王 平 劉芳芳 李俊蓮 馬彥平 張曉薇 李艷彥 張維駿 陶功定

(山西中醫(yī)學院，太原030619)

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正常組與人工模擬寒環(huán)境組大鼠肺組織蛋白組學差異分析

王 平 劉芳芳 李俊蓮 馬彥平 張曉薇 李艷彥 張維駿 陶功定

(山西中醫(yī)學院，太原030619)

目的：探討正常組與人工模擬寒環(huán)境組大鼠肺組織蛋白組學差異表達及質譜分析。方法：選取20只SD大鼠隨機分為正常對照組與寒環(huán)境組，每組10只。寒環(huán)境組模型復制使用人工氣候箱：(T)=(6±2)℃，每天刺激4 h(其余時間為正常組溫濕度)；正常組(T)=(21±2)℃，每天持續(xù)24 h。造模7 d后，兩組大鼠于麻醉前12 h禁食、禁水，稱量體重。麻醉后開胸取出左肺組織10 mg /只，每組取3個樣本進行樣品蛋白質制備、雙向電泳實驗、圖像分析、質譜檢測。結果：對兩組差異蛋白圖譜進行蛋白質組學分析,鑒定出9個蛋白在兩組之間差異表達,寒環(huán)境組與正常對照組比較，其中4個表達上調、5個表達下調。結論：通過蛋白質組學分析，鑒定出的蛋白與外寒環(huán)境有相關性。

寒環(huán)境；肺組織；蛋白組學；差異分析

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 CHAPS、尿素、丙烯酰胺、三羥甲基氨基甲烷、硝酸銀、二硫蘇糖醇(DTT)、碘乙酰胺(-20℃保存)、TEMED、痕量溴酚藍、IPG膠條等。

1.1.2 主要儀器設備 冷凍離心機、固相pH梯度等電聚焦儀、垂直板電泳儀凝膠圖像掃描儀、MALDI-TOF-MS(Bruker公司的Auto-Reflex型質譜儀)等。

1.1.3 動物分組與造模 適應性飼養(yǎng)7 d后，將20只SD大鼠隨機分為正常對照組與人工模擬寒環(huán)境組，每組10只。自由進食飲水。參照文獻[1]方法，使用人工氣候箱模擬寒環(huán)境氣候，將大鼠置于環(huán)境相應的人工氣候箱內，寒環(huán)境組：(T)=(6±2)℃，每天刺激4 h(其余時間為正常組溫濕度)；正常組：(T)=(21±2)℃，每天持續(xù)24 h。

1.2 實驗方法

1.2.1 試劑配制 組織裂解液、Bradford貯存液、Bradford工作液、Tris-HCl(pH8.8)、13%聚丙烯酰胺凝膠、0.5%瓊脂糖封膠液、0.05%考染液(W/V)、考染固定液、考染脫色液、銀染液、5%TFA、5×電泳緩沖液(Tris-甘氨酸-SDS)、CCA基質用溶劑、脫鹽液、洗脫液、飽和CCA溶液等。

1.2.2 雙向電泳蛋白質樣品的制備 每組各取3只大鼠肺組織10 mg,液氮研磨至細粉狀后稱取0.1 mg，加入裂解液950 μl與蛋白酶抑制劑19 μl,超聲破碎后加入RNAase與DNAase各10 μl，冰浴、4℃離心各20 min，取上清液，放置冰箱(-80℃)保存。

蛋白質定量：在1.5 ml Eppendorf管內分別加入牛血清白蛋白(BSA,2 mg/ml)1 μl、2 μl、至20 μl，后加雙蒸水至100 μl，并設復管。調零后加100 μl雙蒸水、1 ml Bradford搖勻。紫外分光光度計595 nm讀吸光度值并繪制標準曲線。

1.2.3 雙向電泳 第一向固相pH梯度等電聚焦：提取蛋白和重泡漲液(8 mol/L尿素、0.5%IPG緩沖液1.75 μl、2%CHAPS、痕量溴酚藍、20 mmol/L DTT 7 μl)混合，總體積為350 μl，加入IPG膠槽中，為避免樣品溶液中產生氣泡，因此使用加樣槍時應小心地滴入膠槽中并將IPG干膠的膠面朝下放入膠槽內,蓋好膠槽蓋之前取1 ml覆蓋油覆蓋IPG膠條，后將膠槽置于固相pH梯度等電聚焦儀上。20℃設定程序進行重泡漲與等電聚焦，20 h總電壓時間積80 000 Vh。

