周梅仙 周業(yè)飛

（南京曉莊學院食品科學學院，南京 211171）

蛹蟲草基質(zhì)多糖對雞傳染性支氣管炎滅活疫苗的免疫佐劑作用

周梅仙 周業(yè)飛

（南京曉莊學院食品科學學院，南京 211171）

以蛹蟲草基質(zhì)多糖為免疫佐劑，將其混入傳染性支氣管炎滅活疫苗，從而探討其對肉仔雞的免疫功能影響。選用150只1日齡黃羽肉雞，隨機分成5組。免疫后21 d（35日齡）采用IBV M41株病毒液進行點眼、滴鼻攻毒。通過測定每組的雞淋巴細胞（PBMC）增殖情況、雞血清抗體效價、IBV強毒株攻毒保護及組織病理學變化。結(jié)果表明，蛹蟲草基質(zhì)多糖中劑量佐劑組的雞淋巴細胞（PBMC）增殖指數(shù)、雞血清抗體效價水平有著顯著提高（P＜0.05），在IBV M41株攻毒試驗中，蛹蟲草基質(zhì)多糖中劑量佐劑組可以顯著減輕病毒感染肉仔雞臨床癥狀，肺和腎無組織病理學變化，免疫保護率達到96.7%。表明以蛹蟲草基質(zhì)多糖佐劑能夠提高肉仔雞對傳染性支氣管炎的免疫力。

蛹蟲草基質(zhì)多糖；雞傳染性支氣管炎；免疫佐劑

免疫佐劑是通過富集免疫原（如鋁膠）、緩釋免疫原（如油乳劑）、激活抗原提呈細胞單核吞噬細胞系統(tǒng)遞呈抗原（如卡介苗、細菌脂多糖）以及多種綜合作用（如不完全弗氏佐劑和完全弗氏佐劑）來實現(xiàn)對免疫原的免疫增強作用［1，2］。免疫佐劑種類很多，目前國內(nèi)外尚無統(tǒng)一的分類方法，一般將常用的佐劑分為4類：無機佐劑，如氫氧化鋁、明礬等；有機佐劑，微生物及其產(chǎn)物，如分枝桿菌（結(jié)核桿菌、

卡介苗）、短小桿菌、百日咳桿菌、外毒素、細菌提取物（胞壁酰二肽）等；合成佐劑，如人工合成的雙鏈多聚核苷酸（雙鏈多聚腺苷酸、尿苷酸）、左旋咪唑、異丙肌苷等；油佐劑，如弗氏佐劑、花生油乳化佐劑、礦物油、植物油等［3，4］。

蛹蟲草（Cordyceps militaris）又名北冬蟲夏草或北蟲草，隸屬于子囊菌門、麥角菌科、蟲草屬的真菌。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，蛹蟲草富含多種功能活性物質(zhì)，如蟲草素、蟲草多糖，與冬蟲夏草有相似的活性成分和藥理作用［5］。蛹蟲草可采用蠶蛹、大米、小麥等培養(yǎng)基人工栽培，但栽培后的廢基質(zhì)大都沒有得到有效利用，而廢基質(zhì)中的多糖含量約為子實體的2-4倍［6］。大量研究證實蛹蟲草子實體多糖具有抗腫瘤、抗氧化、降血糖、能提高免疫力等作用［7］。

本實驗以臨床實際需要為出發(fā)點，將蛹蟲草基質(zhì)多糖配合IBV疫苗的使用，并從外周血淋巴細胞增殖刺激指數(shù)、血清抗體水平和攻毒保護試驗等指標來評價蛹蟲草基質(zhì)多糖的疫苗佐劑效果，旨在為擴大蛹蟲草基質(zhì)多糖的應用范圍提供參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 蛹蟲草基質(zhì)多糖佐劑制備 參考文獻［8］方法略有改進，蛹蟲草廢基質(zhì)粉碎后用石油醚脫脂，60℃干燥至恒重，稱取5 g，加入200 mL水，搖勻，再加入2 000 U的纖維素酶2.5 mL，調(diào)節(jié)pH值到4.8，在50℃水浴1.5 h，再轉(zhuǎn)移到80℃水浴中滅活2 h。然后進行超聲波處理，30℃處理40 min，在4 200 r/min離心10 min，收集上清液。將收集到的上清液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)到一定體積，采用Sevag法進行除蛋白，采用4倍體積的95%的乙醇進行醇沉，在4℃冰箱中醇沉24 h，抽濾，冷凍干燥得蛹蟲草基質(zhì)多糖。

