朱 彤 涂文娟 談志麗 劉亮明

(南京醫(yī)科大學(xué)附屬上海松江中心醫(yī)院/上海交通大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院松江分院感染科，上海201600)

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IRF3基因干擾對LPS刺激原代枯否細(xì)胞早期細(xì)胞因子分泌動態(tài)變化的影響①

朱 彤 涂文娟 談志麗 劉亮明

(南京醫(yī)科大學(xué)附屬上海松江中心醫(yī)院/上海交通大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院松江分院感染科，上海201600)

目的：探討干擾素調(diào)節(jié)因子3(Interferon regulator factor 3，IRF3)shRNA腺病毒對脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)刺激枯否細(xì)胞(Kupffer cell，KC)早期細(xì)胞因子分泌動態(tài)變化的影響。方法：采用在體灌注分離培養(yǎng)大鼠原代KC，以IRF3 shRNA腺病毒體外感染KC，48 h后采用LPS刺激細(xì)胞，于0、2、4和6 h收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，并收集6 h細(xì)胞。上清液細(xì)胞因子的分泌采用ELISA分析；細(xì)胞IRF3基因表達(dá)采用RT-PCR和Western blot方法檢測。結(jié)果：LPS刺激誘導(dǎo)了KC內(nèi)IRF3 mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)升高，IRF3 shRNA腺病毒的應(yīng)用抑制了LPS刺激誘導(dǎo)和非刺激組成性IRF3 mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)；KC受LPS刺激活化后極早期(2 h)IFN-β分泌即上升，4 h達(dá)峰值，6 h分泌水平開始下降，但仍維持于高水平。干擾腺病毒的應(yīng)用抑制了LPS刺激后各時間點(diǎn)IFN-β的分泌，抑制分泌高峰的出現(xiàn)，并使6 h分泌水平趨于正常；KC活化后極早期即分泌大量TNF-α，并于2 h內(nèi)達(dá)到峰值，隨后分泌逐漸下降，但6 h仍維持于高水平。干擾腺病毒的應(yīng)用抑制了LPS刺激各時間點(diǎn)TNF-α的分泌，并抑制了分泌高峰的出現(xiàn)；IL-1β分泌增高出現(xiàn)于LPS刺激4 h后，6 h分泌水平達(dá)更高值。干擾腺病毒的應(yīng)用抑制了LPS刺激早期KC對IL-1β的分泌；KC受LPS刺激活化后極早期IL-10分泌即上升，且隨著LPS刺激時間延長，其分泌水平逐漸增加。IRF3 shRNA腺病毒的應(yīng)用促進(jìn)了LPS刺激后早期各時間點(diǎn)IL-10的分泌。結(jié)論：IRF3 shRNA腺病毒可使原代枯否細(xì)胞IRF3基因表達(dá)沉默；在LPS刺激原代KC，IRF3可促進(jìn)其下游信號分子IFN-β、前炎細(xì)胞因子TNF-α和IL-1β的分泌，并抑制抑炎細(xì)胞因子IL-10分泌。因此，IRF3可能在肝組織免疫炎癥性損傷的發(fā)生中起中心作用。

原代枯否細(xì)胞；干擾素調(diào)節(jié)因子3；基因干擾；固有免疫；炎性反應(yīng)

枯否細(xì)胞(Kupffer cell，KC)是肝臟常駐的組織巨噬細(xì)胞，是肝臟針對來自腸道和/或血循環(huán)中病原微生物及其釋放的毒性代謝產(chǎn)物的第一道防線，是機(jī)體固有免疫應(yīng)答的重要成分。病原微生物或其毒性產(chǎn)物可激活KC，誘導(dǎo)其表達(dá)和釋放多種炎性細(xì)胞因子，造成肝組織急性損傷性炎癥[1]。已知KC活化后的炎性釋放效應(yīng)主要是由TLR4信號通路激活所介導(dǎo)的[2，3]。LPS等炎性刺激物，可結(jié)合并激活KC表面TLR4分子，進(jìn)而誘導(dǎo)其下游接頭蛋白MyD88和TRIF信號活化[1，2]。MyD88信號可通過激活NF-κB，誘導(dǎo)前炎細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β等的表達(dá)和釋放，引起組織炎性損傷；TRIF信號(或MyD88非依賴信號)可通過激活I(lǐng)RF3，誘導(dǎo)Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生[1]。已證實(shí)，IRF3-IFN-β是KC發(fā)揮固有免疫應(yīng)答的關(guān)鍵信號分子通路[1]。在病原微生物感染期間，轉(zhuǎn)錄因子IRF3在巨噬細(xì)胞內(nèi)的升高程度與機(jī)體對病原微生物的固有免疫應(yīng)答水平呈密切的正相關(guān)關(guān)系[4]。