第二向垂直平板電泳:將平衡好的IPG膠條轉移至13%的聚丙烯酰胺均膠頂端，為使二者緊密接觸，因而盡量排除氣泡。蛋白質分子量Marker置于堿性端旁，放置時與膠條平行，同時用0.5%瓊脂糖封膠、循環(huán)水(18℃)冷卻。

1.2.4 銀染與考馬斯亮藍染 SDS-PAGE膠依次經過固定30 min、增敏30 min、水洗3×5 min、反應20 min、顯影、終止等步驟。銀染結束后將凝膠板置于固定液中固定，脫色液中過夜。

1.2.5 采集蛋白圖像 設置參數(shù)后啟動掃描程序，進行掃描灰度尺并矯正亮度、修正圖像(角度矯正、噪聲過濾等)。最后將圖像發(fā)送至ImageMaster的軟件分析程序，圖像分析。

1.2.6 雙向凝膠電泳圖像分析 檢測：確定被檢測的點，通過調整改變參數(shù)(算子數(shù)、靈敏度等)、手工編輯等工作檢測出圖像中所有的點。

背景扣除：在點密集處設置抽樣區(qū)域，依次使用計算機完全自動化背景扣除(非點模式)和手工背景扣除。

匹配：為比較不同凝膠中的蛋白表達情況，需要在已經進行完點校正檢測的凝膠之間找出代表同一蛋白質的點，然后激活匹配按鈕并觀察重疊匹配的效果及趨勢。

標準化：激活標準化導航、設定參數(shù)、查看實驗數(shù)據(jù)，根據(jù)各點的檢測值進行不同凝膠之間的精確對比。

圖像校正：第一、對所有凝膠進行校正光強度校正。第二、單向校正。第三、雙向校正。建立凝膠和點的實驗數(shù)據(jù)報告

1.2.7 差異點的標示 將鑒定出來的差異蛋白點標示在相對應的分析膠(銀染2-DE圖)上，下調用阿拉伯數(shù)字表示，上調用阿拉伯數(shù)字后加“，”表示以示區(qū)別。

1.2.8 肽質量指紋圖譜鑒定蛋白質 切膠:使用消毒過的刀片將凝膠切成小膠塊(約1～2 mm3)并反復清洗。

脫色與干膠:將小膠塊置于100～200 μl的溶液內(50%乙腈、25 mmol/L NH4HCO3)振蕩直至膠片中的藍色完全褪凈，后將膠塊放置在真空離心干燥機內干燥至體積縮小成近似球狀。整個過程約50 min。

酶切與肽段提取:把3～7 μl胰蛋白酶酶液加在干燥好的膠塊上，待酶液完全被吸收后加5 μl NH4HCO3溶液保濕，37℃溫浴18～20 h。反復收集酶切后的上清并將上清液合并離心干燥。

PMF圖像收集及在線檢索:所有的PMF質譜圖都是使用布魯克道爾頓公司的Bruker Auto-REFLEX的MALDI-TOF-MS。儀器設置：20 kV，正離子，基質用CCA，內標按照胰蛋白酶自切峰2163.05為校正標準，外標為7種標準肽段的混合物:Angiotesin_Ⅱ_[M+H]+_mono:1046.54；Angiotesin_Ⅰ_[M+H]+_mono：1296.68；Substance_P_[M+H]+_mono:1347.74；Bombesin[M+H]+_mono:1619.82；ACTH_clip(1-17)[M+H]+_mono:2093.09； ACTH_clip(18-39)[M+H]+_mono:2465.20；Somatostatin(28)[M+H]+_mono:3147.47。

最后得到的質譜數(shù)據(jù)用Mascot(http：//www.matrixscience.co.uk)軟件在NCBInr數(shù)據(jù)庫內進行檢索。檢索參數(shù)設置為：Database——NCBInr；Taxonomy——Mus Enzyme——Trypsin；Allow up to——1；Variable modifications——Carbamidonethyl(C)和Oxidation(M)；Peptide tol.+——0.3.通過PMF鑒定蛋白質可以根據(jù)分子量、等電點、肽段匹配數(shù)、序列覆蓋率以及軟件所給分值來最后判斷是否是我們所要鑒別的蛋白，如果PMF不能鑒定就進一步采用MS/MS鑒定。

