尚朝施楊李文娟周子睿施志儀

（1. 上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院 農(nóng)業(yè)部淡水水產(chǎn)種質(zhì)資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 201306；2. 上海市食品研究所，上海 200235）

不同Ca2+濃度養(yǎng)殖環(huán)境下三角帆蚌外套膜和內(nèi)臟團(tuán)組織鈣調(diào)蛋白基因的表達(dá)

尚朝1施楊2李文娟1周子睿1施志儀1

（1. 上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院 農(nóng)業(yè)部淡水水產(chǎn)種質(zhì)資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 201306；2. 上海市食品研究所，上海 200235）

為了探索鈣調(diào)蛋白基因（CaM）在淡水貝類珍珠形成中的作用，研究0、0.5、1.25、2和3 mmol/L 5個(gè)不同Ca2+濃度水環(huán)境下養(yǎng)殖三角帆蚌，并在插核后的0、20、50、90和120 d對(duì)外套膜和內(nèi)臟團(tuán)組織采樣，采用熒光定量方法檢測(cè)組織CaM表達(dá)量。結(jié)果表明：（1）在不同Ca2+濃度中，CaM基因外套膜和內(nèi)臟團(tuán)組織在0 mmol/L Ca2+濃度下始終處于過(guò)低表達(dá)水平；0.5 mmol/L濃度下先降低后升高并維持穩(wěn)定；1.25 mmol/L濃度下在20 d內(nèi)臟團(tuán)出現(xiàn)降低，之后升高至0 d水平并保持穩(wěn)定；在2 mmol/L濃度下表達(dá)量在20 d時(shí)顯著上升達(dá)到各濃度中最高后保持高表達(dá)量狀態(tài)；3 mmol/L濃度下在插核后20 d表達(dá)量升高，之后時(shí)期表達(dá)量開始不斷降低（P＜0.05）。（2）在插核后不同天數(shù)中，0 d各濃度表達(dá)差異不明顯；之后各天數(shù)的表達(dá)出現(xiàn)明顯差異。（3）相同條件養(yǎng)殖下，內(nèi)臟團(tuán)CaM基因表達(dá)量高于外套膜。研究發(fā)現(xiàn)，0.5 mmol/L和2 mmol/L Ca2+濃度會(huì)促進(jìn)CaM基因的表達(dá)，但0 mmol/L和3 mmol/L的濃度則會(huì)抑制CaM基因的表達(dá)。內(nèi)臟團(tuán)部位更有利于珍珠的形成。

三角帆蚌；鈣調(diào)蛋白；鈣濃度；內(nèi)臟團(tuán)；外套膜

鈣調(diào)蛋白（Calmodulin protein，CaM）是生物體中的多功能調(diào)節(jié)蛋白，廣泛存在于所有的真核細(xì)胞中，是生物體最豐富的Ca2+結(jié)合蛋白，參與調(diào)節(jié)離子轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞鈣代謝、防御反應(yīng)等重要的生理過(guò)程［1］。珍珠由CaCO3和基質(zhì)蛋白等有機(jī)質(zhì)組成，其中絕大多數(shù)成分為CaCO3。珍珠的形成是貝類Ca2+吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)、貯存和分泌等代謝活動(dòng)的過(guò)程［2，3］，受到CaM等多個(gè)調(diào)節(jié)因子調(diào)控［4，5］。CaM被廣泛認(rèn)為是涉及到珍珠形成的關(guān)鍵蛋白。在合浦珠母貝（Pinctada fucata）中，CaM可以通過(guò)和16 kD珍珠層基質(zhì)蛋白的結(jié)合誘導(dǎo)CaM文石晶體的成核，又可以調(diào)節(jié)棱柱層方解石晶體的的生長(zhǎng)，參與貝殼損傷的修復(fù)［6，7］。