傳統(tǒng)認(rèn)為，IRF3和NF-κB是兩條獨(dú)立并互不影響的信號分子通路。但是，近年發(fā)現(xiàn)，IRF3在組織炎癥反應(yīng)中也起重要的作用[5，6]。我們前期研究也證實(shí)，在肝組織炎癥損傷期間，肝內(nèi)IRF3的表達(dá)顯著升高[7]。為進(jìn)一步探討IRF3對肝組織炎癥反應(yīng)的影響機(jī)制，在本項(xiàng)目中，我們采用IRF3基因沉默實(shí)驗(yàn)，研究了IRF3信號對KC活化后早期前炎細(xì)胞因子TNF-α和IL-1β以及抑炎性細(xì)胞因子IL-10分泌水平動態(tài)變化的影響。因?yàn)楣逃忻庖呒?xì)胞的炎性釋放是組織炎癥反應(yīng)發(fā)生的一個早期事件。項(xiàng)目研究的完成，有助于闡明IRF3對KC炎癥信號通路的影響，為將來探討IRF3在急性肝衰竭發(fā)生中的免疫炎癥效應(yīng)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物 雄性健康SD大鼠，體重250 g，由上海交通大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供。動物合格證號：SYXK(滬)2009-0086。動物飼養(yǎng)環(huán)境溫度：20℃～23℃。濕度：40%～80%。所有大鼠均自由飲水和進(jìn)食。每12 h開燈或關(guān)燈。實(shí)驗(yàn)前禁食12 h。實(shí)驗(yàn)動物的使用符合國家動物保護(hù)法。

1.1.2 主要試劑與耗材 IV型膠原酶和Trizol購自美國Invitrogen公司；1640培養(yǎng)液和胎牛血清購自美國Gibco公司；青鏈霉素混合液購自德國Hyclone公司；Percoll細(xì)胞分離液購自瑞典Pharmacia公司；LPS購自美國Sigma公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR Green PCR試劑盒購自美國Thermo公司；PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成； ELISA試劑盒購自美國Ebioscience公司；IRF3兔單克隆抗體購自美國Cell Signaling公司；Western blot試劑購自碧云天公司。

1.2 方法

1.2.1 原代枯否細(xì)胞的分離與培養(yǎng) 采用文獻(xiàn)[8]方法分離培養(yǎng)大鼠原代KC。操作方法簡述如下：0.2%戊巴比妥鈉以25 ml/kg腹腔注射麻醉，0.1%的肝素1 ml腹腔注射。75%酒精消毒大鼠后，行開腹門靜脈插管，予PBS灌注沖洗肝臟，推注0.05% Ⅳ膠原酶行原位在體灌注消化肝組織。隨后剪取肝臟置于Ⅳ型膠原酶消化液中，小心撕碎肝組織。用不連續(xù)Percoll密度梯度離心分離枯否細(xì)胞，分離出來的枯否細(xì)胞以1640培養(yǎng)液(胎牛血清10%、青霉素1 000 U/L、鏈霉素1 000 U/L)、37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)3～4 h后，洗去未貼壁細(xì)胞即可獲得純化的枯否細(xì)胞?？莘窦?xì)胞鑒定采用墨汁吞噬試驗(yàn)和ED2染色，方法見參考文獻(xiàn)[8]。細(xì)胞活性在90%以上時用于下一步實(shí)驗(yàn)研究。

1.2.2 腺病毒感染原代枯否細(xì)胞方法 IRF3 shRNA綠色熒光蛋白(GFP)表達(dá)腺病毒由本實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)合成，并經(jīng)抑制效率研究，選取抑制效率最好者(針對基因位點(diǎn)1219～1239：5′-GGTTGTTCCTACATGTCTTAA-3′)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。該干擾腺病毒采用了pAdeno-U6-CMV-EGFP質(zhì)粒攜帶，并經(jīng)與腺病毒骨架質(zhì)粒pBHGlox E1E3重組包裝構(gòu)建。其中的綠色熒光蛋白(GFP)基因可方便病毒感染效率的觀察。腺病毒感染原代枯否細(xì)胞的具體方法：細(xì)胞接種于6孔板，每孔細(xì)胞數(shù)4×106個。細(xì)胞培養(yǎng)24 h待其穩(wěn)定貼壁后，吸棄培養(yǎng)上清液。每孔細(xì)胞中加入500 μl含腺病毒MOI為150的無血清的培養(yǎng)液，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)2 h。棄上清，換成含5%血清的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)46 h。

