杜聯(lián)峰 孫萬邦 丁立珉 唐艷麗

(遵義醫(yī)學(xué)院珠海校區(qū)/貴州省免疫學(xué)研究生教育創(chuàng)新基地，珠海519041)

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重組hIL-10對(duì)AA大鼠T淋巴細(xì)胞及IL-17A的影響研究①

杜聯(lián)峰 孫萬邦②丁立珉 唐艷麗

(遵義醫(yī)學(xué)院珠海校區(qū)/貴州省免疫學(xué)研究生教育創(chuàng)新基地，珠海519041)

目的：以重組人白細(xì)胞介素-10(human interleukin-10，hIL-10)及其聯(lián)合甲氨碟呤(MTX)作用佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠模型，檢測T淋巴細(xì)胞亞群及IL-17A水平的變化情況，研究重組hIL-10及其聯(lián)合MTX治療佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠的效果。方法：用IL-10、MTX以及IL-10+MTX處理AA大鼠模型，用流式細(xì)胞儀測定各組大鼠血液中CD4+T細(xì)胞與CD8+T細(xì)胞比值，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測大鼠血清IL-17A的含量。結(jié)果：各治療組CD4+淋巴細(xì)胞總數(shù)與CD4+/CD8+值不同程度下降，各治療組與模型組比較有顯著性差異(P<0.05)。各治療組IL-17A水平有不同程度下降，各治療組與模型組比較有顯著性差異(P<0.05)，聯(lián)合組與IL-10組比較有顯著性差異(P<0.05)。結(jié)論：重組hIL-10能下調(diào)AA大鼠血液中CD4+T細(xì)胞的數(shù)量及CD4+/CD8+比值，降低血清中IL-17A水平，聯(lián)合組較IL-10組對(duì)血清中IL-17A影響更顯著，提示重組hIL-10聯(lián)合MTX 在治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎中能更好地發(fā)揮作用。

重組人白介素-10；佐劑性關(guān)節(jié)炎；T細(xì)胞亞群；IL-17A

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(Rhematic arthritis，RA)是以慢性進(jìn)行性關(guān)節(jié)滑膜以及關(guān)節(jié)軟骨損傷為特征的一種自身免疫性疾病，發(fā)病率高[1]。近年研究證實(shí)RA發(fā)生與免疫調(diào)節(jié)紊亂有關(guān)，T細(xì)胞的異?；罨癟細(xì)胞亞群的平衡失衡與RA的發(fā)病密切相關(guān)，另外，Th17細(xì)胞所分泌的IL-17A在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者中明顯升高，并參與了骨關(guān)節(jié)的損害，是RA發(fā)病重要環(huán)節(jié)之一[2]。IL-10是一種主要由Th2細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等分泌的一種重要免疫抑制性的因子，在人體內(nèi)主要是由巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，IL-10被認(rèn)為是介導(dǎo)下調(diào)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)中的重要細(xì)胞因子，因?yàn)樗軌蛞种苹罨靶?yīng)性T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞的功能，介導(dǎo)免疫抑制的作用[3,4]。研究表明IL-10在RA中主要由關(guān)節(jié)部位巨噬細(xì)胞和T細(xì)胞產(chǎn)生，其可通過抑制炎性細(xì)胞因子的分泌，減輕關(guān)節(jié)的腫脹和炎性細(xì)胞浸潤及炎性滲出物的產(chǎn)生，具有明顯的免疫抑制和免疫調(diào)節(jié)功能，有一定的治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的前景。甲氨蝶呤(Methotrexate，MTX)作為一種慢作用抗風(fēng)濕藥，臨床上已普遍用于治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎，它主要是通過其細(xì)胞內(nèi)代謝產(chǎn)物多聚谷氨酸化甲氨蝶呤(MTXPG)持續(xù)發(fā)揮治療作用[5]。本研究通過應(yīng)用重組hIL-10及其聯(lián)合甲氨碟呤(MTX)作用佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠模型，檢測血液T淋巴細(xì)胞亞群及血清中IL-17水平的變化情況，進(jìn)一步通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)IL-10在RA中的作用，為重組hIL-10在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 健康SPF級(jí)SD大鼠40只，雌性，由廣東省實(shí)驗(yàn)大鼠中心提供，[許可證號(hào)SCXK(粵)2008-0002]。在遵義醫(yī)學(xué)院珠海校區(qū)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心飼養(yǎng)。

