肖晶查星琴，成文敏，霍金龍，潘偉榮，王淑燕，王配，劉海京張秀瓊曾養(yǎng)志

（1. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，昆明 650201；2. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 云南省版納微型豬近交系重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，昆明 650201）

版納微型豬近交系CATSPER3基因克隆、序列及發(fā)育進(jìn)化分析

肖晶1查星琴1，2成文敏1，2霍金龍1，2潘偉榮1，2王淑燕1，2王配1，2劉海京2張秀瓊2曾養(yǎng)志2

（1. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，昆明 650201；2. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 云南省版納微型豬近交系重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，昆明 650201）

獲得版納微型豬近交系（BMI）CATSPER3基因部分編碼區(qū)序列，通過(guò)生物信息學(xué)分析其氨基酸序列和進(jìn)行不同物種間的同源性比較。以版納微型豬近交系的公豬睪丸為材料提取RNA，RT-PCR方法擴(kuò)增CATSPER3基因部分編碼區(qū)序列，利用在線分析軟件進(jìn)行生物信息學(xué)分析。結(jié)果顯示，擴(kuò)增出CATSPER3基因部分編碼區(qū)序列。生物信息學(xué)分析表明，推導(dǎo)氨基酸序列，編碼蛋白分子量為19.397 3 kD，理論等電點(diǎn)為5.05；在氨基酸組成上，酸性氨基酸（Asp+Glu）有24個(gè)、堿性氨基酸（Lys+Arg）有16個(gè)，其中以亮氨酸（Leu）占13.3%、纈氨酸（Val）占9.6%、蘇氨酸（Thr）占9.0%、苯丙氨酸（Phe）占8.4%、谷氨酸（Glu）占7.2%，天冬氨酸（Asp）占7.2%等含量較高。在核苷酸相似度上與普通豬相似度最高，與山羊核苷酸的相似度較低；分子系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)表明與非近交系豬同處于一個(gè)分支中，親緣關(guān)系較近，與山羊和綿羊親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

版納微型豬近交系；CATSPER3基因；系統(tǒng)進(jìn)化分析

近年來(lái)許多相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，精子在獲能和超活化過(guò)程中會(huì)出現(xiàn)大量鈣離子內(nèi)流，說(shuō)明它是精子質(zhì)膜上控制鈣離子內(nèi)流的通道，精子頭部和尾部存在一種離子蛋白，對(duì)精子的運(yùn)動(dòng)能力、穿卵能力以及受精能力都有一定的影響。CATSPER通道是已知的僅存于生精細(xì)胞和成熟精子中的Ca2+離子通道，通過(guò)基因剔除發(fā)現(xiàn)這類(lèi)通道直接與精子的運(yùn)動(dòng)和受精能力有關(guān)。早期研究表明Ca2+離子通道蛋白家族（Canon channel of sperm ptoreins Catsper）由4個(gè)成員（CATSPER1、CATSPER2、CATSPER3和CATSPER4）組成［1，2］，而后又發(fā)現(xiàn)Ca2+離子通道蛋白的新成員Catsper β和CatsperG［3，4］。

Ca2+離子通道蛋白的表達(dá)是睪丸特異的，在睪丸以外的其他器官及免疫系統(tǒng)如大腦、心臟、脾、腎、胃、骨骼中皆不表達(dá)。其中CATSPER3主要定位于精子頭部［1，3］，而AMP和Ca2+都能誘導(dǎo)頂體反應(yīng)的發(fā)生，因此推測(cè)CATSPER3可能參與頂體反應(yīng)中胞內(nèi)Ca2+濃度的調(diào)節(jié)。版納微型豬近交系是世界上第一個(gè)培育成功的大型哺乳類(lèi)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物近交系，CATSPER3基因是Ca2+離子通道蛋白家族的重要成員之一，本研究擬采用反轉(zhuǎn)錄PCR的方法擴(kuò)增得到版納微型豬近交系豬CATSPER3基因的序列，結(jié)合多種生物信息學(xué)分析軟件分析，以期能夠解釋版納微型豬近交系豬弱精癥產(chǎn)生的原因。