1.2.3 細(xì)胞的處置 干擾腺病毒感染細(xì)胞48 h后，按照文獻(xiàn)[9,10]，以終濃度為20 μg/ml的LPS刺激細(xì)胞。在LPS刺激細(xì)胞0、2、4和6 h后，分別收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液并收集刺激6 h細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.4 RT-PCR檢測 肝枯否細(xì)胞采用Trizol處理，總RNA抽提按說明書進(jìn)行。以總RNA作為模板用于第一鏈cDNA的合成。引物設(shè)計(jì)借助Primer Premier 6軟件設(shè)計(jì)，基因檢測引物序列和產(chǎn)物長度見表1。操作方法按試劑盒說明書進(jìn)行。反應(yīng)體系：4.0 μl cDNA模板，2 μl 10×PCR緩沖液，4 μl dNTP混合物，2 μl TaqDNA聚合酶，上、下游引物各2 μl，補(bǔ)充無核酶水至25 μl, 置于PCR儀中進(jìn)行聚合擴(kuò)增。IRF3基因反應(yīng)條件為: 94℃預(yù)變性5 min，94℃ 1 min，51℃ 45 s，72℃ 45 s，共32個循環(huán); 72℃延伸10 min。所得PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，GAPDH作為內(nèi)參照。電泳結(jié)果經(jīng)Bio-Rad Quantity-One 4.7成像分析軟件檢測，并計(jì)算待測基因灰度相對GAPDH的表達(dá)量。

1.2.5 細(xì)胞總蛋白抽提 細(xì)胞總蛋白提取按照試劑盒說明書操作。簡要步驟如下：用PBS洗細(xì)胞后，加入100 μl裂解液。用槍吹打數(shù)下，使裂解液與細(xì)胞充分接觸。待細(xì)胞充分裂解后，10 343 r/min離心5 min，取上清即為所需的細(xì)胞總蛋白。蛋白濃度的測定按照碧云天蛋白濃度測定試劑盒說明書操作，水浴煮沸，-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.6 免疫印跡(Western blot) 每個樣本取40 μg蛋白，進(jìn)行8%十二烷基硫酸鈉/聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳后，將蛋白轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上，用5%脫脂牛奶封閉1 h。封閉結(jié)束后，用IRF3抗體和內(nèi)參β-actin在4℃下孵育過夜。0.1%PBST漂洗3次，每次10 min。加辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫下孵育1 h。0.1%PBST漂洗3次，每次10 min。結(jié)果用ECL-Plus化學(xué)發(fā)光試劑盒檢測，X光片曝光。X光片顯影和定影后觀察結(jié)果。結(jié)果用Image J軟件讀取灰度值。

表1 基因擴(kuò)增引物序列和產(chǎn)物長度

Tab.1 Primer sequences and product length of gene amplification

GenePrimersequence5'→3'ProductlengthIRF3Sense:ACGCACAGATGGCTGACTTT102bpAnti-sense:TCCTCTTCCAGGTTGACAGGGAPDHSense:GACATGCCGCCTGGAGAAAC92bpAnti-sense:GACATGCCGCCTGGAGAAAC

1.2.7 酶聯(lián)免疫技術(shù)(ELISA) 細(xì)胞上清液采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫技術(shù)檢測不同時間點(diǎn)的TNF-α、IL-1β、IFN-β和IL-10，操作過程按照試劑盒說明書進(jìn)行。每份標(biāo)本取3復(fù)孔，結(jié)果取三者均值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)進(jìn)行6次。

2 結(jié)果

2.1IRF3shRNA腺病毒感染原代大鼠KC鏡下表現(xiàn) 原代KC培養(yǎng)24h后細(xì)胞完全舒展，大小基本一致，但形態(tài)不規(guī)則，可呈星形、多角形等(見圖1A)。KC常規(guī)培養(yǎng)24h穩(wěn)定貼壁后，感染IRF3shRNA腺病毒。圖1B為感染腺病毒48h后，KC在熒光倒置顯微鏡下的表現(xiàn)。鏡下可見KC內(nèi)表達(dá)的GFP。通過觀察細(xì)胞內(nèi)GFP的表達(dá)情況，可了解IRF3shRNA腺病毒對KC的感染效率(經(jīng)計(jì)算，腺病毒的細(xì)胞感染效率接近100%)。