1.1.2 主要試劑與實(shí)驗(yàn)儀器 anti-rat CD8a PE OX8、anti-rat CD4 FITC OX3購自美國Sigma公司，Rat IL-17A ELISA Kit購自欣博盛生物科技有限公司，流式細(xì)胞儀，酶標(biāo)儀等。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組及動(dòng)物模型的建立 40只SD大鼠編號(hào)以后按隨機(jī)數(shù)字表法分為2組：空白對(duì)照組8只SD大鼠，AA大鼠模型組32只SD大鼠，AA大鼠模型組造模：將卡介苗于80℃滅活后加入弗氏不完全佐劑中充分乳化混勻配成10 mg/ml的弗氏完全佐劑，于左側(cè)足底皮下注射0.1 ml建立AA模型。20 d后同法加強(qiáng)免疫1次，加強(qiáng)免疫后15 d后造模成功，隨機(jī)分為4組，即模型對(duì)照組、IL-10治療組、MTX治療組、IL-10與MTX聯(lián)合治療組，每組8只。三個(gè)治療組自造模成功日起通過腹腔給藥15 d。給藥劑量分別為空白對(duì)照組NS 1 ml/kg；IL-10組5 μg/ml；MTX組1 mg/kg；聯(lián)合組3 μg/kg IL-10+1 mg/kg MTX。

1.2.2 AA大鼠模型構(gòu)建成功一般情況觀測 造模后，觀察各組大鼠的精神狀態(tài)、食量、活動(dòng)、毛色變化、體溫等情況。通過血細(xì)胞分析儀檢測大鼠外周血液白細(xì)胞數(shù)量的變化。

1.2.3 T細(xì)胞亞群檢測 末次給藥后，取大鼠外周血50～100 μl于EDTA抗凝管中，每管分別加入抗大鼠FITC-CD4抗體，PE-CD8抗體各10 μl，室溫下振蕩混勻，避光放置30 min，每管加入溶血素2 ml，裂解紅細(xì)胞10 min，1 000 r/min離心10 min，棄上清：每管再加入PBS液2 ml洗滌細(xì)胞，500 r/min離心5 min，棄上清，加入多聚甲醛10滴重懸細(xì)胞，上流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。

1.2.4 血清IL-17A檢測 各組末次給藥后通過內(nèi)眥采血2 ml，分離血清，ELISA法檢測血清中細(xì)胞因子IL-17A水平。

2 結(jié)果

2.1AA模型大鼠構(gòu)建成功 大鼠行為學(xué)改變：模型組大鼠于注射弗氏完全佐劑后開始出現(xiàn)不同程度食欲下降，皮毛聳立、足關(guān)節(jié)腫脹，造模后第2天注射局部出現(xiàn)紅腫，皮溫升高(圖1)。造模后大鼠出現(xiàn)體重減輕、進(jìn)食量減少、跛行、活動(dòng)減少等癥狀。對(duì)照組未出現(xiàn)上述表現(xiàn)。

血液中白細(xì)胞數(shù)量變化情況：模型組大鼠外周血白細(xì)胞總數(shù)與正常對(duì)照組比較明顯升高(表1)，有顯著差異(P<0.05 )。

2.2 實(shí)驗(yàn)大鼠T細(xì)胞亞群測量結(jié)果 與空白對(duì)照組相比，模型組的大鼠外周血中CD4+T淋巴細(xì)胞的百分比含量明顯升高，兩組之間有顯著性差異(P<0.01)，CD8+T淋巴細(xì)胞的百分比無明顯變化，兩組之間無顯著性差異(P>0.05)，模型組CD4+/CD8+T淋巴細(xì)胞比值升高，兩組之間有顯著性差異(P<0.05)。各治療組與模型組相比CD4+T淋巴細(xì)胞數(shù)均有不同程度降低(P<0.05)，其中聯(lián)合組與IL-10組、MTX組比較有顯著差異(P<0.05 )，說明聯(lián)合用藥組對(duì)CD4+T淋巴細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用比單用IL-10或MTX要好。CD8+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)顯示各治療組與模型組和空白對(duì)照組比較，CD8+T淋巴細(xì)胞數(shù)均有不同程度升高(P<0.05)，但各治療組調(diào)節(jié)CD8+T淋巴細(xì)胞水平無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，各治療組與模型組比較，CD4+/CD8+T淋巴細(xì)胞比值降低，說明各治療組能下調(diào)CD4+/CD8+細(xì)胞比值，治療組能調(diào)節(jié)T細(xì)胞亞群的平衡，見表2。

圖1 模型組大鼠足關(guān)節(jié)紅腫Fig.1 Model group rat paw joint swelling

表1 各組大鼠外周血白細(xì)胞數(shù)量的變化(WBC×109L-1)

Tab.1 Levels of leukocytes in peripheral blood of rates(WBC×109L-1)

GroupsBefcremodelingAftermodeling20dAftermodeling35dNormal6.39±0.816.18±1.326.26±0.75Model6.58±1.4521.7±2.311)20.16±2.071)

Note：Compared with normal group,1)P<0.05.