1.1.2 試驗動物和病毒毒株 150只1日齡IBV非免疫雛雞，由江蘇省海安縣雙效種禽有限責任公司孵禽場提供；試驗所用的疫苗抗原傳染性支氣管炎病毒（Infectious bronchitis virus，IBV）H120株和攻毒毒株IBV M41，由江蘇省生物教學示范中心保存提供，經(jīng)9-10日齡SPF雞胚增殖一代而獲得。SPF雞胚由南京天邦生物科技有限公司提供。

1.1.2 主要試劑 淋巴細胞分離液為美國貝克曼庫爾特有限公司產(chǎn)品；RPMI1640固體粉狀培養(yǎng)基（Gibco公司），根據(jù)說明書要求用去離子水配制，然后加入雙抗（青、鏈霉素各100 U/mL），臨用前加入10%的小牛血清（賽齊（上海）生物工程有限公司）作為細胞培養(yǎng)生長液；四甲基偶氮唑藍（MTT，噻唑藍，Amresco公司）溶液和ConA（Sigma公司），分別配制成5 mg/mL和1 mg/mL的溶液，0.22 μm混合纖維素酯微孔濾膜過濾，分裝備用；RNA 提取試劑盒TRIzol Regeant購自Invitrogen公司；反轉(zhuǎn)錄酶M-MLV為Promega公司產(chǎn)品；DEPC水為北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司產(chǎn)品；二甲亞砜（DMSO）、乙醇、異丙醇和氯仿等其他試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 IB抗原制備及殘留毒檢測 試驗所用的疫苗抗原IBV H120和M41株經(jīng)9-10日齡SPF雞胚增殖一代而獲得。將新收獲的IBV H120雞胚尿囊液（每0.1 mL≥106EID50）按常規(guī)方法用0.1%甲醛滅活24 h，作為疫苗抗原，置4℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｈ∩鲜鰷缁畈《疽喊?.1 mL/枚劑量接種9-10日齡雞胚，37℃培養(yǎng)，盲傳3代，觀察接種雞胚死亡情況，取存活雞胚尿囊液測定HA效價。

1.2.2 滅活疫苗制備 疫苗的制備參考“獸用生物制品規(guī)程”［9］，將高中低劑量（480、160和80 mg/mL）蛹蟲草基質(zhì)多糖佐劑按1∶4的比例與上述滅活病毒液混勻后即成含蛹蟲草基質(zhì)多糖納米乳佐劑滅活疫苗成品，置4℃冰箱保存?zhèn)溆?。陽性對照組為鋁膠佐劑疫苗，將50%氫氧化鋁膠生理鹽水與同樣的滅活病毒液按1∶4的比例混合，常規(guī)方法乳化，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 疫苗質(zhì)量與安全檢測 將配好的滅活疫苗根據(jù)現(xiàn)行《中國獸藥典》附錄［9］進行檢驗，接種普通瓊脂板和血平板，置37℃培養(yǎng)5 d，觀察疫苗在2種培養(yǎng)基中是否有細菌生長。同時將滅活疫苗按1 mL/只劑量頸部皮下注射14日齡仔雞，對照組接種相同劑量滅菌生理鹽水。接種后連續(xù)觀察14 d，觀察供試雞的精神狀態(tài)以及是否有因接種疫苗引起的局部或全身不良反應。

1.2.4 動物試驗設計 150只1日齡IBV非免疫雛雞隨機分為5組，每組30只，籠養(yǎng)，自由采食飲

水。試驗1、2、3組在14和21日齡時分別用105.0EID50/0.1 mL劑量的滅活疫苗經(jīng)肌肉注射進行免疫，每只注射0.1 mL；第4組為陽性對照組（鋁膠佐劑）；第5組為空白對照組（PBS）。