2.2IRF3shRNA腺病毒對枯否細(xì)胞IRF3mRNA表達(dá)的影響 原代枯否細(xì)胞IRF3mRNA表達(dá)的凝膠電泳圖及其相對表達(dá)水平直方圖如圖2。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，LPS刺激細(xì)胞IRF3mRNA的相對表達(dá)水平較正常對照組細(xì)胞升高[(1.43±0.03)比(1.03±0.03)，P<0.05]，而干擾腺病毒預(yù)處理后，使LPS刺激細(xì)胞IRF3mRNA的相對表達(dá)水平降低[(0.72±0.07)vs(1.43±0.03)，P<0.05]。另外，與正常對照組相比，單獨(dú)應(yīng)用干擾腺病毒處理細(xì)胞IRF3mRNA的相對表達(dá)水平降低[(0.69±0.07)vs(1.03±0.03)，P<0.05]。這提示，IRF3shRNA腺病毒對原代枯否細(xì)胞LPS刺激誘導(dǎo)IRF3mRNA的高表達(dá)和非刺激性IRF3mRNA的組成性表達(dá)均有抑制性影響。

圖1 原代KC 腺病毒感染前后鏡下表現(xiàn) Fig.1 Optical microscopic manifestation of primary KC before and after affected by adenovirusNote: A.Optical microscopic manifestation(×200)of primary KC before affected by adenovirus；B.Inversed fluorescent microscopic manifestation(×200)of primary KC after affected by adenovirus.

2.3IRF3shRNA腺病毒對枯否細(xì)胞IRF3蛋白表達(dá)的影響 枯否細(xì)胞內(nèi)IRF3蛋白免疫印跡圖及其蛋白質(zhì)相對表達(dá)水平見圖3。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，LPS刺激細(xì)胞內(nèi)IRF3蛋白質(zhì)的水平較正常對照組升高[(1.32±0.10)vs(1.01±0.13)，P<0.05]，而干擾腺病毒預(yù)處理后，LPS刺激細(xì)胞IRF3蛋白的表達(dá)水平降低[(0.58±0.13)vs(1.32±0.10)，P<0.05]。另外，與正常對照組細(xì)胞比較，單獨(dú)應(yīng)用干擾腺病毒組細(xì)胞IRF3蛋白的水平降低[(0.61±0.03)比(1.01±0.13)，P<0.05]。這提示，LPS可刺激誘導(dǎo)KC胞內(nèi)IRF3蛋白表達(dá)升高，IRF3shRNA腺病毒對原代枯否細(xì)胞LPS刺激誘導(dǎo)IRF3蛋白的超高表達(dá)和非刺激性IRF3蛋白的組成性表達(dá)均有抑制性影響。

圖2 原代枯否細(xì)胞IRF3 mRNA表達(dá)情況(RT-PCR)Fig.2 Expression of IRF3 mRNA in primary KCs(RT-PCR)Note: A.Representative ethidium bromide-stained gel of RT-PCR products.Lane 1.IRF3 shRNA(-)LPS(-);Lane 2.IRF3 shRNA(-)LPS(+);Lane 3.IRF3 shRNA(+)LPS(-);Lane 4.IRF3 shRNA(+)LPS(+);M.DL2000 DNA marker；B.Statistical bar graph of relative expression of IRF3 mRNA in KCs.*.P<0.05 vs shRNA(-)LPS(-);#.P<0.05 vs IRF3 shRNA(-)LPS(+).

圖3 原代枯否細(xì)胞IRF3蛋白表達(dá)情況(Western blot) Fig.3 Expression of IRF3 protein(Western blot)Note: A.Western blot;B.Statistical bar graph of expression of IRF3 protein.Lane 1.IRF3 shRNA(-)LPS(-);Lane 2.IRF3 shRNA(-)LPS(+);Lane 3.IRF3 shRNA(+)LPS(-);Lane 4.IRF3 shRNA(+)LPS(+).*.P<0.05 vs shRNA(-)LPS(-);#.P<0.05 vs IRF3 shRNA(-)LPS(+).

