雷良玉 胡 燕 郭萌萌 盧 佳 鄭 文 徐華林 陳 超 徐 林

(貴州省遵義醫(yī)學院免疫學教研室，遵義563000)

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·基礎免疫學·

miRNA-126基因敲減小鼠脾臟中免疫細胞的組成變化①

雷良玉 胡 燕 郭萌萌 盧 佳 鄭 文 徐華林 陳 超 徐 林

(貴州省遵義醫(yī)學院免疫學教研室，遵義563000)

目的：觀察miRNA-126基因敲減(Knock down，KD)小鼠脾臟中免疫細胞組成比例變化并探討其意義。方法：Realtime PCR探針法檢測miR-126KD小鼠脾臟中miR-126表達水平，計算脾臟總細胞數(shù)；HE染色觀察脾臟組織的病理學變化；流式細胞術(FACS)分別檢測脾臟中DCs細胞、巨噬細胞、γδT細胞、NKT細胞，CD3+T細胞和其亞群以及CD19+B細胞的比例并計算細胞絕對數(shù)；免疫印跡法(Western blot,WB)檢測脾臟組織中磷酸化NF-κB和磷酸化Akt的表達水平。結(jié)果：與野生型(WT)小鼠相比，miR-126KD脾組織中miR-126表達水平明顯降低(P<0.05)，細胞總數(shù)明顯增加(P<0.05)，且發(fā)生明顯病理學改變；固有免疫細胞中NK細胞的比例和細胞絕對數(shù)顯著增加(P<0.05)，但巨噬細胞的比例顯著降低(P<0.05)；適應性免疫細胞中CD3+T細胞和CD4+T細胞的比例和絕對細胞數(shù)都顯著增加(P<0.05)，而CD19+B細胞僅絕對數(shù)顯著增加(P<0.05)；最后miRNA-126KD小鼠脾臟組織的磷酸化NF-κB和磷酸化Akt水平明顯增加(P<0.05)。結(jié)論：miRNA-126敲減小鼠脾臟中各免疫細胞亞群的組成發(fā)生明顯改變，可能與NF-κB和Akt信號通路傳遞變化有關，為后續(xù)探討miR-126在機體免疫應答中的作用提供了前期實驗基礎。

miRNA-126；基因敲減；免疫細胞；組成

脾臟(Spleen，Sp)是哺乳動物最大的外周免疫器官，是免疫應答的重要部位。脾臟中含有豐富的T細胞、B細胞、樹突細胞(DC)及巨噬細胞、NK細胞等細胞亞群，它們的組成比例和數(shù)量的維持對于機體免疫應答功能的發(fā)揮至關重要，且與多種臨床疾病的發(fā)生密切相關[1-3]。微小RNAs(microRNAs,miRNAs)廣泛存在于多種生命體中，并在機體多種組織器官的發(fā)育及功能中具有關鍵的調(diào)控作用。MicroRNA-126(miR-126)是miRNAs 家族中重要的一員，位于人表皮生長因子樣結(jié)構(gòu)域蛋白7(Human epidermal growth factor like domain protein multiple 7,EGFL7)基因7號內(nèi)含子中，其在血管和心臟、肺等組織器官的內(nèi)皮細胞中高表達，并參與組織細胞的發(fā)育和功能調(diào)控過程[4,5]。新近研究報道m(xù)iR-126也參與了機體多種免疫細胞的發(fā)育和功能的調(diào)控[6,7]。我們新近發(fā)現(xiàn)miRNA-126參與維持小鼠腸系膜淋巴結(jié)中T淋巴細胞的組成比例[8,9]，然而其是否也參與脾臟中各固有免疫細胞和適應性免疫細胞組成比例的維持，以及相關分子機制仍未有研究探討。因此，本研究中我們擬利用前期構(gòu)建的miR-126基因敲減(Knock down，KD)小鼠模型[10]，初步檢測分析miR-126敲減后脾臟中各免疫細胞的組成比例變化，為后續(xù)深入探討miR-126在機體免疫應答及相關疾病發(fā)生中的作用提供前期實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 雌性FVB小鼠和miR-126KD小鼠(廣州賽業(yè)生物科技有限公司)飼養(yǎng)于我校生物醫(yī)學中心動物室(SPF級)；蘇木精-伊紅(HE)染色液(泰康醫(yī)療);流式細胞儀(BeckmanCoulter)； 熒光顯微鏡(Olympus)； R-Phycoerythrin(PE)標記抗鼠CD4、CD19、CD3單克隆抗體，Percp-Cy5.5標記抗鼠CD8、F4/80、CD11c單克隆抗體，Allophycocyain(APC)標記抗鼠NK1.1、γδT單克隆抗體均購自 ebioscience公司；Rabbit NF-κB、Rabbit p-NF-κB、Rabbit p-Akt、GAPDH及Anti-Rabbit IgG HRP-linked(Cell Signaling公司)；BeyoECL Plus A、B液(碧云天公司)；Western blot化學發(fā)光成像儀(Carestream Health公司)；RNA提取試劑盒(TaKaRa)；Taqman 探針(ABI)。