1 材料與方法

1.1 材料

DNA純化試劑盒，購(gòu)自全式金生物技術(shù)有限公司；病毒總RNA/DNA提取試劑盒（TaKaRa MiniBEST Viral DNA/RNA Extraction Kit Ver.3.0）、RT-PCR一步法試劑盒、Taq酶、DL2000 DNA Marker、Competent Cell Preparation Kit，逆轉(zhuǎn)錄酶XL（AMV）、Ta-KaRa Ex TaqTM均購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì) 參考GenBank上豬CATSPER3的全基因序列設(shè)計(jì)的引物，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，擴(kuò)增的特異性片段長(zhǎng)度約為498 bp。引物序列為：5'-GCCTTCTTTACCCTCTTCAGC-3'；5'-AAGTATCAGGCTCGGCACAT-3'。

1.2.2 RNA的提取、cDNA合成 參照 RNA Plus的使用方法，從版納微型豬近交系睪丸組織中提取總RNA，經(jīng)過(guò)核酸蛋白測(cè)定儀檢測(cè)出總RNA的濃度和純度，根據(jù)測(cè)定的濃度將RNA稀釋成200 ng/μL，取5 μL進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，然后將檢測(cè)合格的RNA樣品反轉(zhuǎn)錄為cDNA，反轉(zhuǎn)錄體系（20 μL）：50 μmol/L oligo（dT）181 μL，總RNA 1 ng-5 μg，10 mmol/L dNTP 1 μL，加入滅菌蒸餾水至12 μL，混合后65℃加熱5 min，迅速冰浴冷卻；短暫離心后加入：5×first buffer 4 μL，0.1 mol/L的DTT 2 μL，recombiant RNase inhibitor 1 μL，輕輕將各組分混合，37℃孵育 2 min，室溫下加入1 μL reverse transcriptase M-ML，輕輕吹打混勻，37℃孵育5 min，70℃加熱15 min以終止反應(yīng)，產(chǎn)物置-20℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 CATSPER3基因PCR擴(kuò)增 PCR反應(yīng)體系25 μL：Premix Taq 13.0 μL，引物（10 pmol/μL）各1.5 μL，DNA模 板（25 ng/μL）1.5 μL， 加 ddH2O（高壓滅菌雙蒸水）補(bǔ)足至25 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃5 min；94℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 30 s，35個(gè)循環(huán)；72℃ 7 min，4℃保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，紫外凝膠成像系統(tǒng)（SYGENE，GeneGenius）中觀察分析并照像。

1.2.4 CATSPER3基因克隆 應(yīng)用全式金生物技術(shù)有限公司DNA純化回收試劑盒（離心柱型）進(jìn)行PCR產(chǎn)物純化（步驟參照說(shuō)明書(shū)），將純化后檢測(cè)正確的PCR產(chǎn)物連接入pMD18-T克隆載體，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布瓊脂糖平皿上，恒溫培養(yǎng)箱37℃過(guò)夜培養(yǎng)，進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，用白色吸頭挑取白色單克隆菌落，接種入LB液體培養(yǎng)基，37℃，200 r/min震蕩過(guò)夜培養(yǎng)，吸取微量過(guò)夜菌液進(jìn)行菌液PCR鑒定，檢測(cè)后送往上海生物工程技術(shù)有限公司測(cè)序。

1.2.5 CATSPER3基因序列的生物信息學(xué)分析 測(cè)序得到的結(jié)果用NCBI（National Center for Biotechnology Information）的Nucleotide Blast軟件檢驗(yàn)核苷酸的序列；然后用Generunr軟件預(yù)測(cè)出開(kāi)放閱讀框，并得到相應(yīng)的氨基酸序列；用在線分析軟件ExPASy-PrtPram tool分析CATSPER3基因編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)；通過(guò)NetNGlyc 1.0 Server預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)N-糖基化位點(diǎn)；通過(guò)NetOGlyc 4.0 Server預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)O-糖基化位點(diǎn)；通過(guò)NetPhos 2.0 Server預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)

