPI標(biāo)記細(xì)胞核。如圖3 所示，帶有綠色熒光的c-Jun主要集中于細(xì)胞質(zhì)當(dāng)中，與DAPI所標(biāo)記的細(xì)胞核不能重疊。與空白對(duì)照組相比，LPS刺激1 h可明顯增加c-Jun在細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)，與標(biāo)記細(xì)胞核的DAPI發(fā)生重疊，表明LPS作用后可促進(jìn)c-Jun的核轉(zhuǎn)移。加入100 μmol/L DMY干預(yù)以后，與LPS刺激組相比，c-Jun的在核內(nèi)表達(dá)的熒光強(qiáng)度明顯減弱，更接近對(duì)照組水平，證明DMY可明顯抑制LPS誘導(dǎo)引起的RAW264.7細(xì)胞c-Jun蛋白的核轉(zhuǎn)錄。

2.4 DMY對(duì)LPS誘導(dǎo)的對(duì)c-Fos蛋白的影響

圖2 DMY對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW 264.7 細(xì)胞MAPKs磷酸化蛋白表達(dá)的影響Fig.2 Effect of DMY on LPS-induced related protein expression in RAW 264.7 cellsNote: Compared with LPS group,*.P<0.05.

c-Jun是可誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄因子異二聚體AP-1的一種蛋白，另一個(gè)蛋白為c-Fos。我們的研究結(jié)果表明，DMY能夠明顯抑制c-Jun核轉(zhuǎn)錄，及其調(diào)節(jié)因子JNK的磷酸化。我們前期的研究結(jié)果顯示，DMY亦可抑制MAPK家族另一蛋白p38的活化，該蛋白可調(diào)節(jié)c-Fos的核轉(zhuǎn)錄，因此我們進(jìn)一步觀察DMY是否能夠抑制c-Fos在細(xì)胞核中的表達(dá)。如圖4 所示，我們同樣采用帶有綠色熒光抗體標(biāo)記c-Fos，采用DAPI定位細(xì)胞核?？瞻讓?duì)照組中，帶有綠色熒光的c-Fos集中于細(xì)胞質(zhì)當(dāng)中。但是在LPS刺激1 h后，可明顯增加c-Fos在細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)。加入100 μmol/L DMY干預(yù)以后，與LPS刺激組相比，c-Fos的在核內(nèi)表達(dá)的熒光強(qiáng)度明顯減弱，更接近對(duì)照組水平，證明DMY可明顯抑制LPS誘導(dǎo)引起的RAW264.7細(xì)胞c-Fos在細(xì)胞核內(nèi)的表達(dá)。

圖3 DMY對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞 c-Jun蛋白核轉(zhuǎn)錄的影響Fig.3 Effect of DMY on LPS-induced c-Jun expression in RAW264.7 cells

圖4 DMY對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞 c-Jun核轉(zhuǎn)錄的影響Fig.4 Effect of DMY on LPS-induced c-Jun nucleus translocation in RAW264.7 cells

3 討論

黃酮類化合物廣泛存在于自然界的多種植物中。這類化合物具有多種活性，包括抗氧化、抗炎等作用。DMY是來源于中藥藤茶的一種黃酮類化合物，已經(jīng)被報(bào)道具有抗炎鎮(zhèn)痛、抗癌、抗氧化及免疫調(diào)節(jié)等作用[9]。研究表明，該化合物可改善非酒精性脂肪肝患者的糖代謝、脂代謝及各項(xiàng)生化指標(biāo)[10]。通過上調(diào)HO-1 (Heme oxygenase-1) 表達(dá)發(fā)揮抗氧化作用[5]，同時(shí)研究表明DMY的抗氧化活性和抗酸堿活性主要?dú)w因于其結(jié)構(gòu)中鄰三羥基群[11]。我們的前期研究結(jié)果表明，DMY通過結(jié)合于IKKβ第46位半胱氨酸，抑制IKKβ激酶活性，從而抑制T細(xì)胞活化，及相關(guān)細(xì)胞因子的分泌，達(dá)到免疫抑制作用[11]。巨噬細(xì)胞與T細(xì)胞同為機(jī)體重要的免疫細(xì)胞，是感染性休克的主要參與細(xì)胞。在本研究當(dāng)中，我們觀察了DMY對(duì)LPS所導(dǎo)致的小鼠休克死亡率影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，DMY能夠明顯降低LPS所導(dǎo)致的小鼠休克死亡率，提示DMY可能通過抑制巨噬細(xì)胞活化從而抑制炎癥反應(yīng)。巨噬細(xì)胞不僅本身參與炎癥反應(yīng)，其分泌的炎癥因子COX-2、iNOS、TNF-α和 IL-1β等，亦與炎癥的進(jìn)展密切相關(guān)[12]。已有研究報(bào)道，DMY可抑制iNOS,IL-6等炎癥因子的釋放，這一作用可歸因于抑制IKKβ-IKBα-NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[13]。