三角帆蚌（Hyriopsis cumingii）作為我國(guó)重要的淡水育珠蚌，具有生長(zhǎng)速度快，育珠質(zhì)量好的特點(diǎn)［8］。研究表明，三角帆蚌的外套膜和內(nèi)臟團(tuán)均可作為插核手術(shù)部位進(jìn)行珍珠培育［9］。兩個(gè)部位各具優(yōu)勢(shì)，外套膜培育出的珍珠光澤度和圓潤(rùn)度好，而內(nèi)臟團(tuán)分布空間大，更適宜培育大顆粒的珍珠［10］。但是，珍珠形成過(guò)程中重要的鈣代謝相關(guān)基因在育珠部位的表達(dá)差異鮮有報(bào)道。有研究表明，在淡水貝類中，適當(dāng)增加鈣的供應(yīng)能夠提高貝類CaCO3的沉積［11］，然而其調(diào)節(jié)機(jī)制仍不清楚。本研究對(duì)三角帆蚌外套膜和內(nèi)臟團(tuán)部位分別進(jìn)行插核手術(shù)后，飼養(yǎng)于不同鈣離子濃度水環(huán)境下，在不同養(yǎng)殖時(shí)期進(jìn)行采樣，探究CaM基因在不同插核部位及不同鈣離子濃度下的表達(dá)變化，旨在探索CaM在淡水貝類珍珠形成中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

三角帆蚌取自上海海洋大學(xué)濱海養(yǎng)殖基地，選取體長(zhǎng)均一，個(gè)體差異較小的2齡三角帆蚌75只。在實(shí)驗(yàn)室中暫養(yǎng)兩周后，對(duì)三角帆蚌外套膜和內(nèi)臟團(tuán)部位進(jìn)行插核手術(shù)。

插核手術(shù)使用的珠核經(jīng)貝殼打磨而成，手術(shù)之前將珠核進(jìn)行高壓滅菌干燥。清洗實(shí)驗(yàn)蚌外殼泥土和藻類，插核前將其離水放置30-60 min，減弱實(shí)驗(yàn)蚌的活力，降低應(yīng)激反應(yīng)。手術(shù)器械經(jīng)75%酒精消毒后，將蚌置于手術(shù)架上，腹緣朝上。在蚌的偏后端腹緣部位，用開殼器將蚌開口，并用U型架支撐。在每只實(shí)驗(yàn)蚌的外套膜和內(nèi)臟團(tuán)靠近性腺前端部位分別插入直徑為2.5 mm的珠核，并將制作好的外套膜小片貼在珠核上。取下U型架，插核手術(shù)完成。

將插核后的75只實(shí)驗(yàn)組三角帆蚌隨機(jī)分成5組，每組15只。本校公共實(shí)驗(yàn)樓取的去離子水作為水源，使用CaCl2·2H2O作為外源鈣源，采用EDTA滴定法分別將5個(gè)水缸中的Ca2+濃度調(diào)節(jié)至0、0.5、1.25、2和3 mmol/L，其余實(shí)驗(yàn)條件相同。將5組三角帆蚌養(yǎng)于5個(gè)不同濃度的水缸中。每周定期用豆?jié){進(jìn)行投喂，定期調(diào)節(jié)水缸中Ca2+濃度。

三角帆蚌插核后養(yǎng)殖5 h，從每個(gè)濃度中取出3只三角帆蚌，對(duì)其進(jìn)行外套膜和內(nèi)臟團(tuán)插核部位采樣，作為插核后0 d樣品組織。之后在插核后第20、50、90和120天分別取出3只三角帆蚌進(jìn)行外套膜和內(nèi)臟團(tuán)采樣。采樣前將實(shí)驗(yàn)所需器材進(jìn)行滅菌除酶。首先切斷其閉殼肌，快速取出三角帆蚌插核位點(diǎn)處的外套膜和內(nèi)臟團(tuán)組織置于裝有Trizol（Invitrogen，美國(guó)）的除酶離心管中，供后續(xù)繼續(xù)進(jìn)行總RNA提取實(shí)驗(yàn)。