1.2 方法

1.2.1 miR-126KD小鼠脾臟細胞數(shù)目的檢測 取出miR-126KD小鼠和WT小鼠脾臟；然后放入加有PBS平皿中，用玻片的糙面輕輕研磨制成單細胞懸液，并利用細胞計數(shù)板計取細胞總數(shù)。

1.2.2 HE染色觀察脾臟的形態(tài)學改變 取miR-126KD小鼠和WT小鼠脾臟，置于4%的多聚甲醛中固定24 h，然后用石蠟包埋，制成3 μm切片并做HE染色，最后在倒置顯微鏡下觀察脾臟的病理形態(tài)學變化。

1.2.3 流式細胞術(FACS)檢測脾臟細胞的比例變化 將取出的miR-126KD小鼠和WT小鼠脾臟置于冰上放有PBS的平皿中，然后用玻片的糙面輕輕研磨成單細胞懸液，加PBS洗滌，1 200 r/min 10 min，棄掉上清液，將余下細胞彈散，加入適量PBS，經(jīng)篩網(wǎng)過濾后分別加入熒光素標記抗鼠CD4、CD19、CD3單抗，Percp-Cy5.5標記抗鼠CD8、F4/80、CD11c熒光抗體，APC標記抗鼠NK1.1、γδT熒光抗體各1 μl，冰上避光孵育30 min，PBS洗滌2遍，然后利用流式細胞儀進行檢測。

1.2.4 小鼠脾細胞總蛋白提取 制備脾細胞懸液(方法同1.2.1)，1 200 r/min 10 min，棄上清，加入含有蛋白酶抑制(PMSF)和磷酸化蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液裂解30 min，4℃ 12 000 r/min 15 min。取上清，蛋白樣品利用BCA方法定量。加入蛋白上樣緩沖液煮沸10 min，分裝-20℃保存。

1.2.5 Western blot檢測磷酸化Akt和磷酸化NF-κB蛋白的表達變化 取蛋白上樣，經(jīng)SDS-PAGE電泳并PVDF膜轉(zhuǎn)膜，5%BSA封閉2 h，PBST洗膜3次，每次10 min。分別加入1∶500稀釋的Rabbit來源抗鼠的磷酸化Akt和磷酸化NF-κB抗體，4℃孵育過夜。PBST洗膜3次，每次10 min。加入1∶1 000稀釋的Anti-Rabbit IgG HRP-linked孵育1～2 h，增強型ECL發(fā)光試劑法檢測蛋白表達情況。經(jīng)Gel-Pro Analyzer 4.0軟件進行灰度值測定與分析。

2 結(jié)果

2.1miR-126KD小鼠脾臟細胞總數(shù)、miR-126的表達及病理形態(tài)學變化 如圖所示，野生型(Wildtype)小鼠和miR-126KD小鼠脾臟相比，miR-126KD組脾臟的細胞總數(shù)明顯增加(P<0.001，圖1A)，miR-126表達水平明顯降低(P<0.001，圖1B)。HE染色結(jié)果顯示(圖1C)，與WT小鼠相比，miR-126KD小鼠脾臟中淺層皮質(zhì)區(qū)淋巴小結(jié)過度增生，且在副皮質(zhì)區(qū)脾細胞明顯增加(P<0.05)。

