瞿佳趙玲俠沈訥敏孫曉宇陳銳路鵬鵬喬雪麗沈衛(wèi)榮

（1. 陜西省微生物研究所微生物資源中心，西安 710043；2. 西安市疾病預防控制中心，西安 710043；3. 西安工程大學環(huán)境與化學工程學院，西安 710048）

抗鋅細菌ZS2的分離鑒定及抗金屬特性研究

瞿佳1趙玲俠1沈訥敏2孫曉宇1陳銳1路鵬鵬1喬雪麗3沈衛(wèi)榮1

（1. 陜西省微生物研究所微生物資源中心，西安 710043；2. 西安市疾病預防控制中心，西安 710043；3. 西安工程大學環(huán)境與化學工程學院，西安 710048）

篩選可有效降解礦區(qū)土壤重金屬的抗性細菌，在土壤環(huán)境的生物修復中應用前景廣闊。從陜西商洛鉛鋅礦重金屬污染土壤中篩選獲得一株對重金屬鋅有高抗性的菌株，命名為ZS2。通過形態(tài)特征、生理生化特性及16S rRNA序列分析，初步鑒定該菌為不解糖假蒼白桿菌（Pseudochrobactrum asaccharolyticum）。研究其抗重金屬及重金屬吸附特性，結果表明：ZS2對Zn2+具有較高抗性，最大耐受濃度20 mmol/L，且對多種重金屬（Pb2+、Cu2+、Cr6+和Cd2+）也具有耐受性；對低濃度Zn2+去除效果最佳，Zn2+濃度為2.0 mmol/L時吸附率高達55.25%；同時對高濃度Zn2+仍具有去除作用。不解糖假蒼白桿菌ZS2是鮮有的抗重金屬假蒼白桿菌屬細菌，具有優(yōu)良的修復土壤重金屬污染應用價值。

抗鋅細菌；重金屬抗性；分離鑒定；生物吸附

土壤重金屬污染是當前全球重要的環(huán)境問題之一，污染土壤中的重金屬不僅嚴重破壞生態(tài)環(huán)境平衡，還會通過生物鏈進入人體，直接危及人類健康［1，2］。鋅（Zn）主要通過礦產開采和冶煉加工進入土壤環(huán)境和水環(huán)境，機械制造以及鍍鋅生產、儀器儀表、有機合成和造紙等工業(yè)排放也會造成鋅污染［3］。研究表明，人體鋅含量過高會引起中毒、抑制體格及胸腺發(fā)育，攝入過量的鋅更會引起胃腸炎、

貧血、胰腺損傷，降低人體的免疫功能，導致體內多元系統功能紊亂甚至死亡［4-6］。

當前，鋅污染土壤的修復方法大致可分為物理、化學以及生物修復三大類。其中，物理修復和化學修復由于工程量大、運行費用高、操作復雜，且易引起土壤肥力減弱、造成二次污染等，越來越不適宜采用［7］。而利用生物修復技術治理土壤污染有著成本低廉、環(huán)境效果佳、擾動小的特點，逐漸成為新的研究熱點［8］。近年來，利用環(huán)境友好型微生物處理土壤中的重金屬發(fā)展迅速［9，10］，抗性細菌能夠通過特異性生物吸附、富集活化等多種方式降解重金屬，尤其適用于治理土壤低濃度或大面積重金屬污染。因此，有針對性的篩選抗鋅菌株，研究探索其抗鋅機制，對于農田土壤環(huán)境中鋅污染的治理具有深遠意義［11-13］。本研究從采自商洛鉛鋅礦污染的土壤中篩選出對重金屬Zn等具有較強抗性的菌株，研究其菌株形態(tài)、生理生化特性及抗重金屬特性，旨在尋找更加高效經濟的微生物修復材料，為重金屬污染土壤的可持續(xù)治理提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料與試劑 土壤樣品采集自陜西省商洛市商州區(qū)黑龍口鎮(zhèn)鉛鋅礦區(qū)周邊農田，取15 cm處土樣20 g，裝入無菌樣品袋內，于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

培養(yǎng)基：NaCl 10.0 g，蛋白胨 10.0 g，酵母浸粉 5.0 g，去離子水1 000 mL，pH7.2-7.4，121℃、30 min濕熱滅菌；若制備固體培養(yǎng)基需加入20 g/L瓊脂。