1.2 方法

1.2.1 RNA提取、檢測(cè)與反轉(zhuǎn) 將Trizol（Invitrogen，美國(guó)）中的各個(gè)時(shí)期不同Ca2+濃度的外套膜和內(nèi)臟團(tuán)組織，按照試劑說(shuō)明書的方法進(jìn)行總RNA提取。提取完畢后，用Nanodrop 2000C（Thermo Fisher Scientific，美國(guó)）分光光度儀檢測(cè)其純度和濃度，用 1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其完整性。

按照M-MLV Reverse Transcriptase（Promega，北京）的操作要求進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)，反轉(zhuǎn)錄成cDNA。

1.2.2 基因mRNA水平測(cè)定 根據(jù)NCBI上公布的三角帆蚌β-actin基因（HM045420）序列設(shè)計(jì)定量引物：β-actin F（TCAACCCTAAAGCCAACA）β-actin R（TCTCTACCTGCCAAGTCAA）。CaM基因（HM-483521.1）定量引物：CaM F（TTCAAGGAGGCATTCAGC）和CaM R（TTACCATCGGCATCCACT）。

熒光定量采用CFX96 TouchTMReal-Time PCR Detection System（Bio-Rad，美國(guó)）平臺(tái)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。首先進(jìn)行目的基因和內(nèi)參基因（β-actin）的標(biāo)準(zhǔn)曲線實(shí)驗(yàn)，然后進(jìn)行目的基因的定量實(shí)驗(yàn)。反應(yīng)

體系為20 μL，包括10 μL 的 2×iQTMSYBR Green Supermix（Bio-Rad，美國(guó)）、1.0 μL cDNA、上下游引物各0.5 μL和8.0 μL dH2O。反應(yīng)條件為 95℃預(yù)變性 1 min；95℃ 10 s，60℃ 15 s和72℃ 20 s，采集熒光40次，72℃ 7 min，反應(yīng)終止，添加溶解曲線生成程序：95℃ 到 60℃ 每降 0.5℃（5 s）采集一次熒光。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，用溶解曲線分析產(chǎn)物專一性，結(jié)果用2-ΔΔCt法進(jìn)行初步數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果中R值均大于0.9，相應(yīng)的擴(kuò)增效率（E）均在 95%-100%之間。

然后數(shù)據(jù)采用 SPSS 16.0軟件中的One-Way 方差分析（ANOVA），使用Dunnett's T multiple comparisons 進(jìn)行相對(duì)表達(dá)分析，P＜0.05 表示存在顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 不同Ca2+濃度養(yǎng)殖下外套膜和內(nèi)臟團(tuán)組織CaM基因的表達(dá)

觀察插核后0、20、50、90和120 d在不同Ca2+濃度養(yǎng)殖下CaM基因表達(dá)的變化，結(jié)果如圖1、圖2和圖3所示。

由圖1可以看出，插核0 d在外套膜中CaM基因表達(dá)量沒(méi)有顯著差異，內(nèi)臟團(tuán)中CaM基因表達(dá)量也沒(méi)有顯著差異（P＞0.05）。而內(nèi)臟團(tuán)表達(dá)量明顯高于外套膜表達(dá)量（P＜0.05）。插核后20 d，各濃度培養(yǎng)下的表達(dá)量差異明顯。0 mmol/L Ca2+濃度在外套膜和內(nèi)臟團(tuán)中CaM基因表達(dá)量明顯低于其他濃度（P＜0.05）。外套膜中，0.5 mmol/L Ca2+濃度與0 mmol/L濃度情況下表達(dá)量無(wú)顯著差異（P＞0.05）；濃度升高后，在1.25 mmol/L Ca2+濃度時(shí)表達(dá)量明顯高于0.5 mmol/L；2 mmol/L、3 mmol/L Ca2+濃度時(shí)表達(dá)量都高于1.25 mmol/L（P＜0.05），但2 mmol/L和3 mmol/L并無(wú)差異（P＞0.05）。內(nèi)臟團(tuán)中，0.5 mmol/L Ca2+濃度相比0 mmol/L表達(dá)量已經(jīng)表現(xiàn)出顯著升高；2 mmol/L Ca2+濃度時(shí)CaM基因表達(dá)量高于1.25 mmol/L濃度；而3 mmol/L Ca2+濃度表達(dá)量較2 mmol/L出現(xiàn)明顯下降的情況（P＜0.05）。