2.2miR-126KD小鼠脾臟中γδT細胞、NK細胞、巨噬細胞、DCs細胞比例和細胞總數(shù)變化FACS檢測結(jié)果顯示(圖2A)，miR-126KD小鼠較WT小鼠脾臟中巨噬細胞的比例顯著降低(P<0.05)，NK細胞的比例顯著增加(P<0.05)，而γδT細胞、DCs的比例無統(tǒng)計學差異(P>0.05，圖2B)；同時，NK細胞的細胞總數(shù)顯著增加(P<0.01)，而γδT細胞、NK細胞、巨噬細胞的細胞總數(shù)無統(tǒng)計學差異(P>0.05，圖2C)。

2.3miR-126KD小鼠脾臟中CD19+B細胞、CD3+T細胞比例和絕對數(shù)變化 用FACS檢測CD19+B細胞、CD3+T細胞的比例和細胞總數(shù)的變化，結(jié)果顯示(圖3A)，與WT小鼠相比，miR-126KD小鼠脾臟中CD3+T細胞的比例顯著增加(P<0.05)，而CD19+B+細胞的比例無統(tǒng)計學差異(P<0.05，圖3B)；同時，CD19+B細胞、CD3+T細胞的細胞總數(shù)都顯著增加(P<0.05，圖3C)。

2.4miR-126KD小鼠脾臟中CD4+T細胞、CD8+T細胞比例和絕對數(shù)變化 我們進一步用FACS檢測CD4+T細胞、CD8+T細胞的比例。如圖4A所示，miR-126KD小鼠脾臟中CD4+T細胞比例和絕對數(shù)都顯著增加(P<0.05)，CD8+T細胞比例及絕對數(shù)均無統(tǒng)計學差異(圖4B、C)。

2.5miR-126KD小鼠脾臟中磷酸化NF-κB和磷酸化Akt水平明顯改變 進一步Westernblot結(jié)果顯示(圖5A)，與WT小鼠相比，miR-126KD小鼠脾臟中磷酸化NF-κB和磷酸化Akt表達水平明顯增加(P<0.05,圖5B)。

圖1 miR-126KD小鼠脾臟細胞總數(shù)、miR-126的表達及病理形態(tài)學觀察(HE染色)Fig.1 Change on total cells number,expression of miR-126,and pathologic morphology of spleens in miR-126KD mice(HE staining)Note: A.Total cells number;B.Expression of miR-126;C.The pathologic morphology of spleens in miR-126KD mice *.P<0.001 compared with WT mice.

圖2 miR-126KD 小鼠脾臟γδT細胞、NK細胞、巨噬細胞、DCs細胞比例和絕對數(shù)的變化Fig.2 Change on proportion and cell counts of γδT cells,NK cells,Mφ cells,DCs in spleens in miR-126KD miceNote: Flow cytometry；B.Comparison of percentage；C.Absolute numbers.*.P<0.05,**.P<0.01 compared with WT mice.

圖3 miR-126KD小鼠脾臟中CD19+B細胞和CD3+T細胞比例和絕對數(shù)的變化Fig.3 Change on proportion and cell counts of CD19+B cells and CD3+T cells in spleens in miR-126KD miceNote: A.CD19+B cells and CD3+T cells were measured by Flow cytometry;B.Comparison of percentage;C.Absolute numbers.*.P<0.05 compared with WT mice.

圖4 miR-126KD小鼠脾臟中CD4+T細胞、CD8+T細胞比例和絕對數(shù)變化Fig.4 Change on proportion and cell counts of CD4+T cells and CD8+T cells in spleens in miR-126KD miceNote: A.CD4+T cells and CD8+T cells were measured by Flow cytometry;B.Comparison of percentage;C.Absolute numbers.*.P<0.05 compared with WT mice.

圖5 miR-126KD小鼠脾臟中磷酸化NF-κB和磷酸化Akt的變化Fig.5 Expression of p-Akt and p-NF-κB in spleen of miR-126KD miceNote: A.Western blot；B.Relative expression.*.P<0.05.