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，LPS所參與的跨膜信號(hào)受體TLR4不僅可通過IKKβ-NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路 ，還可以通過MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路來調(diào)控LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞活化[14]。MAPK所調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄因子AP-1(Activator protein-1,AP-1) 由c-Jun和c-Fos組成，是哺乳動(dòng)物細(xì)胞中最早發(fā)現(xiàn)具有結(jié)合特異性序列的轉(zhuǎn)錄因子之一。c-Jun和c-Fos的活性可被多種刺激因素誘導(dǎo)，包括生長因子、炎性因子、細(xì)菌及病毒感染、各種理化刺激等。這些刺激因素可以通過活化的MAPK級(jí)聯(lián)反應(yīng)促進(jìn)多種底物磷酸化，激活c-Jun和c-Fos的瞬時(shí)表達(dá)[15]， 從而參與炎癥發(fā)生過程。其中c-Jun的轉(zhuǎn)錄活性是通過磷酸化其N端的絲氨酸-63和-73而獲得。外界的各種刺激，包括生長因子，細(xì)胞因子和UV輻射均可誘導(dǎo)其活化。JNK通過結(jié)合于c-Jun的活化區(qū)域，從而特異性磷酸化這兩個(gè)絲氨酸位點(diǎn)[16]。 我們的結(jié)果表明，DMY正是通過抑制MAPK家族中JNK的磷酸化，而產(chǎn)生抑制c-Jun核轉(zhuǎn)錄的作用。 c-Fos是組成AP-1二聚體中的另一個(gè)蛋白， MAPK家族中的p38在整體動(dòng)物，及體外模型上均可磷酸化c-Fos的轉(zhuǎn)錄活化區(qū)域。在UV誘導(dǎo)活化的相關(guān)途徑中，外源性c-Fos不僅是p38的底物，其核內(nèi)表達(dá)水平也可被p38所誘導(dǎo)，提示p38在介導(dǎo)c-Fos的磷酸化和基因轉(zhuǎn)錄活化方面，發(fā)揮關(guān)鍵作用[17]。我們的研究結(jié)果表明，DMY通過抑制p38活化，而達(dá)到抑制c-Fos蛋白的核內(nèi)表達(dá)水平。

MAPK家族除JNK,p38以外，還包括ERK。雖然ERK活化亦可誘導(dǎo)促進(jìn)c-Fos合成增加，轉(zhuǎn)入核內(nèi)與已存在的c-Jun結(jié)合，形成AP-1異二聚體，增加AP-1活性[15]。但是我們研究發(fā)現(xiàn)DMY并不能影響ERK的磷酸化表達(dá)，綜上，我們的研究表明，DMY通過下調(diào)P-JNK和P-p38表達(dá)，抑制LPS誘導(dǎo)的c-Jun和c-Fos的核轉(zhuǎn)移，從而抑制巨噬細(xì)胞的活化，最終發(fā)揮抗炎作用并對(duì)LPS誘導(dǎo)的小鼠感染性休克產(chǎn)生保護(hù)作用。

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[收稿2016-01-20]

(編輯 許四平)

Study on anti-inflammatory effect and underlying mechanism of DMY in LPS-induced septic mice

WANG Rui,LIU Juan,SU Xiao-Hui,CHEN Jian-Yu，YANG Fen,LI Ting.State Key Laboratory of Quality Research in Macau Institute for Applied Research in Medicine and Health,Macau University of Science and Technology,Macau 999078,China

Objective:To investigate the effect of dihydromyricetin (DMY) on LPS-induced septic shock in mice and the related underlying mechanism.Methods: The LPS-induced septic shock mice model was established after the mice were pre-treated by DMY for 7 days.The mortality rate was calculated at 24,48,72,96,120,144 and 168 h after the mice were intraperitoneal injected with LPS.For elucidation of underlying mechanism,RAW246.7 were pre-incubated with DMY for 1 h,and then stimulated by LPS 100 ng/ml.Western blot was performed for determination of P-ERK,P-JNK and P-p38 expression.Immunohistochemistry was applied to explore c-Fos and c-Jun nucleus translocation.Results: DMY could significantly inhibit LPS-induced mice mortality.Inhibitory effect of DMY on the phosphorylation of JNK and p38 contributed to the anti-inflammatory effect of DMY in vivo.Furthermore,DMY obviously prevented c-Fos and c-Jun nucleus translocation.Conclusion: The anti-inflammatory effect of DMY is attributed to the suppression on c-Fos and c-Jun nucleus translocation,via inhibition of the phosphorylation of JNK and p38.

Dihydromyricetin;RAW264.7;MAPK;Lipopolysaccharide

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.04.003

①本文受澳門科技發(fā)展基金資助(081/2013/A3)。

王 蕊(1988年-)，女，博士，主要從事中藥抗炎與免疫藥理方面的研究，E-mail：ruiwang853@gmail.com。

及指導(dǎo)教師：李 婷(1980年-)，女，博士，助理教授，博士生導(dǎo)師，主要從事中藥抗炎與免疫藥理方面的研究，E-mail：tli@must.edu.mo。

R96

A

1000-484X(2016)04-0465-05