圖1 插核后0 d（A圖）、20 d（B圖）不同Ca2+濃度對(duì)三角帆蚌外套膜和內(nèi)臟團(tuán)中CaM基因表達(dá)的影響

圖2中，在插核后50 d，0 mmol/L Ca2+濃度時(shí)相較其他濃度CaM基因表達(dá)量明顯最低；而2 mmol/L Ca2+濃度時(shí)相較其他濃度CaM基因表達(dá)量明顯最高（P＜0.05）。在外套膜中，0.5 mmol/L、1.25 mmol/L和3 mmol/L Ca2+濃度表達(dá)量互相之間沒(méi)有明顯變化（P＞0.05）。而內(nèi)臟團(tuán)中，0.5 mmol/L和3 mmol/L Ca2+濃度時(shí)表達(dá)明顯相差不大，但是明顯低于1.25 mmol/L時(shí)的表達(dá)量（P＜0.05）。插核后90 d，在外套膜中表達(dá)趨勢(shì)和插核后50 d相似。在內(nèi)臟團(tuán)中，0.5 mmol/L Ca2+濃度明顯高于0 mmol/L、1.25 mmol/L和3 mmol/L時(shí)的表達(dá)量；而2 mmol/L時(shí)表達(dá)量還是明顯高于其他濃度表達(dá)量（P＜0.05）。

圖2 插核后50 d（A）、90 d（B）不同Ca2+濃度對(duì)三角帆蚌外套膜和內(nèi)臟團(tuán)中CaM基因表達(dá)的影響

在圖3中，插核后120 d在外套膜和內(nèi)臟團(tuán)中，0 mmol/L和3 mmol/L Ca2+濃度較1.25 mmol/L CaM基因顯著降低；而2 mmol/L Ca2+濃度表達(dá)量較1.25 mmol/L時(shí)表達(dá)量顯著升高（P＜0.05）。在外套膜中，0.5 mmol/L Ca2+濃度表達(dá)量明顯升高（P＜0.05），而內(nèi)臟團(tuán)中，0.5 mmol/L Ca2+濃度時(shí)表達(dá)沒(méi)有顯著變化（P＞0.05）。

圖3 插核后120 d不同Ca2+濃度對(duì)三角帆蚌外套膜和內(nèi)臟團(tuán)中CaM基因表達(dá)的影響

2.2 不同插核天數(shù)外套膜和內(nèi)臟團(tuán)組織CaM基因的表達(dá)

分析三角帆蚌0、0.5、1.25、2和3 mmol/L Ca2+濃度下培養(yǎng)下，每個(gè)濃度中不同插核后天數(shù)的CaM基因表達(dá)變化，結(jié)果如圖4、圖5和圖6所示。

圖4 0 mmol/L Ca2+濃度（A）、0.5 mmol/L Ca2+濃度（B）在不同插核天數(shù)后三角帆蚌外套膜和內(nèi)臟團(tuán)中CaM基因表達(dá)