重金屬溶液：用去離子水將ZnSO4·7H2O配制成0.4 mol/L的母液，將Pb（NO3）2、CuSO4·5H2O、K2CrO4、CdCl2分別配制成0.1 mol/L的母液，121℃、30 min滅菌。所用試劑均為分析純。

1.1.2 主要儀器 隔水式培養(yǎng)箱GH500（北京科偉永興儀器有限公司），立式壓力蒸汽滅菌鍋LDZX-50KBS（上海申安醫(yī)療器械廠），搖瓶培養(yǎng)箱TS-2102（上海天呈實驗儀器制造有限公司），高速冷凍離心機GL-20G-H（上海安亭科學儀器廠），原子吸收光譜儀（Thermo Fisher iCE3000），722型紫外可見分光光度計（上海菁華科技儀器有限公司），基因擴增儀（TProfessional Standard Gradient 96），Biolog自動微生物鑒定系統（Gen III Microstation）。

1.2 方法

1.2.1 抗鋅微生物的分離篩選 抗鋅微生物的篩選采用金屬離子梯度壓力馴化法。取5 g土樣加入100 mL終濃度為2 mmol/L Zn2+的液體培養(yǎng)基中，30℃、150 r/min搖床培養(yǎng)3 d后，取5 mL培養(yǎng)液轉接至新鮮含Zn2+的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，Zn2+濃度梯度依次為 4、8、16和20 mmol/L。在固體培養(yǎng)基平板（Zn2+濃度為20 mmol/L）上反復劃線純化，直至分離得到抗性較高的單菌落ZS2，并觀察菌落生長狀況。

1.2.2 菌株ZS2的鑒定

1.2.2.1 形態(tài)學與Biolog 微生物鑒定系統鑒定 將篩選到的菌株劃線接種于固體培養(yǎng)基平板上，30℃培養(yǎng)72 h，觀察菌落形態(tài)。

采用 Biolog 微生物鑒定系統進行初步鑒定時，先參照《伯杰氏細菌鑒定手冊（第九版）》［14］與《常見細菌系統鑒定手冊》［15］對獲得的菌株進行革蘭氏染色、氧化酶實驗及接觸酶實驗，確定菌株類型。再通過Biolog分析細菌對糖、醇、酸等71種碳源（以水作空白對照）的利用情況和對23種化學敏感物質的反應，從而對菌株進行鑒定［16，17］。

1.2.2.2 系統發(fā)育學分析 提取菌株DNA，并作為模板進行16S rRNA的PCR擴增。16S rRNA基因PCR擴增引物為：27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCA-3'）和1492R（5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'）。擴增條件為：94℃預變性5 min；94℃變性1 min，55℃退火45 s，72℃延伸2 min，30個循環(huán)；72℃延伸10 min。

純化基因擴增產物，委托上海生工生物有限公司進行測序，通過Blast比對分析所得序列與GenBank數據庫中已有的細菌16S rRNA序列的相似性，運用ClustalX和MEGA 5.1軟件構建系統發(fā)育樹。

1.2.3 菌株ZS2在不同Zn2+濃度的生長實驗 配制Zn2+濃度分別為0、4、8、16和32 mmol/L的100 mL液體培養(yǎng)基，每瓶加入1 mL新鮮菌株種子液，30℃、150 r/min搖床培養(yǎng)。每隔5 h測定在菌株0-30 h內發(fā)酵液OD600值，用以確定菌株ZS2在不同Zn2+濃度下的生長曲線，每組處理設置3個重復。

1.2.4 菌株ZS2對其他重金屬耐受性實驗 參照不

同重金屬對微生物的毒性濃度［18］，將新鮮菌株種子液接種于單一及復合重金屬（Zn2+2 mmol/L 、Pb2+2 mmol/L、Cu2+1.5 mmol/L、Cr6+2 mmol/L、Cd2+1.5 mmol/L）的液體培養(yǎng)基中，顯微鏡下觀察其生長狀況。

1.2.5 菌株ZS2對Zn2+的吸附特性 將活化24 h的菌株ZS2種子液按1%的濃度接種入Zn2+濃度為 2、4、10 mmol/L的液體培養(yǎng)基，對照組不接種。30℃、150 r/min搖床培養(yǎng)，于6 h、12-72 h（間隔12 h），10 000 r/min離心5 min條件下去除菌體并收集上清液，利用原子吸收儀測定其中的Zn2+含量。每份樣品設3個重復。Zn2+吸附率（P）按照下列公式進行計算：P=（C0-C）/ C0×100%。式中，C0為原培養(yǎng)液中Zn2+濃度（mmol/L），C為菌體生長后培養(yǎng)液中Zn2+濃度。