2.4IRF3shRNA腺病毒對LPS刺激枯否細(xì)胞IFN-β早期分泌的動態(tài)影響IRF3shRNA腺病毒對LPS刺激枯否細(xì)胞IFN-β早期分泌的動態(tài)影響見圖4A。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，單獨(dú)應(yīng)用LPS處理原代枯否細(xì)胞IFN-β蛋白的分泌水平，在LPS刺激后2、4、6h時間點(diǎn)均較0h升高[(35.57±2.23)、(43.04±2.00)、(26.31±7.82)vs(17.09±1.84)pg/ml，均P<0.05]，4h時間點(diǎn)較2h和6h增高(均P<0.05)；干擾腺病毒預(yù)處理原代枯否細(xì)胞IFN-β蛋白的分泌水平，在LPS刺激后2h和4h時間點(diǎn)較0h和6h均增高[(24.73±2.68)、(25.77±5.26)vs(17.27±1.27)和(17.15±1.14)pg/ml，均P<0.05)]，4h與2h時間點(diǎn)之間以及6h與0h時間點(diǎn)之間IFN-β蛋白水平無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(均P>0.05)。另外，干擾腺病毒預(yù)處理細(xì)胞在LPS刺激后2、4、6h各時間點(diǎn)IFN-β蛋白的分泌水平均較單獨(dú)應(yīng)用LPS處理細(xì)胞低(均P<0.05)。這提示，LPS刺激后極早期(2h)即可誘導(dǎo)KC分泌IFN-β，4h達(dá)分泌峰值，6h分泌水平開始下降，但仍維持于高水平；IRF3shRNA腺病毒可抑制LPS刺激后各時間點(diǎn)IFN-β的分泌，抑制分泌高峰的出現(xiàn)，并使6h分泌水平正常。

圖4 原代枯否細(xì)胞培養(yǎng)上清液IFN-β、TNF-α、IL-1β和IL-10蛋白分泌水平(ELISA分析)Fig.4 Secretion levels of IFN-β，TNF-α，IL-1β and IL-10 protein in culture supernatant of primary KCs(ELISA assay)Note: A.Secretion levels of IFN-β protein;B.Secretion levels of TNF-α protein;C.Secretion levels of IL-1β protein;D.Secretion levels of IL-10 protein.*. P<0.05 vs 0 h;#.P<0.05 vs 2 h;△.P<0.05 vs 4 h;▼.<0.05 vs LPS.

2.5IRF3shRNA對LPS刺激枯否細(xì)胞TNF-α早期分泌的動態(tài)影響IRF3shRNA腺病毒對LPS刺激枯否細(xì)胞TNF-α早期分泌的動態(tài)影響見圖4B。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，單獨(dú)應(yīng)用LPS處理原代枯否細(xì)胞TNF-α蛋白分泌水平在LPS刺激后2、4、6h時間點(diǎn)均較0h升高[(445.52±49.08)、(348.96±13.08)、(288.80±27.74)vs(76.85±20.19)pg/ml，均P<0.05]，同時2h時間點(diǎn)較4h和6h高(P<0.05)，4h較6h高(P<0.05)；干擾腺病毒預(yù)處理原代枯否細(xì)胞TNF-α蛋白的分泌水平，在LPS刺激后2、4和6h時間點(diǎn)較0h升高[(234.39±40.04)、(208.15±85.62)、(179.27±13.37)vs(69.99±17.33)pg/ml，均P<0.05]，2、4和6h時間點(diǎn)之間比較無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(均P>0.05)。另外，干擾腺病毒預(yù)處理細(xì)胞在LPS刺激后2、4 、6h各時間點(diǎn)TNF-α蛋白的分泌水平均較單獨(dú)應(yīng)用LPS處理細(xì)胞低(均P<0.05)。這提示，LPS刺激后極早期(2h)即可誘導(dǎo)KC大量分泌TNF-α并達(dá)峰值，隨后分泌逐漸下降，但6h仍維持于高水平；IRF3shRNA腺病毒可抑制LPS刺激后早期各時間點(diǎn)TNF-α的分泌，并抑制了分泌高峰的出現(xiàn)。

2.6IRF3shRNA腺病毒對LPS刺激枯否細(xì)胞IL-1β早期分泌的動態(tài)影響IRF3shRNA腺病毒對LPS刺激枯否細(xì)胞IL-1β早期分泌的動態(tài)影響見圖4C。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，單獨(dú)應(yīng)用LPS處理原代枯否細(xì)胞IL-1β蛋白的分泌水平，在LPS刺激后4h和6h時間點(diǎn)均較0h和2h明顯升高[(173.35±20.23)、(560.73±89.26)vs(50.03±4.90)、(52.90±1.91)pg/ml，均P<0.05]，6h時間點(diǎn)較4h高(P<0.05)，0h與2h之間比較無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；干擾腺病毒預(yù)處理原代枯否細(xì)胞IL-1β蛋白分泌水平，在LPS刺激后4h和6h時間點(diǎn)較0h和2h升高[(87.73±27.34)、(330.42±97.27)比(48.35±4.10)、(50.57±3.28)pg/ml，均P<0.05]，6h較4h增高(均P<0.05)，0h和2h之間比較無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。另外，干擾腺病毒預(yù)處理細(xì)胞在LPS刺激后IL-1β水平均較單獨(dú)應(yīng)用LPS處理細(xì)胞4h和6h時間點(diǎn)分泌降低(均P<0.05)，2h和0h時間點(diǎn)比較無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。這提示，LPS刺激后極早期，IL-1β的分泌無明顯增加，直到4h后才開始上升，6h分泌達(dá)峰值；IRF3shRNA腺病毒抑制了LPS刺激后早期KC對IL-1β的分泌。