如圖4所示，在0 mmol/L Ca2+濃度下培養(yǎng)，外套膜和內(nèi)臟團(tuán)中CaM基因表達(dá)量在插核后20 d出現(xiàn)顯著降低，50 d時(shí)相較于20 d表達(dá)量明顯升高，但仍低于0 d時(shí)表達(dá)量（P＜0.05）；90 d時(shí)相比于50 d有顯著降低，120 d時(shí)繼續(xù)降低，出現(xiàn)最低表達(dá)量。在0.5 mmol/L Ca2+濃度下培養(yǎng)，外套膜中CaM基因表達(dá)量在插核后20 d出現(xiàn)顯著降低，50 d時(shí)相較于20 d表達(dá)量明顯升高，但仍低于0 d時(shí)期表達(dá)量，在之后時(shí)間繼續(xù)升高，90 d時(shí)明顯高于0 d表達(dá)量（P＜0.05），120 d時(shí)相比90 d無(wú)顯著變化（P＞0.05）。在內(nèi)臟團(tuán)中，CaM基因表達(dá)量在插核后20 d時(shí)并無(wú)顯著變化（P＞0.05），在第50 d時(shí)相比之前時(shí)期顯著降低，在插核后90 d較0 d時(shí)期顯著升高（P＜0.05），

120 d時(shí)與90 d表達(dá)量無(wú)顯著差異（P＞0.05）。

圖5 1.25 mmol/L Ca2+濃度（A）、2 mmol/L Ca2+濃度（B）在不同插核天數(shù)后三角帆蚌外套膜和內(nèi)臟團(tuán)中CaM基因表達(dá)

圖6 3 mmol/L Ca2+濃度在不同插核天數(shù)后三角帆蚌外套膜和內(nèi)臟團(tuán)中CaM基因表達(dá)

從圖5中可以看出，在1.25 mmol/L Ca2+濃度下培養(yǎng)，外套膜中CaM基因表達(dá)量在各時(shí)期無(wú)顯著變化（P＞0.05）。內(nèi)臟團(tuán)在插核后20 d表達(dá)量出現(xiàn)降低情況（P＜0.05），之后時(shí)期又上升至與0 d無(wú)顯著差異（P＞0.05）。在2 mmol/L Ca2+濃度下培養(yǎng)，外套膜和內(nèi)臟團(tuán)都在插核后20 d時(shí)CaM基因表達(dá)量顯著增加（P＜0.05），之后各時(shí)期保持高表達(dá)量并且無(wú)顯著差異（P＞0.05）。

根據(jù)圖6可以看出，在外套膜中CaM基因表達(dá)量在插核后20 d顯著增高；在50 d時(shí)表達(dá)量下降到與0 d無(wú)顯著差異；插核后90 d，繼續(xù)下降，較50 d顯著降低（P＜0.05）；120 d與90 d無(wú)顯著變化（P＞0.05）。在內(nèi)臟團(tuán)中CaM基因表達(dá)量在插核后20 d出現(xiàn)明顯升高，之后時(shí)間內(nèi)表達(dá)量不斷下降，50 d比20 d顯著降低，90 d比50 d顯著降低（P＜0.05），直到插核120 d時(shí)，表達(dá)量與90 d無(wú)顯著差異（P＞0.05）。

3 討論

Ca2+作為第二信使參與動(dòng)物的各種生理活動(dòng)，不同濃度Ca2+對(duì)淡水貝類的生長(zhǎng)率、繁殖能力、珍珠沉積率都有影響，密切關(guān)系著貝類的生理狀態(tài)［12］。貝類體內(nèi)Ca2+的一系列生理活動(dòng)，如吸收、貯存、轉(zhuǎn)運(yùn)、分泌等都受到機(jī)體復(fù)雜并嚴(yán)格的調(diào)控，參與調(diào)控的蛋白眾多并發(fā)揮著不同的作用［13］。

分析GenBank中已有的三角帆蚌CaM基因的全長(zhǎng)序列（HM483521）［14］可以得到，CaM基因中含有的4個(gè)EF-hand結(jié)構(gòu)域。EF-hand結(jié)構(gòu)域是常見(jiàn)的Ca2+結(jié)合結(jié)構(gòu)域高度保守，在生物礦化過(guò)程，如Ca的運(yùn)輸、肌肉收縮、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等過(guò)程中起著重要的作用［15，16］。貝類的EFhand蛋白能通過(guò)調(diào)控Ca代謝，從而調(diào)節(jié)珍珠質(zhì)的形成，是CaCO3晶體形成珍珠質(zhì)的有機(jī)成分之一［17］。有研究表明該基因可能是珍珠形成過(guò)程中一個(gè)重要的調(diào)節(jié)因子［18］，貝類的EFhand蛋白也具有與脊椎動(dòng)物EF-hand蛋白類似的功能［19］。