1.3 統(tǒng)計學方法 第一、運用Newman-Keuls方法進行檢驗不同樣本之間的各蛋白點的表達量，并判定是否具有統(tǒng)計學意義。第二、運用Fisher exact的方法來判定相應的差異蛋白點是否可作為標志蛋白，是否具有統(tǒng)計學意義。P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 正常組(A組)與寒環(huán)境組(E組)蛋白質組差異圖像分析 見圖1，A組和E組匹配率73.80%。

2.2 正常組與寒環(huán)境組比較的差異蛋白質斑點 共計有9個蛋白質斑點在兩組之間表達差異，差異點分布在pI3.0～10.0、分子量14.0～97.0 kD之間。見圖2。

2.3 正常組與寒環(huán)境組差異點小結 與正常對照組相比，寒環(huán)境組差異斑點中表達上調的斑點編號是1,5,8,9；表達下調的斑點編號是2,3,4,6,7。見表1。

圖1 A組與E組蛋白質組差異圖像分析(ImageMaster 2D platinum軟件)Fig.1 Image analysis of difference between A group and E group

2.4 正常組與寒環(huán)境組比較的差異蛋白質功能 熱休克蛋白70(Heat shock protein 70，HSP70)是膜結構相關蛋白,主要的生物學作用是因其能結合靶蛋白的疏水片段從而防止肽鏈的錯誤盤繞。當細胞受到有害刺激或者環(huán)境變化時,細胞的部分結構和功能蛋白就會發(fā)生變性[2]。由于HSP70在心腦血管病中對心肌細胞和腦細胞有明顯的保護作用[3,4]，因而HSP70與臨床上多種疾病關系非常密切，例如心腦缺血、癲癇、多發(fā)性硬化、感染、腫瘤等。同時它還可以激發(fā)抗腫瘤細胞的特異性反應,結合細胞內的全部異常肽庫,因而 HSP70-肽疫苗可以是多價的,這不但對于防止免疫逃逸從而增強免疫效果是有利的,同時為腫瘤疫苗開發(fā)也提供了新的思路[2]。還有報道指出HSP70有可能是某些致病菌的致病因素[5]。

角蛋白-細胞骨架Ⅰ型10(Keratin,type Ⅰ cytoskeletal 10，CK10)、角蛋白-細胞骨架Ⅱ型1(Keratin,type Ⅱ cytoskeletal 1，CK1),細胞角蛋白在不同表皮及皮膚附屬器腫瘤的表達隨不同病變和腫瘤而有所變化，但特異性的CK組型仍保持不變[6]。腫瘤的鑒別診斷中常常采用不同細胞角蛋白的聯(lián)合表達分析。其中最常用、最有價值的一組CK是CK7/CK20[6]。

圖2 差異蛋白質斑點位置Fig.2 Location of differential protein spotsNote: A.Sample 2 of E group;B.Sample 2 of A group.

表1 正常組與寒環(huán)境組比較的差異蛋白質斑點列表

Tab.1 Differential protein spots in normal control group and cold enviroment group

No.ProteinnameAccessionNo.MascotscoreCoveragePIMW1Eukaryotictranslationinitiationfactor5A-1isoformBgi|450354513735%5.08168215Heatshockprotein70cognategi|309319133028%5.37707938Keratin,typeⅠcytoskeletal10gi|35169870830615%4.87537279Argininosuccinatesynthasegi|2545341422417%7.63464672Keratin,typeⅡcytoskeletal1gi|35169507055114%6.39650363Keratin1gi|73312181689%8.16659784ChainE,StructureoftheTypsin-BindingdomainofBowman-Birktypeproteasegi|23033812714%8.69232906Inhibitoranditsinteractiongi|127140111558%4.96212697Withtrypsinmyosinlightchain4Guanicedeaminasegi|991070653126%5.5650984

鳥嘌呤脫氨酶(Guanine deaminase，GD)在嘌呤類分解代謝過程中起著重要的作用，主要是因為它催化鳥嘌呤水解脫氨同時生成黃嘌呤,所以GD是體內十分重要的氨基水解酶。所以在臨床上如需判斷老年慢性肝病患者肝細胞損壞的情況,可以檢測血清中GD的活性變化,它可以作為監(jiān)測肝細胞損害的敏感指標。