2.7IRF3shRNA腺病毒對LPS刺激枯否細(xì)胞IL-10早期分泌的動態(tài)影響IRF3shRNA腺病毒對LPS刺激枯否細(xì)胞IL-10早期分泌的動態(tài)影響見圖4D。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，單獨(dú)應(yīng)用LPS處理原代枯否細(xì)胞IL-10蛋白的分泌水平，在LPS刺激后2、4、6h時間點(diǎn)均較0h升高[(28.32±7.79)、(47.55±15.36)、(149.29±27.06)vs(18.89±3.53)pg/ml，均P<0.05]，6h時間點(diǎn)較2h和4h均高(均P<0.05)；干擾腺病毒預(yù)處理原代枯否細(xì)胞IL-10蛋白分泌水平，在LPS刺激2、4和6h時間較0h均升高[(39.05±3.09)、(180.20±35.48)、(621.38±178.99)vs(22.10±1.78)pg/ml，均P<0.05]，6h較2h和4h高(均P<0.05)。另外，干擾型病毒預(yù)處理細(xì)胞在LPS刺激后2、4和6h各時間點(diǎn)IL-10蛋白分泌水平均較單獨(dú)應(yīng)用LPS處理細(xì)胞高(均P<0.05)。這提示，LPS刺激后極早期(2h)即可誘導(dǎo)KC分泌IL-10，且在早期階段呈現(xiàn)進(jìn)行性分泌增加；IRF3shRNA腺病毒的應(yīng)用促進(jìn)了LPS刺激后早期各時間點(diǎn)IL-10的分泌。

3 討論

我們前期研究證實(shí)，急性肝衰竭肝內(nèi)IRF3的表達(dá)升高，阻斷炎癥相關(guān)信號系統(tǒng)UII/UT信號傳導(dǎo)，可抑制IRF3的表達(dá)和活化，并能減輕肝組織免疫炎癥性損傷[7，11，12]。這提示IRF3可能對肝組織炎癥反應(yīng)有影響。為探討IRF3在肝內(nèi)的免疫炎性效應(yīng)，我們在本項(xiàng)目中采用了LPS刺激原代KC實(shí)驗(yàn)。我們首先對KC內(nèi)IRF3的表達(dá)進(jìn)行了研究。我們發(fā)現(xiàn)，LPS刺激可誘導(dǎo)KC對IRF3mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)上調(diào)。在此基礎(chǔ)上，我們研究了IRF3-IFN-β信號與炎癥相關(guān)因子分泌之間的關(guān)系。

已知，在組織炎癥反應(yīng)中，固有免疫細(xì)胞對前炎細(xì)胞因子的分泌是一個早期事件。損傷性刺激在極早期誘導(dǎo)的肝內(nèi)TNF-α大量分泌，并進(jìn)而誘導(dǎo)IL-1β等細(xì)胞因子的級聯(lián)式釋放，是造成急性肝組織損傷性炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵因素[13]。因此，在本實(shí)驗(yàn)中，我們研究了LPS刺激早期，KC對細(xì)胞因子的分泌及其動態(tài)變化情況。我們發(fā)現(xiàn)，LPS刺激KC后，IRF3下游細(xì)胞因子IFN-β分泌在極早期(2h)即開始上升，4h達(dá)分泌峰值，而TNF-α的分泌水平在刺激2h內(nèi)即達(dá)峰值，隨后逐漸下降；IL-1β分泌則直到4h后才開始上升，6h分泌達(dá)峰值；IL-10分泌于2h開始逐漸上升，至6h達(dá)到峰值。上述細(xì)胞因子的這種時間依賴性分泌的動態(tài)變化規(guī)律，使我們至少可以得到以下三個方面的提示：①IRF3下游信號分子IFN-β可能不是TNF-α早期分泌的促發(fā)因素。因?yàn)镵C對IFN-β的分泌晚于TNF-α，特別是其分泌高峰出現(xiàn)于TNF-α峰值之后；②TNF-α可能是免疫炎癥反應(yīng)的始動因素。我們的實(shí)驗(yàn)顯示，除IFN-β外，IL-1β的分泌也晚于TNF-α。已證實(shí)，巨噬細(xì)胞活化后，TNF-α的早期爆式分泌，是隨后IL-1β等前炎細(xì)胞因子級聯(lián)式釋放的前提，決定了炎癥反應(yīng)的發(fā)生和發(fā)展[14]。TNF-α對枯否細(xì)胞IFN-β的表達(dá)與分泌是否存在影響目前尚不十分清楚。近年有文章顯示，TNF-α可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞IFN-β表達(dá)上調(diào)[15]。這提示TNF-α可能也存在固有免疫應(yīng)答效應(yīng)；③抑炎細(xì)胞因子IL-10分泌增加可能是細(xì)胞自身的一種負(fù)反饋調(diào)控機(jī)制。我們發(fā)現(xiàn)，在炎性激活早期，KC對IL-10的分泌是緊隨TNF-α和IFN-β分泌之后逐漸升高的。這時炎性釋放和炎癥反應(yīng)已開始啟動，并隨時間呈進(jìn)行性或級聯(lián)式增強(qiáng)，IL-10分泌水平的逐漸增加可能有助于防止過度的炎癥和免疫反應(yīng)。