1.2.5 雞淋巴細胞（PBMC）增殖試驗

1.2.5.1 雞外周血淋巴細胞的制備 分別從首免、首免后14、21和28 d從雞翅靜脈無菌取1 mL血液，小心沿側(cè)壁加入到含有4 mL淋巴細胞分離液玻璃離心管中液面上，以2 000 r/min離心15 min；收集上層與淋巴細胞分離液（下層）兩相界面上的細胞（白色云霧層），放入新的10 mL玻璃離心管中，并以無菌PBS緩沖液補至總體積8 mL，混勻后，再以2 000 r/min離心10 min；吸去上清液，細胞沉淀經(jīng)PBS反復洗滌2次，即得所需的外周血淋巴細胞；經(jīng)活細胞染色計數(shù)后，用RPMI-1640完全營養(yǎng)液調(diào)節(jié)細胞密度至5×106個/mL；按100 μL/孔將細胞懸液加到96孔細胞板中培養(yǎng)備用。

1.2.5.2 淋巴細胞增殖試驗 淋巴細胞增殖試驗按Jiang等［10］的方法稍作調(diào)整。將蛹蟲草基質(zhì)多糖疫苗佐劑作為刺激原，每孔加入100 μL，對照孔加入100 μL RPMI-1640完全營養(yǎng)液，陰性對照孔為PBS，陽性對照孔為ConA（終濃度為10 mg/L），各做3個重復孔。37℃下培養(yǎng)44 h后每孔加入40 μL MTT（5 mg/mL），37℃下繼續(xù)培養(yǎng)4 h。吸棄培養(yǎng)液，每孔加入100 μL DMSO，振蕩融解結(jié)晶沉淀，在酶標儀上測定OD570nm值，計算刺激指數(shù)（刺激指數(shù)SI＝刺激孔的OD值/未刺激孔的OD值）。

1.2.6 血清抗體檢測 分別于14、21和28日齡每組各取10只進行翅靜脈采血，分離血清，參考OIE用HI微量法檢測接種雞血清樣品中的抗體效價［11］。

1.2.7 攻毒保護試驗 首免后21 d（35日齡）用1∶10稀釋的IBV M41株病毒尿囊液對所有試驗雞進行點眼、滴鼻攻毒，0.5 mL/只。攻毒后5 d每組撲殺10只雞，無菌采集肺臟和腎組織，-70℃保存，待檢。繼續(xù)觀察剩余雞群的臨床癥狀、發(fā)病及死亡狀況，對死亡雞進行剖檢，觀察IBV靶器官組織病理變化。將實驗雞撲殺后采集的病料按1∶4加PBS緩沖液研磨成組織懸液，反復凍融3次后，10 000 r/min離心15 min，取上清用0.22 μm微孔濾膜過濾除菌。取0.5 mL濾過液經(jīng)尿囊腔接種3枚10日齡SPF雞胚，37℃孵育，棄去24 h內(nèi)死亡胚，72 h后無菌收集尿囊液，根據(jù)TRIzol的說明書要求，從雞胚尿囊液中提取病毒RNA，應用RT-PCR方法擴增IBV N基因，從而判斷IBV病原是否為陽性。

1.2.8 肺臟組織病理檢查 攻毒后5 d，將所有存活雞處死，取肺臟和腎組織固定于4%甲醛中，石蠟包埋，常規(guī)病理組織切片處理，HE染色檢測組織病理變化。

1.3 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

應用SPSS軟件，對數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，進行ANOVA及Duncan’s多重分析，比較各組差異，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 抗原殘留毒和疫苗質(zhì)量檢測

