林雀躍　張榮林　羅軼　張慧

【摘 要】 目的：建立藿香正氣合劑的HPLC指紋圖譜。方法：樣品直接進(jìn)樣，以橙皮苷為參照峰，通過(guò)紫外檢測(cè)器（波長(zhǎng)280nm）對(duì)藿香正氣合劑進(jìn)行HPLC指紋圖譜分析。結(jié)果：對(duì)20批藿香正氣合劑供試品進(jìn)行檢測(cè)，建立了該藥品的HPLC指紋圖譜并標(biāo)示了15個(gè)共有指紋峰。各共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD均在100%以內(nèi)。結(jié)論：該方法準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好，為藿香正氣合劑的進(jìn)一步質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)化研究和控制提供依據(jù)。

【關(guān)鍵詞】 藿香正氣合劑；指紋圖譜；HPLC

【中圖分類號(hào)】R284 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A 【文章編號(hào)】1007-8517（2016）20-0043-05

藿香正氣合劑由廣藿香、紫蘇葉、白芷、白術(shù)、陳皮、茯苓、桔梗、甘草、大腹皮、姜厚樸、姜半夏等13味藥材組成，具有解表化濕、理氣和中的功效，臨床用于脾胃虛寒而外感風(fēng)寒、胸膈悶滿。收載于《中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑》第7冊(cè)中，原標(biāo)準(zhǔn)沒有含量測(cè)定項(xiàng)[1]。為更好的控制該藥品的質(zhì)量，張志平等[2]采用薄層掃描法測(cè)定了藿香正氣合劑中百秋李醇的含量；也有企業(yè)用高效液相色譜法測(cè)定橙皮苷含量作為其質(zhì)控指標(biāo)，但關(guān)于藿香正氣合劑指紋圖譜方面的研究未見報(bào)道。中藥指紋圖譜是一種實(shí)現(xiàn)對(duì)中藥多組分，多指標(biāo)分析的有效方法，該技術(shù)具有整體性、特征性、模糊性和穩(wěn)定性的特征，可從整體上把握中藥的質(zhì)量[3]。從藿香正氣類制劑指紋圖譜研究的進(jìn)展看[4-7]，藿香正氣水的指紋圖譜研究較多，但藿香正氣水以揮發(fā)油類成分為主，而藿香正氣合劑則以水溶性成分為主，因此其指紋圖譜的研究思路和方法與藿香正氣水截然不同。研究通過(guò)實(shí)驗(yàn)摸索，采用樣品直接進(jìn)樣的方法對(duì)藿香正氣合劑進(jìn)行HPLC指紋圖譜分析，并在方法學(xué)考察的基礎(chǔ)上，建立了藿香正氣合劑的指紋圖譜，同時(shí)，以保留時(shí)間為指標(biāo)，通過(guò)對(duì)比藿香正氣合劑、藥材樣品提取液及缺某味藥材陰性樣品HPLC指紋圖譜，對(duì)15個(gè)共有峰進(jìn)行歸屬指認(rèn)。該法具有操作簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好等特點(diǎn)，為其質(zhì)量控制提供了依據(jù)。

1 儀器與試劑

11 儀器 Agilent1200型液相色譜儀（真空脫氣裝置、四元泵、自動(dòng)進(jìn)樣器和DAD檢測(cè)器、UWD紫外檢測(cè)器）；MILLI-PROA純水處理器。

12 試劑 橙皮苷（批號(hào)：110721-201115，中國(guó)食品藥品檢定研究院）；藿香正氣合劑20批（無(wú)糖型10批的批號(hào)：131215、131216、131217、131220、131221、131222、131224、131225、131226、131227，樣品序號(hào)為S1～S10；有糖型10批，樣品序號(hào)為S11～S20）、藿香正氣合劑陰性樣品13批（缺廣藿香陰性、缺紫蘇葉陰性、缺白芷陰性、缺白術(shù)陰性、缺陳皮陰性、缺茯苓陰性、缺桔梗陰性、缺甘草陰性、缺大腹皮陰性、缺厚樸陰性、缺半夏陰性、缺生姜陰性、缺大棗陰性）均由廣西邦琪藥業(yè)集團(tuán)有限公司提供；單味藥材提取液13批（廣藿香提取液、紫蘇葉提取液、白芷提取液、白術(shù)提取液、陳皮提取液、茯苓提取液、桔梗提取液、甘草提取液、大腹皮提取液、厚樸提取液、半夏提取液、生姜提取液、大棗提取液）按藿香正氣合劑制法單獨(dú)提取。乙腈為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純。

2 方法

21 色譜條件 色譜柱：CAPCELLPAK MGⅡ C18（46mm×250mm，5μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-01%磷酸溶液（B）梯度洗脫程序（見表1）；流速：10mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：280nm；柱溫：35℃；進(jìn)樣量：10μL。理論板數(shù)按橙皮苷峰計(jì)算應(yīng)不低于5000。