為進(jìn)一步探討IRF3對炎癥相關(guān)因子的影響，我們對KC進(jìn)行了IRF3基因干擾實(shí)驗(yàn)。我們的研究顯示，IRF3shRNA腺病毒感染KC后，LPS刺激誘導(dǎo)的IRF3mRNA和蛋白質(zhì)超高表達(dá)及非刺激狀態(tài)下細(xì)胞對IRF3mRNA和蛋白質(zhì)的組成性表達(dá)均下調(diào)，且明顯抑制了LPS誘導(dǎo)的IRF3下游信號分子IFN-β在炎性激活早期各個時間點(diǎn)的分泌水平，抑制了分泌高峰的出現(xiàn)，并使其6h的水平趨于正常。這提示，我們所構(gòu)建的干擾腺病毒能有效地使IRF3 基因表達(dá)沉默，并阻斷其信號通路的傳導(dǎo)。此外，我們的結(jié)果還顯示，干擾腺病毒抑制了KC在炎性激活早期各時間點(diǎn)TNF-α分泌及隨后的IL-1β分泌，特別是抑制了極早期(2h)TNF-α的分泌峰值。這表明，IRF3存在炎性分泌促進(jìn)效應(yīng)。然而，IRF3促進(jìn)TNF-α等前炎細(xì)胞因子分泌的機(jī)制目前并未完全清楚。在KC炎性激活早期，TNF-α早于IFN-β分泌，因而TNF-α分泌不依賴于IRF3下游信號分子IFN-β。報告顯示，IRF3對NF-κB不存在直接作用[16]。最近研究發(fā)現(xiàn)，LPS刺激后，IRF3基因敲除巨噬細(xì)胞對TNF-α的分泌明顯減少，但細(xì)胞內(nèi)TNF-αmRNA的水平未受影響[17]。因此，IRF3對TNF-α的調(diào)控可能主要發(fā)生在轉(zhuǎn)錄后。

我們也研究了IRF3shRNA腺病毒對細(xì)胞因子IL-10分泌水平的影響。我們發(fā)現(xiàn)，干擾腺病毒的應(yīng)用促進(jìn)了LPS刺激KC早期各時間點(diǎn)IL-10的分泌。這表明，IRF3對IL-10的分泌存在抑制效應(yīng)。已知，IL-10是一種具有免疫調(diào)控效應(yīng)的抗炎性細(xì)胞因子(anti-inflammatorycytokine)。IL-10可通過誘導(dǎo)SOCS3的表達(dá)，抑制LPS刺激巨噬細(xì)胞對TNF-α、IL-6和iNOS的表達(dá)[18]。最近報告顯示，IL-10可降解NF-κBp65亞基并誘導(dǎo)MAPK磷酸酶使MAPK信號失活[19]。此外，IL-10還可抑制巨噬細(xì)胞激活，抑制固有免疫細(xì)胞針對病原體的免疫應(yīng)答[20]。因此，IL-10可能是TLR4免疫炎癥信號傳導(dǎo)的負(fù)性調(diào)控分子。在損傷刺激期間，IRF3對LPS誘導(dǎo)IL-10超高表達(dá)的抑制效應(yīng)，有助于增強(qiáng)細(xì)胞的固有免疫應(yīng)答和組織炎癥反應(yīng)。