0.1 %甲醛滅活處理疫苗24 h后，將疫苗抗原接種至9日齡雞胚，對雞胚盲傳3代后均存活，收集活胚尿囊液進行HA檢測發(fā)現(xiàn)HA值均為20，表明疫苗抗原經(jīng)終濃度為0.1%甲醛在37℃恒溫作用24 h可完全被滅活。將制備好的滅活疫苗取少量分別在普通瓊脂板、血平板上37℃恒溫培養(yǎng)連續(xù)觀察7 d，未見雜菌生長的異況發(fā)生；滅活疫苗分別以3 000 r/min離心20 min，疫苗均未出現(xiàn)分層現(xiàn)象，說明疫苗的穩(wěn)定性達到了實驗要求；仔雞頸部皮下注射疫苗后連續(xù)14 d觀察，雞群無因接種疫苗引起的局部或全身不良反應，食欲、精神狀態(tài)都正常。

2.2 佐劑蛹蟲草基質(zhì)多糖對雞PBMC增殖效應

MTT法測定佐劑蛹蟲草基質(zhì)多糖對雞PBMC增殖效果，結(jié)果（圖1）顯示，蛹蟲草基質(zhì)多糖中劑量組SI值顯著比陽性和空白對照組高（P＜0.05）。

圖1 MTT法測定蛹蟲草基質(zhì)多糖對雞PBMC增殖效應

2.3 佐劑蛹蟲草基質(zhì)多糖對雞血清抗體效價變化

用HI微量法對所采集的免疫雞群的血清樣品進行IBV抗體檢測，表1顯示，IBV血清抗體在21和28 dpi時，蛹蟲草基質(zhì)多糖組分別比陽性對照組顯著提高了1.0和1.2個滴度（P＜0.05），證明蛹蟲草基質(zhì)多糖對雞群抗體免疫力具有顯著影響。

表1 雞血清中IBV抗體效價變化（log2）

2.4 佐劑蛹蟲草基質(zhì)多糖對IBV強毒株攻毒保護變化

用IBV強毒株對各組仔雞進行攻毒后，蛹蟲草基質(zhì)多糖低中高劑量組分別有3、1和2只雞發(fā)病，而對照組均出現(xiàn)IBV臨診癥狀，發(fā)病率為16.7%-

100%，空白對照組出現(xiàn)1只雞死亡；多數(shù)雞攻毒48 h后臨診癥狀開始明顯，14 d左右癥狀消失。病雞臨診表現(xiàn)為精神沉郁、甩鼻、甩頭、氣管啰音、尖叫、縮脖、羽毛蓬松、兩翅下垂、張口呼吸等癥狀，有些雞出現(xiàn)拉稀、采食量和體重明顯下降、飲水增多。對照組所有雞表現(xiàn)為精神沉郁、甩頭、氣管啰音、尖叫等呼吸道癥狀，采食量下降。

2.5 組織病理學變化

攻毒5 d后對照組（PBS）肉雞肺臟的主要病變是肺間質(zhì)性炎、小支氣管腔內(nèi)滲出物、小支氣管壁周圍炎細胞浸潤和肺組織充血、出血等病理變化，腎臟的主要病變是腎小管上皮細胞變性壞死和間質(zhì)性炎。而蛹蟲草基質(zhì)多糖組和Al（OH）3組肺臟和腎則沒有明顯的病理變化（圖2）。

圖2 攻毒肉雞肺臟組織病理學變化

3 討論

在養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展過程中，加強疾病預防一直是重中之重，疫苗接種往往就成為規(guī)模化養(yǎng)殖場的必備環(huán)節(jié)。但是一些養(yǎng)殖場對疫苗的接種時間、接種部位、接種劑量和疫苗質(zhì)量劑型的把握不完全造成免疫接種效果不理想甚至失?。?2］。與此同時，早期的疫苗接種為追求免疫效果，而忽略了疫苗對動物機體的傷害，部分疫苗接種部位腫脹甚至壞死。機體應激反應較多、發(fā)熱、食欲不振現(xiàn)象時有出現(xiàn)［13］。為了解決傳統(tǒng)疫苗存在的一些弊端，多肽疫苗、基因重組疫苗等不斷問世，為了避免弱毒疫苗潛在的安全性問題而更傾向于使用滅活疫苗。但這些疫苗由于抗原純度高、分子量小、免疫原性相對減弱，需要與佐劑共同使用以增強免疫效果［14］。因此佐劑應具有能夠增強疫苗抗原的免疫原性，促進細胞免疫和體液免疫，優(yōu)化免疫應答等基本的特征。