3 討論

目前，蛋白組學技術在中醫(yī)基礎理論中有關病證、發(fā)病研究中的實際應用還未見報道。本實驗通過對正常組與寒環(huán)境組大鼠的肺組織雙向凝膠電泳的差異分析，同時結合軟件分析和手工篩選，我們在以上2-DE凝膠上從表達差異蛋白質點中選取點清晰且表達水平改變明顯的蛋白質點作為最終質譜鑒定的對象，利用PMF的方法鑒定了3個與寒證可能相關的差異表達的蛋白質。其中在寒環(huán)境組大鼠肺組織中高表達的有:熱休克蛋白70、角蛋白-I細胞骨架10、鳥嘌呤脫氨酶GD；在正常組高表達的是角蛋白-II型細胞骨架1、角蛋白1、肌球蛋白輕鏈4。

熱休克蛋白是在進化過程中有高度保守性的應激蛋白,對維持機體的自身穩(wěn)定性起著重要作用。熱休克蛋白70在應激狀態(tài)下可顯著升高,在人的單核細胞中誘導前炎癥反應[7],且有研究顯示某些病原微生物的HSP70具有強抗原性,可以作為疫苗的候選成分[8,9]。HSP70有可能是某些致病菌的致病因素[10],對病原體的攻擊產生保護性免疫應答[11]。另有報道指出，細菌感染時，hsp70 是其主要抗原[12],免疫系統(tǒng)對這些高度保守的分子產生免疫應答。本實驗研究結果顯示，在寒邪組大鼠肺組織中HSP70表達上調，我們推測可能是因為寒邪侵襲機體，引起機體的應激反應，從而出現(xiàn)HSP70的高表達，以提高機體的應激耐受能力。

本實驗選取人工模擬寒環(huán)境大鼠作為研究對象，選取正常大鼠作為對照，進行大鼠肺組織蛋白質組學的研究，尋找兩組大鼠差異蛋白的交集。初步證實了此種差異蛋白質交集的存在，并且此種差異蛋白質的功能主要涉及機體免疫應答，其中熱休克蛋白在寒環(huán)境組的高表達初步認為可能是寒邪侵襲機體，從而引起機體的應激反應，以提高機體的應激耐受能力。

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[收稿2015-04-09 修回2015-05-21]

(編輯 張曉舟)

Normal group and artificial simulation of cold environment proteomics of lung tissue of rats variance analysis

WANG Ping,LIU Fang-Fang，LI Jun-Lian,MA Yan-Ping,ZHANG Xiao-Wei，LI Yan-Yan,ZHANG Wei-Jun,TAO Gong-Ding.Shanxi College of Traditional Chinese Medicine University,Taiyuan 030619，China

Objective:To analyse and discuss the variance and mass spectrometry of proteomics of rats' lung tissues between groups of normal and simulated cold environments.Methods: A total of 20 SD rats were randomly divided into two groups of normal and simulated cold environments with 10 rats in each group.The temperature of normal environment group was controlled in 21℃ with a fluctuation of 2℃ lasting 24 h per day.In contrast, the temperature of simulated cold environment group was controlled in 6℃ with a fluctuation of 2℃ lasting 4 h per day while the temperature and humidity for the rest of time were exactly the same as the situation in normal environment group.The preoperative fasting, water-deprivation and weighting were adopted 12 h before anaesthesia to both groups after the continuing 7-day experimentation.Left lung tissues of each rat in both groups were removed by the amount of 10 mg, whereas three random samples from each group were tested by experiments of protein extraction, bidirectional electrophoresis, image analysis and mass spectrometry identification.Results: Given the proteomics analysis of two differential sets, it is indicated that in simulated cold environment group, among nine sorts of protein, four sorts perform rising while five falling compared to that of normal group.Conclusion: There exists a correlation between protein and cold environment based on the results of proteomic analysis.

Cold environment;Lung tissues;Proteomics;Variance analysis

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.04.008

王 平(1977年-),女,博士,講師,主要從事《黃帝內經》生態(tài)醫(yī)學思想研究。

及指導教師：陶功定(1955年-)，男，博士，教授，主要從事《黃帝內經》生態(tài)醫(yī)學思想研究，E-mail：taogongding_22@163.com。

R22

A

1000-484X(2016)04-0486-04