2 結果

2.1 菌株的鑒定

2.1.1 菌株的形態(tài)學觀察 通過光學顯微鏡觀察發(fā)現，ZS2菌體大小約為（0.3-1.0）μm×（2.0-2.5）μm，桿狀。在固體培養(yǎng)基上，菌落呈圓形，乳白略帶淡黃色，凸起，表面濕潤，邊緣光滑，不透明，極易挑起。

表1 菌株ZS2的生理生化特征

圖1 菌體ZS2光學顯微鏡照片

表2 菌株ZS2對Biolog板上各底物的利用能力

2.1.2 菌株生理生化特性 菌株ZS2常規(guī)生理生化特征分析結果（表1）表明，菌株ZS2為革蘭氏陰性細菌，有鞭毛，生長溫度為15-45℃，氧化酶反應陰性、接觸酶反應陽性；可以有效地利用19種碳源，對利福霉素SV、萬古霉素、鹽酸胍、氯化鋰等不敏感，可在1% NaCl、1%乳酸鈉、pH6等條件下生長。根據其對不同底物的利用能力，Biolog鑒定結果（表2）表明，菌株ZS2與不解糖假蒼白桿菌（Pseudochrobactrum asaccharolyticum）的相似性Similarity（SIM）為0.637。

2.1.3 系統發(fā)育學分析 將菌株ZS2的16S rRNA序列（擴增長度為1 371 bp），通過GenBank進行序列分析和同源性比對。結果表明，菌株ZS2序列與Pseudochrobactrum asaccharolyticum的16S rRNA序列同源性為99%。序列已提交 NCBI 的GenBank數據庫，登錄號為KM108307（圖2）。

2.2 Zn2+濃度對菌株下生長曲線的影響

圖3所示為菌株ZS2在Zn2+濃度梯度為0、4、8、16和32 mmol/L下的生長曲線。隨著Zn2+濃度逐漸增大，菌株生長逐漸受到抑制，但是均能完成正常的新陳代謝過程。但當Zn2+增大至32 mmol/L時，ZS2不能正常生長。

2.3 菌株ZS對單一及復合重金屬的抗性實驗

通過研究菌株ZS2對單一及復合重金屬（Zn2+2 mmol、Pb2+2 mmol/L、Cu2+1.5 mmol/L、Cr6+2 mmol/L、Cd2+1.5 mmol/L）的抗性，結果（表3）表明菌株ZS2除能抗鋅以外，還能在單一重金屬及復合重金屬培養(yǎng)基中生長，其中在含Pb2+、Cu2+、Cd2+及5種金屬離子的混合溶液中生長良好。

表3 菌株ZS2對重金屬的抗性試驗

2.4 菌株ZS2對Zn2+吸附性能研究

菌株ZS2對Zn2+的去除性能如圖4可知，Zn2+濃度為2.0、4.0和10.0 mmol/L時，菌株ZS2對Zn2+的吸附率隨時間增加逐漸提高。6-24 h內，菌株處于對數生長期，菌株快速繁殖且活力強，吸附率提高較快；24 h后菌株進入穩(wěn)定期，吸附率增長較慢。3 d后，2.0、4.0和10.0 mmol/L濃度條件下，菌株對Zn2+的吸附率分別為55.25%、40.75%和33.11%。

3 討論

土壤微生物是表征土壤生態(tài)系統結構和維持生態(tài)系統穩(wěn)定性的重要構成［19］，不僅可以代謝土壤中的動植物殘體，還調節(jié)土壤有機質和其他有害化合物的分解、生物化學循環(huán)和土壤結構形成［20］。土壤中的抗性菌株可以有效的結合重金屬離子，改變重金屬與土壤的結合形態(tài)，有針對性的進行土壤修復［21，22］。隨著采礦業(yè)及制造業(yè)的發(fā)展，土壤重金屬污染逐漸向多元化發(fā)展［19，23］，利用環(huán)境友好型微生物、微生物-植物共存系統相互促進作用對污染土壤進行生物修復逐漸成為環(huán)境科學領域研究熱點。近年來，國內外研究耐重金屬微生物取得一定進展，不僅研究發(fā)現了多種具有不同重金屬抗性的菌株［24-27］，還探索了運用微生物治理重金屬污染的不同機理和途徑，如利用耐性微生物進行生物吸附、通過微生物基因構建轉基因植物、利用植物根系-微生物協同治理等［28］。