表2 佐劑蛹蟲草基質(zhì)多糖對IBV強毒株攻毒保護變化

淋巴細胞的增殖反應是衡量動物機體的免疫能力重要指標，也是在探索雞的免疫功能以及防御機制一個重要出發(fā)點。在動物機體對外界產(chǎn)生免疫應答的發(fā)生發(fā)展過程中，T細胞參與細胞免疫應答，且T細胞的功能和淋巴細胞增殖量的多少直接決定著機體的細胞免疫效果［15］。本實驗顯示，蛹蟲草基質(zhì)多糖佐劑能夠提高淋巴細胞的增殖。先前的研究表明蛹蟲草基質(zhì)多糖，能夠保護免疫器官、增加免

疫器官重量、增強單核吞噬細胞功能、增強T細胞功能、增強B細胞功能、增強NK細胞功能、增加補體含量和增強補體活性、誘生細胞因子，有效地激發(fā)和調(diào)節(jié)免疫功能［16］。所以，蛹蟲草基質(zhì)多糖體現(xiàn)出增強免疫的免疫佐劑特征。

雞血液中抗體水平的高低直接關系到雞的抗病力［17］。一般來講，抗體的水平越高其抗病能力也就得到加強，這對雞的成長也十分有利。本實驗采用蛹蟲草基質(zhì)多糖佐劑配合疫苗來探索其在疫苗抗體水平中發(fā)揮的作用中，蛹蟲草基質(zhì)多糖組顯著比陽性對照組高。攻毒試驗結(jié)果進一步表明了蛹蟲草基質(zhì)多糖佐劑配合疫苗能夠使得機體的免疫效力得到提高，保護力強，達到本實驗的預期目標。

4 結(jié)論

160 mg/mL劑量的蛹蟲草基質(zhì)多糖可顯著提高雞淋巴細胞（PBMC）增殖指數(shù)和血清抗體效價水平，同時在IBV M41株攻毒試驗中，160 mg/mL劑量的蛹蟲草基質(zhì)多糖可顯著減輕病毒感染肉仔雞臨床癥狀，肺和腎無組織病理學變化，免疫保護率達到96.7%。表明了以蛹蟲草基質(zhì)多糖佐劑能夠提高肉仔雞對傳染性支氣管炎的免疫力。

［1］Abd El Rahman S, Winter C, El-Kenawy A, et al. Differential sensitivity of well-differentiated avian respiratory epithelial cells to infection by different strains of infectious bronchitis virus［J］. Journal of Virology, 2010, 84：8949-8952.

［2］Autran B, Carcelain G, Combadiere B, et al. Therapeutic vaccines for chronic infections［J］. Science, 2004, 305：205-208.

［3］Aghasadeghi MR, Salmani AS, Sadat SM, et al. Application of outer membrane vesicle of Neisseria meningitidis serogroup B as a new adjuvant to induce strongly Th1-oriented responses against HIV-1［J］. Current HIV Research, 2011, 9：630-635.

［4］Degen WG, van Zuilekom HI, Scholtes NC, et al. Potentiation of humoral immune responses to vaccine antigens by recombinant chicken IL-18（rChIL-18）［J］. Vaccine, 2005, 23：4212-4218.

［5］Lee S, Lee HH, Kim J, et al. Anti-tumor effect of Cordyceps militaris in HCV-infected human hepatocarcinoma 7. 5 cells［J］. The Journal of Microbiology, 2015, 53（7）：468-474.

［6］Lee HH, Lee S, Lee K, et al. Anti-cancer effect of Cordyceps militaris in human colorectal carcinoma RKO cells via cell cycle arrest and mitochondrial apoptosis［J］. DARU Journal of Pharmaceutical Sciences, 2015, 23：35.

［7］ Huang SJ, Lin CP, Mau JL, et al. Effect of UV-B Irradiation on Physiologically active substance content and antioxidant properties of the medicinal caterpillar fungus Cordyceps militaris （Ascomycetes）［J］. Int J Med Mushrooms, 2015, 17（3）：241-253.