磷酸化位點(diǎn)；通過(guò)SignalP 4.1 Server預(yù)測(cè)信號(hào)肽序列；通過(guò)TMpred server預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)中是否有跨膜結(jié)構(gòu)域；用SOPMA方法預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)；用Lasergene軟件分析核苷酸的同源性。

2 結(jié)果

2.1 CATSPER3基因擴(kuò)增結(jié)果

CATSPER3引物擴(kuò)增的特異性片段為498 bp，與預(yù)期片段大小一致（圖1）。測(cè)序結(jié)果與GenBank上豬CATSPER3基因序列比對(duì)，確定擴(kuò)增序列為BMI的CATSPER3基因序列。

圖1 CATSPER3引物擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果

2.2 CATSPER3基因序列生物信息學(xué)分析

用ExPASy ProtParam程序預(yù)測(cè)CATSPER3基因編碼蛋白分子量為19.397 3 kD，理論等電點(diǎn)為5.05；在氨基酸組成上，在氨基酸組成上，酸性氨基酸（Asp+Glu）有24個(gè)；堿性氨基酸（Lys+Arg）有16個(gè)；其中，亮氨酸（Leu）占13.3%、纈氨酸（Val）占9.6%、蘇氨酸（Thr）占9.0%、苯丙氨酸（Phe）占8.4%、谷氨酸（Glu）占7.2%、天冬氨酸（Asp）占7.2%等含量較高。CATSPER3蛋白質(zhì)不穩(wěn)定指數(shù)為39.46，屬于穩(wěn)定蛋白；脂溶指數(shù)為103.80，總的親水性平均系數(shù)（Grand average of hydropathicity，GRAVY）為0.020，具有弱親水性。采用SignalP 4.1對(duì)CATSPER3蛋白進(jìn)行預(yù)測(cè)（圖2）表明，CATSPER3蛋白沒(méi)有信號(hào)肽位點(diǎn)；用NetOGly 4.0和NetNGly 1.0進(jìn)行預(yù)測(cè)的結(jié)果表明，CATSPER3蛋白中不含有N-糖基化位點(diǎn)和O-糖基化位點(diǎn)。

NetPhos2.0預(yù)測(cè)（圖3）表明，CATSPER3蛋白存在7個(gè)磷酸化位點(diǎn)，其中3個(gè)絲氨酸（Ser）磷酸化位點(diǎn)（A29、A59、A139）、3個(gè)蘇氨酸（Thr）磷酸化位點(diǎn)（A74、A96、A115）、1個(gè)酪氨酸（Tyr）活性位點(diǎn)（A156）。CATSPER3的蛋白存在著較多的磷酸化位點(diǎn)，說(shuō)明磷酸化位點(diǎn)修飾對(duì)CATSPER3的蛋白活化起著重要作用。

圖2 CATSPER3蛋白跨膜信號(hào)肽位點(diǎn)預(yù)測(cè)

圖3 CATSPER3蛋白磷酸化位點(diǎn)推測(cè)圖

用SOPMA方法預(yù)測(cè)的CATSPER3蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)結(jié)果（圖4）顯示，參與α-螺旋的氨基酸有94個(gè)，含量達(dá)56.63%；有35個(gè)氨基酸參與延伸鏈，占21.08%；10個(gè)氨基酸可能參與β-轉(zhuǎn)角，占6.02%；27個(gè)氨基酸可能參與無(wú)規(guī)則卷曲，占16.27%。以上分析可推測(cè)，α-螺旋是CATSPER3蛋白的主要結(jié)構(gòu)。