3.1 不同Ca2+濃度養(yǎng)殖下外套膜和內(nèi)臟團(tuán)組織CaM基因的表達(dá)

有研究表明，三角帆蚌育珠過(guò)程中，Ca2+的代謝具有明顯的變化波動(dòng)［20］。0 mmol/L Ca2+濃度各個(gè)時(shí)期表達(dá)量較其他Ca2+濃度都表現(xiàn)出顯著降低，CaM基因在0 mmol/L Ca2+濃度下，外套膜和內(nèi)臟團(tuán)

由于Ca2+缺乏嚴(yán)重而都表現(xiàn)出顯著下降趨勢(shì)，之后時(shí)期因?yàn)殁}代謝無(wú)法正常進(jìn)行而保持著極低的表達(dá)量［21］。2 mmol/L Ca2+濃度各個(gè)時(shí)期表達(dá)量較其他Ca2+濃度都表現(xiàn)出顯著升高，在Ca2+含量適當(dāng)高于自然淡水水體（1.0 mmol/L-1.3 mmol/L）的情況下，Ca2+起到了促進(jìn)了的作用［22，23］，此時(shí)CaM基因表達(dá)量最高。3 mmol/L Ca2+濃度時(shí)相較于2 mmol/L Ca2+濃度CaM基因表達(dá)量明顯降低，這說(shuō)明CaM基因表達(dá)量不會(huì)隨著Ca2+濃度不斷升高而一直升高，Ca2+濃度超過(guò)一定程度不僅不會(huì)增加表達(dá)量，反而會(huì)降低。由此可以看出，Ca2+濃度影響著CaM基因的表達(dá)。

圖1中，由于插核后在不同Ca2+濃度下養(yǎng)殖5 h就對(duì)其采樣，以作為0 d樣品與其他時(shí)期比較。此時(shí)，CaM基因受Ca2+濃度影響較小，所以表達(dá)量幾乎無(wú)差異。0.5 mmol/L Ca2+濃度在低于1.25 mmol/L Ca2+濃度情況下，CaM基因表達(dá)量依然出明顯增加，推測(cè)CaM基因需要更多表達(dá)來(lái)促進(jìn)較低Ca2+濃度下Ca的吸收。

3.2 不同插核天數(shù)外套膜和內(nèi)臟團(tuán)組織CaM基因的表達(dá)

由圖4可以看出，0 mmol/L Ca2+濃度養(yǎng)殖下，整體呈明顯下降趨勢(shì)。在0.5 mmol/L Ca2+濃度培養(yǎng)下，外套膜和內(nèi)臟團(tuán)都出現(xiàn)了CaM基因表達(dá)量先降低再顯著升高的趨勢(shì)，在插核后90 d和120 d表達(dá)水平明顯高于0 d時(shí)期。0.5 mmol/L Ca2+濃度低于正常淡水水體中Ca2+濃度［23］，而插核后期的表達(dá)量升高，推測(cè)在長(zhǎng)期Ca2+缺乏的情況下，為了調(diào)節(jié)機(jī)體的鈣離子的平衡，以穩(wěn)定機(jī)體的正常Ca代謝，機(jī)體內(nèi)需要補(bǔ)充更多的Ca2+，此時(shí)會(huì)促進(jìn)CaM基因的表達(dá)來(lái)適應(yīng)低濃度Ca2+的生活，以穩(wěn)定機(jī)體的正常Ca代謝［24］，證明了CaM基因在Ca2+的重要作用。在1.25 mmol/L Ca2+濃度培養(yǎng)下，可以看出，外套膜表現(xiàn)比較穩(wěn)定，各時(shí)期沒(méi)有顯著差異。