［8］江海濤, 吳雨龍, 等. 蛹蟲草基質(zhì)多糖對酒精所致小鼠急性肝損傷的保護作用［J］. 食品科學, 2014, 35（13）：223-227.

［9］中國獸藥典委員會. 中華人民共和國獸藥典［M］. 北京：中國農(nóng)業(yè)出版社, 2010.

［10］ Jiang W, Jiang P, Li Y, et al. Recombinant adenovirus expressing GP5 and M fusion proteins of porcine reproductive and respiratory syndrome virus induce both humoral and cell-mediated immune responses in mice［J］. Veterinaryimmunology and Immunopathology, 2006, 113（1-2）：169-180.

［11］Office International des Epizooties（O. I. E.）, Manual of standards for diagnostic tests and vaccines［S］. Avian Infectious Bronchitis, 6th edn, 2008：443-455.

［12］Jawale CV, Lee JH. Characterization of a Salmonella Typhimurium ghost carrying an adjuvant protein as a vaccine candidate for the protection of chickens against virulent challenge［J］. Avian Pathology, 2014, 43（6）：506-513.

［13］Ding W, Guo X, Ataku K. Characterization of peptides in ensiled alfalfa treated with different chemical additives［J］. Animal Science Journal, 2013, 84（12）：774-781.

［14］ Mosmann TR, et al. The expanding universe of T-cell subsets：Th1, Th2 and more［J］. Immunol Today, 1996, 17（3）：138-146.

［15］Meir R, Krispel S, Simanov L, et al. Immune responses to mucosal vaccination by the recombinant A1 and N proteins of infectious bronchitis virus［J］. Viral Immunology, 2012, 25：55-62.

［16］Lyu K, Wang GC, He YL, et al. Crystal structures of enterovirus 71（EV71）recombinant virus particles provide insights into vaccine design［J］. J Biol Chem, 2015, 290（6）：3198-3208.

［17］Ju XH, Xu HJ, Yong YH, et al. Heat stress upregulation of Toll-like receptors 2/4 and acute inflammatory cytokines in peripheral blood mononuclear cell（PBMC）of Bama miniature pigs：an in vivo and in vitro study［J］. Animal, 2014, 8（9）：1462-1468.

（責任編輯 李楠）

Adjuvanticity of Cordyceps militaris stroma Polysaccharides in Inactivated Vaccine to Avian Infectious Bronchitis

ZHOU Mei-xian ZHOU Ye-fei
（Department of Food Science，Nanjing Xiaozhuang University，Nanjing 211171）

It aimed to use Cordyceps militaris stroma polysaccharides as adjuvants that mix with inactivated vaccine to infectious bronchitis，and to investigate its effects on the immune functions of broilers. Total 150 1-day Huangyu broilers were selected and randomly divided into 5 groups. Then the broilers of 21 d after immunized（35-day）were infected with Mass 41 infectious bronchitis virus（IBV M41）strain by the ocular-nasal route. The proliferation of peripheral blood mononuclear cells（PBMC），serum antibody titer，the protection of IBV virulent strain，and histopathological changes in each group were evaluated respectively by MTT method and hemagglutination inhibition assay. The results showed that proliferation index of PBMC and serum antibody titer in the broilers with dosage C. militaris stroma polysaccharides as adjuvants significantly raised（P＜0.05）. Following challenge test with IBV M41 strain，broilers inoculated with C. militaris stroma polysaccharides showed significantly lighter clinical symptoms，there were no histopathological changes in lung and kidney，and immune protection reached 96.7%. This indicated that C. militaris stroma polysaccharides as adjuvants increased the immunity of broilers to infectious bronchitis.

Cordyceps militaris stroma polysaccharides；avian infectious bronchitis；adjuvants

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.12.018

2016-04-27

南京曉莊學院院級重點項目（2013NXY10）

周梅仙，副教授，研究方向：動物養(yǎng)殖；E-mail：492773339@qq.com