GroupsCD4+CD8+CD4+/CD8+Normal31.46±2.951)20.39±2.951.11±0.391)Model41.75±4.5420.27±1.692.05±0.06hIL-1037.80±0.251)23.02±1.141)1.61±0.061)MTX36.74±0.541)22.21±1.131)1.63±0.041)Joint35.01±1.101)2)3)22.06±0.891)2)1.56±0.151)

Note：Compared with model group,1)P<0.05；compared with IL-10 group,2)P<0.05；compared with MTX,3)P<0.05.

GroupsIL-17A(ng/L)Normal111.04±11.151)Model258.41±15.15IL-10186.24±13.411)MTX128.61±13.571)2)Joint112.31±15.091)2)

Note：Compared with model group,1)P<0.05 ；compared with IL-10 group,2)P<0.05.

2.3 IL-17A動(dòng)態(tài)檢測結(jié)果 模型組的AA大鼠血清中IL-17A水平顯著高于空白對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，各治療組與模型組相比血清中IL-17A有不同程度降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其中MTX組、聯(lián)合組與IL-10組比較有顯著差異(P<0.05 )，說明MTX和聯(lián)合用藥組的效果要比單用IL-10好，但是聯(lián)合用藥組與MTX組比較，IL-17A水平下降最多，說明聯(lián)合用藥較單用MTX更有效。見表3。

3 討論

RA通常是由于機(jī)體對(duì)自身抗原外周免疫耐受失衡導(dǎo)致自身反應(yīng)性效應(yīng)細(xì)胞異常擴(kuò)增而引發(fā)的組織特異性炎癥反應(yīng)。在RA的發(fā)病機(jī)制中T細(xì)胞的作用被認(rèn)為是有非常重要作用的。在RA發(fā)病過程中CD4+Th1細(xì)胞的活化被認(rèn)為是炎性效應(yīng)細(xì)胞誘發(fā)關(guān)節(jié)炎癥反應(yīng)的重要因素。在機(jī)體正常狀態(tài)下，CD4+/CD8+T淋巴細(xì)胞比例維持在一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡的狀態(tài)，是機(jī)體免疫功能的一項(xiàng)重要指標(biāo)[6]，近年來研究表明在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者體內(nèi)CD4+/CD8+T淋巴細(xì)胞比例失衡。最近研究在 RA患者中自身IgG抗體反應(yīng)的特異靶點(diǎn)[7,8]，通過分析表明：這些特異靶點(diǎn)能夠與自身HLA結(jié)合，從而誘發(fā)自身反應(yīng)性CD4+T細(xì)胞異常激活和擴(kuò)增，導(dǎo)致關(guān)節(jié)局部滑膜細(xì)胞，成纖維細(xì)胞，單核細(xì)胞的聚集和上調(diào)黏附分子的表達(dá)并進(jìn)一步促進(jìn)促炎細(xì)胞因子和趨化因子的分泌，包括IL-1、IL-6、IL-8、MIP-I等[9]。這些細(xì)胞因子直接參與骨關(guān)節(jié)炎癥反應(yīng)，加重骨關(guān)節(jié)的炎癥病理損傷。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比，模型組大鼠外周血CD4+T細(xì)胞含量明顯升高，CD8+T細(xì)胞含量無明顯變化，CD4+/CD8+T淋巴細(xì)胞比值升高。經(jīng)過治療后，各治療組與模型組相比，CD4+T淋巴細(xì)胞數(shù)均有不同程度降低，CD8+T淋巴細(xì)胞數(shù)均有不同程度升高，CD4+/CD8+T淋巴細(xì)胞比值降低。這些結(jié)果表明在佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠體內(nèi)存在T細(xì)胞免疫功能失調(diào)，自身反應(yīng)性CD4+T細(xì)胞異常活化和擴(kuò)增，導(dǎo)致CD4+T淋巴細(xì)胞數(shù)升高，從而導(dǎo)致骨關(guān)節(jié)炎癥的發(fā)生和發(fā)展。本研究結(jié)果表明，與模型組比較通過重組IL-10、MTX及其IL-10+MTX聯(lián)合治療后，CD4+T淋巴細(xì)胞數(shù)量下降，CD4+/CD8+T淋巴細(xì)胞比值降低，這些結(jié)果說明IL-10可以抑制活化及效應(yīng)性CD4+T細(xì)胞功能，介導(dǎo)免疫抑制的作用，從而減輕骨關(guān)節(jié)的炎癥反應(yīng)和損傷，IL-10和MTX聯(lián)合應(yīng)用與單用MTX對(duì)CD4+T細(xì)胞數(shù)及CD4+/CD8+T細(xì)胞比例無顯著性差異。本研究在AA大鼠模型治療15天后，IL-10組和MTX組及其聯(lián)合用藥組的關(guān)節(jié)病變與模型組相比較，病變程度有所減輕，足關(guān)節(jié)軟組織腫脹度明顯降低，以聯(lián)合用藥組的效果最明顯，大鼠活動(dòng)能力明顯增強(qiáng)，說明IL-10可以增強(qiáng)MTX對(duì)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的治療效果。