22 供試品溶液的制備 取樣品溶液過(guò)045μm微孔濾膜，即得。

23 測(cè)定方法 精密吸取供試品溶液10μL，注入液相色譜儀，測(cè)定并記錄液相色譜圖，分析該色譜圖60min內(nèi)的色譜峰信息，20批樣品均出現(xiàn)15個(gè)明顯的液相色譜峰，將其確定為共有峰，計(jì)算各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。

24 精密度實(shí)驗(yàn) 取藿香正氣合劑，連續(xù)測(cè)定6次，以橙皮苷峰作為參照峰（S峰），考察各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間（Tr=Ti/Ts）、相對(duì)峰面積（Ar=Ai/As）的一致性。結(jié)果表明：各共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD為004%～039%；相對(duì)峰面積RSD為056%～228%。

25 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取藿香正氣合劑，分別在0、8、16、24、32、40h檢測(cè)，結(jié)果在40h內(nèi)，各共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD為007%～113%，相對(duì)峰面積RSD為038%～228%，表明樣品溶液打開包裝后在40h內(nèi)測(cè)定穩(wěn)定。

26 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取藿香正氣合劑6份，按“21”項(xiàng)實(shí)驗(yàn)條件分析，結(jié)果6份樣品各共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD為002%～017%，相對(duì)峰面積的RSD為047%～200%。表明方法的重復(fù)性很好。

27 耐用性實(shí)驗(yàn) 考察3個(gè)品牌色譜柱[CAPCELLPAK MGⅡC18、Kromasil 100-5 C18、Inertsil ODS-3 C18（46mm×250mm，5μm）]，結(jié)果藿香正氣合劑各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD為057%～561%，相對(duì)峰面積的RSD為023%～572%。表明采用相同儀器不同色譜柱，對(duì)少數(shù)共有峰的出峰時(shí)間及峰面積有影響，但影響不大。

3 結(jié)果與討論

31 HPLC指紋圖譜的確立及共有峰歸屬 在“21”項(xiàng)的實(shí)驗(yàn)條件下，對(duì)20批藿香正氣合劑進(jìn)行分析，確定了15個(gè)共有峰（見圖1），建立了藿香正氣合劑HPLC指紋圖譜。以橙皮苷峰為參照峰，其保留時(shí)間和峰面積分別定為100，計(jì)算各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積（見表2、表3）。從數(shù)據(jù)上可以看出：不同批次樣品同一色譜共有峰的相對(duì)面積存在差異，這可能與各單味藥材的來(lái)源、采集時(shí)間和制藥工藝的穩(wěn)定性有關(guān)。

對(duì)15個(gè)共有峰進(jìn)行歸屬分析可知：峰1由白芷、白術(shù)、陳皮等9味藥材貢獻(xiàn)；峰2由廣藿香、紫蘇葉、厚樸等3味藥材貢獻(xiàn)；峰3由陳皮、大腹皮、厚樸等3味藥材貢獻(xiàn)；峰4由白芷、白術(shù)、甘草、厚樸等4味藥材貢獻(xiàn)；峰5由廣藿香、紫蘇葉、白芷、甘草、厚樸等5味藥材貢獻(xiàn)；峰6由陳皮、厚樸2味藥材貢獻(xiàn)；峰7由廣藿香、甘草、厚樸、陳皮、紫蘇葉等5味藥材貢獻(xiàn)；峰8由紫蘇葉、厚樸2味藥材貢獻(xiàn)；峰9、峰10同由紫蘇葉、甘草2味藥材貢獻(xiàn)；峰11為陳皮藥材特征峰；峰12為厚樸藥材特征峰；峰13為橙皮苷峰；峰14為廣藿香藥材特征峰；峰15為甘草藥材特征峰。

32 實(shí)驗(yàn)條件的選擇 在DAD檢測(cè)器中查看全波長(zhǎng)色譜圖，發(fā)現(xiàn)樣品于280nm波長(zhǎng)下得到的色譜峰數(shù)量較多且峰面積較大，因此確定280nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。對(duì)比了Ⅰ：乙腈-水、Ⅱ：甲醇-01%磷酸、Ⅲ：乙腈-01%磷酸3個(gè)流動(dòng)相系統(tǒng)，結(jié)果顯示系統(tǒng)Ⅲ的峰對(duì)稱性較好、分析時(shí)間較短。藿香正氣合劑以水溶性成分為主，極性較大，故考察了Ⅰ：原液直接進(jìn)樣、Ⅱ：D101型大孔樹脂柱富集凈化、Ⅲ：聚酰胺柱富集凈化3種制備方法。結(jié)果表明采用D101型大孔樹脂柱及聚酰胺柱對(duì)本品進(jìn)行富集純化效果不顯著，最終確定用藿香正氣合劑樣品直接進(jìn)樣。