3 討論

近年來，隨著區(qū)域免疫(Regionalimmunity)的相關研究得到人們越來越多的關注，機體各免疫器官中相關免疫細胞的組成比例及其維持機制也受到了重視。免疫器官中各免疫細胞亞群組成比例的變化不僅反映了特定區(qū)域的免疫應答狀態(tài)，并且對于相關疾病發(fā)生機制的認識均具有積極意義。新近的研究提示，多種miRNAs分子在機體免疫器官中免疫細胞組成比例的維持和功能發(fā)揮中具有重要調(diào)控作用。如：Kohlhaas等[11]發(fā)現(xiàn)，miR-155敲除后，脾和腸系膜淋巴結(jié)調(diào)節(jié)性T細胞的比例和數(shù)量均顯著下降。在疾病機制發(fā)生中，Henao等[12]發(fā)現(xiàn)miR-146a可通過上調(diào)脾臟中CD4+T淋巴細胞比例，來增強機體清除B型肝炎病毒的能力。類似地，課題組前期研究發(fā)現(xiàn)miRNA-126敲減后可顯著影響腸系膜淋巴結(jié)中T淋巴細胞亞群的比例和數(shù)量，提示其對腸系膜淋巴結(jié)中淋巴細胞的組成維持具有重要的調(diào)控作用[8]。

本研究發(fā)現(xiàn)miR-126KD小鼠脾臟中miR-126的表達水平下調(diào)，這與我們前期結(jié)果一致[10]。重要的是，我們發(fā)現(xiàn)脾臟中細胞總數(shù)明顯增加，且脾臟中淋巴小結(jié)增生，皮質(zhì)區(qū)淋巴細胞活躍，提示miR-126敲減后可顯著影響脾臟中各免疫細胞的組成。進一步的檢測顯示，miR-126KD小鼠脾臟中γδT細胞和DCs細胞的比例和數(shù)量未改變。然而，NKT細胞的比例、細胞總數(shù)均明顯增加，而巨噬細胞的比例下降，這提示miR-126KD敲減可影響脾臟中特定固有免疫細胞的組成。類似的，Muljo等[13]發(fā)現(xiàn)敲除Dicer酶后，小鼠胸腺中miRNA的表達銳減，導致T細胞的發(fā)育受阻，外周CD4+T細胞和CD8+T細胞的比例顯著減少；且還有研究顯示，Dicer酶敲除后還可影響胸腺調(diào)節(jié)性T細胞(RegulatoryTcells，Tregs)、NK、NKT細胞的發(fā)育[14，15]。此外，Bezman等[16]還研究發(fā)現(xiàn)敲除miRNA的Ly49H+NK細胞在巨噬細胞病毒(CMV)感染過程中，盡管其細胞數(shù)量顯著增加，但均在功能成熟前死亡，以致機體不能產(chǎn)生有效免疫應答，提示miRNAs表達改變還會影響特定免疫細胞的功能。對于適應性免疫應答細胞，本研究發(fā)現(xiàn)miR-126KD小鼠脾臟中，不僅CD3+T細胞的比例和細胞數(shù)目明顯增加，且CD4+T細胞的比例及絕對細胞數(shù)均顯著增加；CD19+B細胞比例雖無明顯變化，但CD19+B細胞的細胞總數(shù)卻顯著增加，提示miR-126敲減后可顯著影響到脾臟中T、B細胞的組成變化。類似地，Henao等[17]研究發(fā)現(xiàn)miR-181敲除后小鼠胸腺中T細胞的比例顯著下調(diào)，并且脾臟、肝臟中NKT細胞的絕對數(shù)也顯著降低，且功能明顯發(fā)生異常。此外，課題組前期研究發(fā)現(xiàn)miR-126敲減后可顯著影響腸系膜淋巴結(jié)中T淋巴細胞的組成比例變化，提示其對腸系膜淋巴結(jié)中淋巴細胞的組成和功能具有重要的調(diào)控作用[8]。這些研究表明，特定的miRNAs分子可能對特定區(qū)域免疫器官中免疫細胞的組成或功能具有重要調(diào)控作用。