測(cè)序結(jié)果經(jīng)GenBank上Nucleotide Blast，結(jié)果（圖5）顯示，在第970位核苷酸位置有一個(gè)堿基由G變成C，在第1 243位核苷酸位置有一個(gè)堿基由C變成T。測(cè)序獲得序列與參考序列推導(dǎo)氨基酸序列，結(jié)果（圖6）顯示，在核苷酸突變的位置氨基酸未改變，屬于無(wú)意義突變。

圖4 SOPMA程序預(yù)測(cè)BMI CATSPER3蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)

圖5 CATSPER3基因核苷酸序列比對(duì)

圖6 CATSPER3基因推導(dǎo)氨基酸序列比對(duì)

在NCBI中下載CATSPER3基因各物種的相關(guān)序列，通過(guò)lasergene軟件編輯格式，比對(duì)得出圖7，圖8。圖7顯示，版納微型豬近交系豬與普通豬核

苷酸相似度較近為99.6%，與山羊相似度較低為88.6%，從進(jìn)化樹(shù)圖8中也可以得出相似的結(jié)論，版納微型豬近交系豬與普通豬同處于一個(gè)分支中，而與山羊和綿羊在進(jìn)化樹(shù)中距離最遠(yuǎn)。

圖7 CATSPER3基因核苷酸相似度分析

圖8 CATSPER3基因系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析

3 討論

CatSper是睪丸內(nèi)生殖細(xì)胞中特異的離子型通道，定位于精子尾部鞭毛的主段，由于主段沒(méi)有細(xì)胞器，因此推測(cè) CATSPER1和 CATSPER2主要定位于主段的質(zhì)膜上，對(duì)鞭毛鞭打運(yùn)動(dòng)起調(diào)節(jié)作用；而 CATSPER3表達(dá)于精子頂體，可能參于精子頂體反應(yīng)和生殖調(diào)節(jié)［5］。Qi等［5］研究表明，CATSPER3也參與精子超活化的調(diào)控，且CATSPER1、CATSPER2、CATSPER3和CATSPER4四個(gè)蛋白都對(duì)受精有影響［6］。

本實(shí)驗(yàn)擴(kuò)增的序列長(zhǎng)度為498 bp，包含部分編碼區(qū)和部分非編碼區(qū)，對(duì)測(cè)序結(jié)果分析，在第970位和第1 243位核苷酸位置分別有一個(gè)堿基由G變成C和C變成T，但在該位置氨基酸卻沒(méi)有改變，屬于無(wú)意義突變。

在推導(dǎo)的氨基酸序列中無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)和信號(hào)肽，含有7個(gè)磷酸化位點(diǎn)，其中3個(gè)絲氨酸（Ser）磷酸化位點(diǎn)（A29、A59、A139）、3個(gè)蘇氨酸（Thr）磷酸化位點(diǎn)（A74、A96、A115）、1個(gè)酪氨酸（Tyr）活性位點(diǎn)（A156），推測(cè)可能在這一段序列推導(dǎo)的二級(jí)結(jié)構(gòu)中，磷酸化位點(diǎn)對(duì)其的修飾和調(diào)控作用占主要方面；參與α-螺旋的氨基酸有94個(gè)，含量達(dá)到56.63%；有35個(gè)氨基酸參與延伸鏈，占21.08%；10個(gè)氨基酸可能參與β-轉(zhuǎn)角，占6.02%；27個(gè)氨基酸可能參與無(wú)規(guī)則卷曲，占16.27%。推測(cè)α-螺旋是該段推導(dǎo)CATSPER3蛋白的主要結(jié)構(gòu)。核苷酸相似度的比較中與普通豬相似度最高，與山羊相似度較低，這與楊媛媛［7］的研究結(jié)果一致，CATSPER3在進(jìn)化上比較保守，核苷酸物種間相似性較高；在親緣關(guān)系上與普通豬同處于一個(gè)分支，親緣關(guān)系較近，與山羊和綿羊親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，與預(yù)期結(jié)果一致。