本項(xiàng)目的研究從一個側(cè)面對急性肝衰竭發(fā)生的炎癥和免疫機(jī)制相統(tǒng)一的分子基礎(chǔ)進(jìn)行了探討?？莘窦?xì)胞作為肝內(nèi)主要的固有免疫細(xì)胞，不僅發(fā)揮著針對外源物質(zhì)的固有免疫應(yīng)答效應(yīng)，而且也是肝內(nèi)炎性釋放的主要來源。而上述免疫和炎癥效應(yīng)的產(chǎn)生都有一個統(tǒng)一的分子基礎(chǔ)，那就是IRF3。IRF3通過對其下游信號分子IFN-β、前炎細(xì)胞因子TNF-α和IL-1β分泌的促進(jìn)效應(yīng)以及對抑炎細(xì)胞因子IL-10分泌的抑制效應(yīng)，可能在急性肝衰竭肝組織免疫炎癥損傷的發(fā)生中起中心作用。項(xiàng)目成果對于將來急性肝衰竭內(nèi)科治療藥物關(guān)鍵分子靶點(diǎn)的選擇有重要價值。

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[收稿2015-08-01]

(編輯 張曉舟)

Effects of IRF3 gene interference on dynamic changes of cytokine secretions in early of LPS stimulation in primary Kupffer cells

ZHU Tong，TU Wen-Juan,TAN Zhi-Li,LIU Liang-Ming.Department of Infection,Songjiang Hospital Affiliated to First People′s Hospital,Shanghai Jiaotong University,Shanghai Songjiang Central Hospital Affiliated to Nanjing Medical University,Shanghai 201600,China

Objective:To investigate the effects of IRF3 shRNA adenovirus on dynamic changes of early cytokines in LPS-stimulated primary Kupffer cells(KCs).Methods: Rat KCs were isolated and purified by means of in situ perfusion.After being infected with adenovirus carrying IRF3 shRNA for 48 h,KCs were stimulated with LPS.Cell culture supernatants were collected respectively at 0,2,4 and 6 h after LPS stimulation as well as cells at 6 h.Supernatant cytokine secretion levels were detected by enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA).Intracellular gene expressions were tested by RT-PCR and Westeron blot.Results: IRF3 mRNA and protein were induced by LPS,but suppressed by IRF3 shRNA adenovirus in LPS-stimulated or non-stimulated KCs.IFN-β secretions rose in the very early stage(at 2 h),reached the peak at 4 h,and began to reduce but still remained high levels at 6 h after LPS stimulation in KCs.Interference adenovirus pretreatment suppressed IFN-β secretions(especially the secretion peak)at each time point after LPS stimulation.IFN-β secretions reached normal levels at 6 h after the stimulation in adenovirus-pretreated cells;TNF-α secretions rapidly increased in the very early stage and reached the peak at 2 h,then began to decrease gradually,but remained high levels at 6 h after LPS stimulation in KCs.Interference adenovirus pretreatment inhibited LPS-induced TNF-α secretions,especially the secretion peak;IL-1β secretions did not increase untill 4 h,but reached a higher level at 6 h after LPS stimulation.Interference adenovirus suppressed IL-1β secretions in the early stage of LPS stimulation;IL-10 secretions began to rise in the very early stage,and gradually increased over time after LPS stimulation in KCs.Pretreatment of adenovirus with IRF3 shRNA promoted upregulations of IL-10 secretions at each time point of the early of LPS stimulation.Conclusion: IRF3 gene expression can be silenced by IRF3 shRNA adenovirus.IRF3 can promote its downstream signaling molecule IFN-β and pro-inflammatory cytokines including TNF-α and IL-1β,and block anti-inflammation cytokine IL-10 secretions in LPS-stimulated primary KCs.Therefore,IRF3 may play a central role in immune inflammatory injury of liver tissues.

Primary kupffer cells;IRF3;Gene interference;Innate immune;Inflammatory reaction

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.04.004

①本文為國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81070357, 30660066)和上海市松江區(qū)科學(xué)技術(shù)攻關(guān)項(xiàng)目(14SJGGYY22)。

朱 彤(1990年-)，女，主要從事重癥肝病免疫機(jī)制研究，E-mail:zhutong1990@foxmail.com。

及指導(dǎo)教師：劉亮明(1968年-)，男，醫(yī)學(xué)博士，教授，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，主要從事肝臟病基礎(chǔ)和臨床研究，E-mail: liuliangming@hotmail.com。

R575.3

A

1000-484X(2016)04-0470-07