33 藿香正氣合劑質(zhì)量分析 以橙皮苷為參照峰，分析20批藿香正氣合劑15個(gè)共有峰的相對(duì)峰面積發(fā)現(xiàn)其中存在差異（見表3），反映出各批次樣品化學(xué)成分的含量亦有差異。因此，將相對(duì)峰面積數(shù)據(jù)作為評(píng)價(jià)藿香正氣合劑質(zhì)量的特征指標(biāo)。采用特征指標(biāo)含量均值偏移度法[8]評(píng)價(jià)其質(zhì)量。特征指標(biāo)含量均值偏移度是指樣品i各項(xiàng)特征指標(biāo)與指標(biāo)均值的偏移度，以Fi表示：Fi=1m∑mj-1Xij-XjXj，Xij：第i個(gè)樣品第j項(xiàng)指標(biāo)值，Xj：所有樣品第j項(xiàng)指標(biāo)值的均值。由此可見：Fi越小，樣品各指標(biāo)與其均值之間的差異性越小，說(shuō)明i樣品的質(zhì)量越好。20批藿香正氣合劑Fi值排序?yàn)椋篠6>S18>S9>S10>S8>S19>S7>S17>S15>S4>S2>S11>S16>S5>S20>S12>S14>S3>S13>S1。對(duì)得到的Fi值進(jìn)一步用t檢驗(yàn)法評(píng)價(jià)其質(zhì)量差異顯著性，由t（19）005=20可知：S6、S8、S9、S10、S18五批質(zhì)量存在顯著差異。實(shí)際生產(chǎn)中可通過(guò)監(jiān)測(cè)每批藿香正氣合劑的指紋圖譜，并通過(guò)比較各批次的Fi值來(lái)篩選出質(zhì)量顯著差異的樣品進(jìn)行剔除，從而保證各批次產(chǎn)品間質(zhì)量的穩(wěn)定性。

對(duì)15個(gè)共有峰的Fi值進(jìn)行排序，可知峰15>峰3>峰8>峰5>峰6>峰2>峰1>峰4>峰12>峰7>峰14>峰9>峰10>峰11>峰13。峰13、11變化差異最小，兩峰均為陳皮的特征峰，表明陳皮藥材的質(zhì)量較穩(wěn)定，且藿香正氣合劑制備工藝對(duì)陳皮藥材成分的提取影響較小，也驗(yàn)證了選用陳皮特征峰（橙皮苷）為參照峰評(píng)價(jià)藿香正氣合劑質(zhì)量是合理的。峰15的變化差異最大，其次為峰3、8、5、6、2。其中峰15為甘草特征峰，后五個(gè)峰均由厚樸參與貢獻(xiàn)，表明，甘草及厚樸藥材對(duì)藿香正氣合劑質(zhì)量的影響最大，這與每批投料的甘草、厚樸藥材質(zhì)量良莠不齊有關(guān)，因此，把好該兩味藥材進(jìn)廠的質(zhì)量關(guān)是關(guān)鍵。14號(hào)峰為君藥廣藿香的特征峰，各批次相對(duì)峰面積值較為穩(wěn)定，可通過(guò)監(jiān)控多批藿香正氣合劑的14號(hào)峰相對(duì)峰面積值來(lái)確定一個(gè)數(shù)值范圍作為其質(zhì)控指標(biāo)。

4 結(jié)論

從20批藿香正氣合劑HPLC指紋圖譜分析結(jié)果來(lái)看，無(wú)糖型及有糖型樣品HPLC指紋圖譜相似度高，表明蔗糖輔料的使用對(duì)該藥品的化學(xué)成分無(wú)顯著影響；采用樣品直接進(jìn)樣分析的方法最大程度的保留了該藥品中化學(xué)成分的種類，節(jié)省了樣品提取的時(shí)間，操作簡(jiǎn)單；參與藿香正氣合劑HPLC指紋圖譜共有峰貢獻(xiàn)排名前五的藥材依次為厚樸、甘草、紫蘇葉、陳皮及廣藿香，表明這五味藥材的質(zhì)量直接影響該制劑的質(zhì)量，可通過(guò)測(cè)定五味藥材HPLC指紋圖譜，篩選出質(zhì)量穩(wěn)定的優(yōu)質(zhì)藥材進(jìn)行投料，進(jìn)而達(dá)到控制藿香正氣合劑質(zhì)量的目的。研究表明，藿香正氣合劑HPLC指紋圖譜能有效控制該制劑質(zhì)量。

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（編輯：陶希睿）