4 結(jié)論

成功擴(kuò)增了CATSPER3基因部分編碼區(qū)序列，特異性片段為498 bp。版納微型豬近交系豬與非近交系豬核苷酸相似度為99.6%，與山羊相似度為88.6%。版納微型豬近交系豬與非近交系豬同處一個(gè)分支，親緣關(guān)系較近，與山羊和綿羊親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

［1］Darszon A, Acevedo JJ, Galindo BE, et al. Sperm channel diversity and functional multiplicity［J］. Reproduction, 2006, 131（6）：77-88.

［2］Inaba K. Molecular architecture of the sperm flagella：molecules for motility and signaling［J］. Zoolog Sci, 2003, 20（9）：1043-1056.

［3］Liu J, Xia J, Cho KH, et al. CatSperbeta, a novel transmembrane protein in the CatSper channel complex［J］. J Biol Chem, 2007, 282（26）：18945-18952.

［4］Wang H, Liu J, Cho KH, Ren D. A novel, single, transmembrane protein CATSPERG is associated with CATSPERI channel protein［J］. Biol Reprod, 2009, 81（3）：539-544.

［5］Jin JL, O’Doherty AM, Wang S, et al. Catsper3 and catsper4 encode two canon channel-like proteins exclusively expressed in the testis［J］. Biol Reprod, 2005, 73（6）：1235-1242.

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［7］楊媛媛, 王根林. 精子超活化結(jié)構(gòu)蛋白-Catsper表達(dá)特性的研究［D］. 南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué), 2006.

（責(zé)任編輯 李楠）

Cloning，Sequence and Phylogenetic Analysis of CATSPER3 Gene in Banna Mini-pig Inbred Line

XIAO Jing1ZHA Xing-qin1，2CHENG Wen-min1，2HUO Jin-long1，2PAN Wei-rong1，2WANG Shu-yan1，2WANG Pei1，2LIU Hai-jing2ZHANG Xiu-qiong2ZENG Yang-zhi2
（1. Faculty of Animal Science and Technology，Yunnan Agricultural University，Kunming 650201；2. Key Laboratory of Banna Mini-pig Inbred Line of Yunnan Province，Yunnan Agricultural University，Kunming 650201）

Our purpose of this work is to obtain the partial coding region sequences of CATSPER3 gene from Banna Mini-pig Inbred Line（BMIL），and to analyze the amino acid sequence and homology comparison among different species by bioinformatics. We used boar testis material of BMIL to extract RNA，RT-PCR to amplify the coding sequence of CATSPER3 gene，and online analysis software to analyze the bioinformatics. Bioinformatics analysis showed that the protein molecular weight of deduced amino acid sequence was 19.397 3 kD and theoretical isoelectric point was 5.05. Regarding the composition of amino acid，there were 24 acidic amino acids（Asp and Glu）；and there were 16 alkaline amino acid（Lys+Arg）；among them the leucine（Leu）accounted for 13.3%，valine（Val）9.6%，threonine（Thr）9.0%，phenylalanine（Phe）8.4%，glutamate（Glu）7.2%，aspartic acid（Asp）7.2%，and their contents were high. Compared with ordinary pig，the nucleotide similarity was the highest，however，lower with that of goat. Molecular phylogenetic tree showed that inbred pig and noninbred pig clustered in the same branch，i.e.，their genetic relationship was close，while far from goat and sheep.

Banna Mini-pig Inbred Line；CATSPER3 gene；phylogenetic analysis

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.12.017

2016-01-11

云南省教育廳科學(xué)研究基金項(xiàng)目（2014Y212）

肖晶，男，碩士，研究方向：分子生物學(xué)研究，E-mail：xiaojingjing525@163.com；查星琴為本文并列第一作者

潘偉榮，男，碩士，研究方向：胚胎生物技術(shù)；E-mail： pwr2000@sina.com