0 mmol/L、1.25 mmol/L Ca2+濃度下，對(duì)比插核后20 d和50 d發(fā)現(xiàn)內(nèi)臟團(tuán)都出現(xiàn)了短期內(nèi)的表達(dá)量升高情況，有研究表明，研究表明三角帆蚌進(jìn)行內(nèi)臟團(tuán)插核手術(shù)后，傷口需要20 d左右時(shí)間進(jìn)行修復(fù)愈合［25］。推測(cè)三角帆蚌在插核后20 d還處于機(jī)體修復(fù)期，三角帆蚌尚未恢復(fù)活力，且免疫活力較高，CaM基因表達(dá)受到抑制［26，27］，后期機(jī)體修復(fù)完成后機(jī)體為獲取所缺失的鈣，CaM基因較平時(shí)表達(dá)量增加。但在0 mmol/L Ca2+濃度養(yǎng)殖下短期增加后由于長(zhǎng)期處于缺乏Ca而完全得不到補(bǔ)充，CaM基因無(wú)法正常表達(dá)而不斷降低。

在圖5中可以發(fā)現(xiàn)，2 mmol/L Ca2+濃度培養(yǎng)下，插核后CaM基因的表達(dá)量在插核后20 d已經(jīng)顯著升高。但是，在插核20之后的各個(gè)時(shí)期表達(dá)沒(méi)有顯著變化。由此可見(jiàn)，在適當(dāng)?shù)母逤a2+濃度下，會(huì)刺激鈣的代謝使CaM基因的表達(dá)量迅速升高［14］，但是促進(jìn)作用到達(dá)一定程度后CaM基因會(huì)在一個(gè)高表達(dá)量狀態(tài)保持穩(wěn)定，并沒(méi)有出現(xiàn)持續(xù)性的增長(zhǎng)。

在3 mmol/L Ca2+濃度下（圖6），外套膜和內(nèi)臟團(tuán)表達(dá)量都出現(xiàn)先升高再降低的趨勢(shì)，在插核后90 d和120 d，表達(dá)量甚至低于0 d?？梢钥闯?，Ca2+濃度在超過(guò)一定范圍后，機(jī)體內(nèi)Ca2+濃度過(guò)飽和鈣代謝出現(xiàn)紊亂［28］，出現(xiàn)抑制CaM基因表達(dá)的情況。

通過(guò)上述分析可以看出，CaM基因在一定Ca2+濃度范圍內(nèi)，低濃度表達(dá)量升高，過(guò)高濃度表達(dá)量降低，通過(guò)自身基因表達(dá)水平的改變來(lái)維持體內(nèi)Ca代謝的穩(wěn)定。

3.3 外套膜和內(nèi)臟團(tuán)組織CaM基因表達(dá)分析

總結(jié)所有CaM基因表達(dá)水平變化可以看出，外套膜中CaM基因表達(dá)量都顯著低于相應(yīng)時(shí)期和濃度下內(nèi)臟團(tuán)表達(dá)量（P＜0.05）。這與內(nèi)臟團(tuán)插核部位有關(guān)，本實(shí)驗(yàn)內(nèi)臟團(tuán)插核所在位置為靠近性腺部前端，珠核緊貼性腺。推測(cè)因?yàn)槿欠鲂韵僦泻写罅康腃a2+［29］，組織之間進(jìn)行比較，Ca含量更為豐富的內(nèi)臟團(tuán)比外套膜部位更具優(yōu)勢(shì)。此外，內(nèi)臟團(tuán)組織相比外套膜，結(jié)構(gòu)更加復(fù)雜，功能更加完善，Ca2+濃度發(fā)生改變時(shí)，對(duì)內(nèi)臟團(tuán)的影響較?。?0］。