核因子-κB(Nuclearfactor-κB，NF-κB)和蛋白激酶B(ProteinkinaseB，PKB又稱Akt)分別是Toll和PI3K/Akt信號通路的關鍵分子，同時在機體免疫細胞的組成及比例變化中發(fā)揮重要調(diào)控作用。研究發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)基因小鼠中，通過活化AKT信號通路，導致小鼠體內(nèi)T、B淋巴細胞在免疫和組織器官中的比例和數(shù)量均顯著上調(diào)[18]。類似地，本研究中我們發(fā)現(xiàn)miRNA-126KD小鼠脾臟中磷酸化NF-κB和磷酸化Akt的表達均明顯增加。已有的研究顯示miR-126是Akt和NF-κB信號途徑的重要調(diào)控分子[19,20]。我們前期也發(fā)現(xiàn)miR-126可通過對Akt信號途徑的調(diào)控影響CD4+T細胞亞群CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞的外周誘導[21]。因此，我們推測miR-126可能通過NF-κB和Akt兩條信號途徑的調(diào)節(jié)來影響脾臟中特定免疫細胞亞群的組成及比例變化。然而，其相關具體分子機制還有待后續(xù)進一步研究闡明。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)miR-126敲減后小鼠脾臟中免疫細胞的組成存在變化，這為后續(xù)深入探討miR-126 在機體特定區(qū)域免疫應答中的作用提供了重要的前期實驗依據(jù)。

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[收稿2015-07-15 修回2015-08-03]

(編輯 張曉舟)

Change on composition of immune cells in spleen of miRNA-126 knockdown mice

LEI Liang-Yu,HU Yan,GUO Meng-Meng,LU Jia，ZHENG Wen,XU Hua-Lin,CHEN Chao,XU Lin.Department of Immunology,Zunyi Medical College,Zunyi 563000,China

Objective:To detect the change of composition of immune cells in the spleen of miR-126 knockdown(miR-126KD)mice and preliminarily explore its significance.Methods: The expression level of miR-126 in spleens of miR-126KD mice was deter-mined by Realtime PCR.And the total number of splenocytes was calculated.The pathologic morphology change of the spleen was observed by HE staining.And the changes on proportion of DCs,macrophages cells ，γδ T cells and NK T cells,CD3+T cells and its subgroup ,as well as CD19+B cells in spleens of miR-126KD mice were analyzed by Flow cytometry and calculated respectively.The level of phosphorylated AKt and NF-κB was analyzed by Western blot assay.Results: Compared with those of WT mice,the expression level of miR-126 decreased obviously(P<0.05)and the total number of cells increased obviously in spleen of miR-126KD mice(P<0.05).Moreover,the pathologic morphology of miR-126KD mice was significantly changed.The proportion and number of NK T cells in the inherent cells were significantly increased(P<0.05),but the proportion of Mφ cells were significantly decreased(P<0.05).Meanwhile,the proportion and number of CD3+T cells and CD4+T cells in the adaptive immune cells were significantly increased(P<0.05),while the total number of CD19+B cells were significantly decreased(P<0.05).Last,the level of phosphorylation Akt and NF-κB increased obviously in spleen of miRNA-126 knockdown mice.Conclusion: Change obviously on the composition of immune cells subsets in the spleen of miRNA-126 knockdown mice,which it may be related to the altered level of phosphorylated AKt and NF-κB and provides a preliminary experimental basis for the further exploring the roles of miR-126 in immune response.

miR-126;Knockdown;Immune cells;Composition

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.04.002

①本文受國家自然科學基金(No. 31370918)和教育部新世紀優(yōu)秀人才計劃(NCET-12-0661)資助。

雷良玉(1989年-)，女，在讀碩士，主要從事腫瘤方面研究，E-mail：llymay@126.com。

及指導教師：徐 林(1977年-)，男，博士，教授，主要從事腫瘤免疫學和分子免疫學研究，E-mail：xulinzhouya@163.com。

R392

A

1000-484X(2016)04-0460-05