IL-17A是由Th17細(xì)胞產(chǎn)生的促炎性細(xì)胞因子，IL-17家族包括六個(gè)成員(A-F)，各個(gè)細(xì)胞因子間大約有20%～30%的相同序列[10]，研究發(fā)現(xiàn)IL-17A在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者滑膜中表現(xiàn)出與疾病嚴(yán)重程度相關(guān)的細(xì)胞因子，在患者體內(nèi)發(fā)揮多種生物學(xué)活性，參與炎癥及骨關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞的損傷，在RA的病理過程中扮演著重要的角色[11]。研究表明類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型中抑制IL-17A的作用可以明顯抑制關(guān)節(jié)炎癥狀，減輕局部炎癥反應(yīng)的發(fā)生，主要因?yàn)镮L-17A可以刺激類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞中IL-6和IL-8的表達(dá)[12]，上調(diào)軟骨細(xì)胞及滑膜成纖維細(xì)胞金屬蛋白酶的表達(dá)，從而參與骨及軟骨的破壞、血管新生促進(jìn)軟骨蛋白多糖及膠原降解，抑制軟骨細(xì)胞蛋白的合成[13]。本實(shí)驗(yàn)通過檢測IL-17A水平，模型組的AA大鼠血清中IL-17A水平顯著高于空白對(duì)照組，各治療組與模型組相比血清中IL-17有不同程度降低，這些結(jié)果說明IL-10可以抑制AA大鼠體內(nèi)Th17細(xì)胞功能，減少IL-17A的釋放，從而減輕骨關(guān)節(jié)的炎癥反應(yīng)和損傷，IL-10與MTX聯(lián)合應(yīng)用與單用IL-10治療對(duì)IL17A水平的影響有顯著性差異，治療可以取得更好的效果。

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[收稿2015-08-01]

(編輯 許四平)

Effect of recombinant hIL-10 on lymphocytes and IL-17A of an AA rat model

DU Lian-Feng，SUN Wan-Bang，DING Li-Min，TANG Yan-Li.Zhuhai Campus Zunyi Medical College/Graduate Education and Innovation Base of Immunology in Guizhou Province，Zhuhai 519041，China

Objective:Adjuvant arthritis(AA)rats interfered with recombinant hIL-10,methotrexate(MTX)separately,we detected the changes of T cell subsets in rat′s blood and IL-17 A in rat′s serum.Methods: AA rats interfered with recombinant hIL-10,MTX and IL-10 plus MTX.The changes of the CD4+and CD8+T cell subsets were detected by flow cytometry;the Levels of IL-17A in serum of rats were measured by ELISA method. Results: Compare to normal control group,the CD4+T cell total quantity and CD4+/CD8+T cell Proportion was significantly decreased,there were significant differences between the treatment group and the untreated group(P<0.05),the IL-17A of treatment group was significantly decreased,there was a significant differences(P<0.05).The combination group had significant difference compared with IL-10 group.Conclusion: Recombinant hIL-10 can down-regulate the blood of AA rats in the number of CD4+T cells and CD4+/CD8+ratio,reduce serum levels of IL-17A.The combination group compared with the IL-10 group effect on serum IL-17A more significantly,the results displayed recombinant hIL-10 plus MTX in the treatment of rheumatoid arthritis can better play the role.

Recombinant hIL-10；Adjuvant arthritis；T cell subsets ；Interleukin-17A

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.04.005

①本文受貴州省教育廳自然科學(xué)重點(diǎn)培育項(xiàng)目(2008032)資助。

杜聯(lián)峰(1976年-)，男，碩士，副教授，主要從事分子免疫學(xué)研究，E-mail：8wy149842@163.com。

R392.12

A

1000-484X(2016)04-0476-04

②通訊作者，E-mail：sunwb7224@sina.com。