綜上所述，本研究針對(duì)三角帆蚌珍珠形成過(guò)程中的關(guān)鍵蛋白鈣調(diào)蛋白進(jìn)行不同Ca2+濃度養(yǎng)殖，檢測(cè)不同時(shí)期外套膜和內(nèi)臟團(tuán)的表達(dá)量進(jìn)行研究。研究發(fā)現(xiàn)Ca2+濃度和CaM之間相互作用，在不同Ca2+濃度下CaM基因表達(dá)會(huì)有不同的變化，適當(dāng)升高Ca2+濃度對(duì)CaM基因表達(dá)起促進(jìn)作用，濃度過(guò)高和過(guò)低都會(huì)造成表達(dá)量降低，引發(fā)機(jī)體的鈣代謝紊亂。

內(nèi)臟團(tuán)表達(dá)量整體高于外套膜，鈣代謝水平升高，更有利于珍珠沉積［31］，但其在珍珠質(zhì)沉積的作用還有待進(jìn)一步深入研究。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)研究了不同Ca2+濃度養(yǎng)殖環(huán)境下，檢測(cè)了三角帆蚌CaM在外套膜和內(nèi)臟團(tuán)中的表達(dá)變化。研究發(fā)現(xiàn)，適當(dāng)升高（2 mmol/L）和降低（0.5 mmol/L）Ca2+濃度都會(huì)促進(jìn)CaM基因的表達(dá)，但過(guò)低（0 mmol/L）和過(guò)高（3 mmol/L）的濃度則會(huì)抑制CaM基因的表達(dá)。相同條件下，內(nèi)臟團(tuán)CaM基因表達(dá)量高于外套膜，更有利于珍珠的形成。

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（責(zé)任編輯 狄艷紅）

Expressions of Calmodulin Gene in Hyriopsis cumingii Mantle and Visceral Tissues Under the Culture Environment with Different Ca2+Concentrations

SHANG Chao1SHI Yang2LI Wen-juan1ZHOU Zi-rui1SHI Zhi-yi1

（1. Key Laboratory of Freshwater Aquatic Genetic Resources of Ministry of Agriculture，College of Fisheries and Life Science，Shanghai Ocean University，Shanghai 201306；2. Shanghai Institute of Food Research，Shanghai 200235）

In order to explore the role of calmodulin（CaM）gene in the formation of freshwater mussel，Hyriopsis cumingii was cultured in water environment at 5 different Ca2+concentrations of 0 mmol/L，0.5 mmol/L，1.25 mmol/L，2 mmol/L，and 3 mmol/L. At 0 d，20 d，50 d，90 d，and 120 d after nucleus inserted，mantle and visceral were sampled，then the CaM expressions in the tissues were detected using fluorescent quantitative PCR. The results showed that：1）The expression level of CaM gene in mantle and visceral mass were always low at 0 mmol/L Ca2+concentration，decreased and then increased and remained stable at 0.5 mmol/L，decreased at the 20 d in visceral mass，then rose to level at 0 d and remain stable at 1.25 mmol/L，significantly increased at 20 d，reached the highest which was maintained at 2 mmol/L among all 5concentrations，increased at 20 d after nucleus inserted，and decreased in the later period（P ＜ 0.05）at 3 mmol/ L. 2）There was no obvious difference among different concentrations at 0 d，and the expressions differentiated along different days after 0 d. 3）Under the same culture conditions，the expression of CaM gene in visceral mass was higher than that in mantle. It was found that the concentration of 0.5 mmol/L and 2 mmol/L promoted the expression of CaM gene，but the concentration of 0 mmol/L and 3 mmol/L inhibited the expression of CaM gene. Visceral mass was more conducive to the formation of pearl.

Hyriopsis cumingii；calmodulin；calcium concentration；visceral mass；mantle

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.12.024

2016-04-05

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31201991），教育部博士點(diǎn)基金（20123104120003），上海市優(yōu)青項(xiàng)目（ssc11004）

尚朝，男，碩士研究生，研究方向：生物學(xué)；E-mail：shangchao1120@126.com

施志儀，男，教授，研究方向：生物學(xué)；E-mail：zyshi@shou.edu.cn