微生物吸附法作為一種新興的處理技術，能夠利用微生物本身的化學成分及結構特性吸附重金屬離子，在治理重金屬鋅污染方面應用廣泛［29］。王慧

萍等［30］分離自銅礦污染土的鞘氨醇單胞菌屬DXT3-03，對鋅具有抗性，耐Zn2+濃度為25 mmol/L；樊霆等［31］從鋅尾砂壩土壤中分離到一株黃曲霉（Aspergillus flavus），可富集水源中的Zn2+；李進等［32］從鉛鋅礦區(qū)分離到一株蟲生輪枝菌，其生長菌株對Zn2+的去除率為87.7%。

圖2 菌株ZS2的16S rRNA序列的系統發(fā)育樹

圖3 不同Zn2+濃度下菌株 ZS2 生長曲線

圖4 菌株 ZS2 對Zn2+的吸附率

假蒼白桿菌屬由Peter等［33］于2007年自海洋中發(fā)現以來，從環(huán)境中分離出假蒼白桿菌屬抗性細菌鮮有報道。龍冬艷等［34］從鉻污染土壤中獲得Cr（VI）還原菌株Pseudochrobactrum sp. LY10，應用于Cr污染治理中。Mergeay等［35］學者分類指出，抗鋅細菌為耐鋅濃度超過10 mmol/L的細菌；本研究從應用角度出發(fā)，首次篩選獲得假蒼白桿菌屬高抗鋅細菌ZS2，為復合重金屬污染土壤的Zn2+生物修復研究提供了重要研究材料；然而菌株ZS2在土壤生態(tài)系統中是否為優(yōu)勢種及其抗性機理、效力還有待進一步研究闡明。

4 結論

本研究采用濃度梯度篩選法分離獲得一株高抗鋅細菌，鑒定為不解糖假蒼白桿菌 Pseudochrobactrum asaccharolyticum ZS2。該菌株不僅能在高濃度Zn2+條件下穩(wěn)定生長，還具有重金屬多重抗性，可在含Pb2+、Cu2+、Cr6+、Cd2+的單一或混合培養(yǎng)基中生長，表明該菌株可應用于重金屬復合污染土壤的生物修復。此外，該菌株對低濃度Zn2+吸附速度快、吸附率高，對大面積中低濃度Zn2+污染土壤的修復富有潛力。

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（責任編輯 馬鑫）

Isolation，Identification and Heavy Metal-resistance Characteristics of a Zn-resistant Bacterium，Pseudochrobactrum sp. ZS2

QU jia1ZHAO Ling-xia1SHEN Ne-min2SUN Xiao-yu1CHEN Rui1LU Peng-peng1QIAO Xue-li3SHEN Wei-rong1
（1. Microbial Resource Center，Microbiology Insititute of Shaanxi，Xi’an 710043；2. Xi’an Center for Disease Control and Prevention，Xi’an 710043；3. College of Environmental & Chemistry Engineering，Xi’an Polytechnic University，Xi’an 710048）

Screening of resistant bacterium is beneficial to degradation of heavy metal and bioremediation of soil. A zinc-resistant strain，named ZS2，was isolated from metal-polluted soil in a lead-zinc mining area in Shangluo，Shaanxi province and identified as Pseudochrobactrum asaccharolyticum based on the analysis of its physical and biochemical characteristics and its 16S rRNA gene sequence. Studying the resistance of heavy metals and Zn2+adsorption，the results showed that ZS2 has high Zinc-resistance and maximum tolerable is 20 mmol/L. The ZS2 also could grow in a variety of single and combined heavy metals（Pb2+、Cu2+、Cr6+、Cd2+）and have obvious removal effects of low Zn2+concentration. When the concentrations of zinc was 2.0 mmol/L，the removal efficiency could reach 55.25%. The results indicated that ZS2 is a rare strain with heavy metal resistance from Pseudochrobactrum genus and have excellent application value to remediate heavy metal contaminated soil.

zinc-resistant bacterium；heavy metals-resistance；identification；biosorption

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.12.022

2016-03-29

陜西省科學院青年人才培養(yǎng)專項（2014K-34）

瞿佳，女，碩士，研究實習員，研究方向：資源環(huán)境微生物的研究與應用；E-mail：q_jia@163.com

沈衛(wèi)榮，男，研究員，研究方向：微生物菌種選育、發(fā)酵工程等應用微生物研究及產業(yè)化開發(fā)；E-mail：shenweirong@21cn.com