吳家兵，楊永堅(jiān)，王先良，葉丹，楊文靜，錢(qián)巖，呂占祿，郭辰，梁豹，趙淑莉

1. 安徽醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院勞動(dòng)衛(wèi)生與環(huán)境衛(wèi)生系，合肥 230032 2. 中國(guó)環(huán)境科學(xué)研究院環(huán)境基準(zhǔn)與風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100012 3. 中國(guó)疾病預(yù)防控制中心環(huán)境與健康相關(guān)產(chǎn)品安全所，北京 100050 4. 中國(guó)環(huán)境監(jiān)測(cè)總站，北京 100029

?

鉛對(duì)人Bel-7402肝癌細(xì)胞毒性及EGFP基因DNA甲基化的影響

吳家兵1,2，楊永堅(jiān)1,*，王先良2,3,#，葉丹3，楊文靜3，錢(qián)巖2，呂占祿2，郭辰2，梁豹1,2，趙淑莉4

1. 安徽醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院勞動(dòng)衛(wèi)生與環(huán)境衛(wèi)生系，合肥 230032 2. 中國(guó)環(huán)境科學(xué)研究院環(huán)境基準(zhǔn)與風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100012 3. 中國(guó)疾病預(yù)防控制中心環(huán)境與健康相關(guān)產(chǎn)品安全所，北京 100050 4. 中國(guó)環(huán)境監(jiān)測(cè)總站，北京 100029

以體外培養(yǎng)人Bel-7402肝癌細(xì)胞為模型，研究鉛的3種常見(jiàn)化合物氯化鉛(PbCl2)、乙酸鉛(Pb(CH3COO)2)、硝酸鉛(Pb(NO3)2)的細(xì)胞毒性和去甲基化表觀遺傳毒性。應(yīng)用MTS方法檢測(cè)細(xì)胞的存活率，以前期研究建立的評(píng)價(jià)方法評(píng)價(jià)鉛化合物的去甲基化表觀遺傳毒性。結(jié)果顯示，PbCl2、Pb(CH3COO)2、Pb(NO3)2均會(huì)抑制Bel-7402細(xì)胞的增值，計(jì)算求得PbCl2、Pb(CH3COO)2、Pb(NO3)2相應(yīng)的50%細(xì)胞存活濃度(IC50)值分別為2 524 μmol·L-1、1 977 μmol·L-1、1 899 μmol·L-1；80%細(xì)胞存活濃度(IC80)值分別為264 μmol·L-1、221 μmol·L-1、281 μmol·L-1，通過(guò)對(duì)3種染毒物不同染毒濃度的細(xì)胞存活率進(jìn)行隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)的方差分析顯示3種化合物間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F= 0.11；P= 0.897)。去甲基化表觀遺傳毒性檢測(cè)結(jié)果顯示，PbCl2、Pb(CH3COO)2、Pb(NO3)2均可觀察到明顯的去甲基化表觀遺傳毒性，其相對(duì)于5-氮雜-2-脫氧胞苷(5-Aza-CdR)的去甲基化表觀遺傳毒性當(dāng)量分別為2.82E-03、1.50E-03、5.09E-04，三者間也無(wú)顯著性差異。結(jié)果表明，鉛化合物會(huì)使Bel-7402細(xì)胞的細(xì)胞存活率和轉(zhuǎn)染進(jìn)細(xì)胞的質(zhì)粒上增強(qiáng)型綠色熒光蛋白基因啟動(dòng)子的DNA甲基化水平下降。

鉛；Bel-7402細(xì)胞；去甲基化；MTS

Received 23 September 2015 accepted 28 October 2015

環(huán)境化合物引起的健康損害與表觀遺傳損傷關(guān)系密切，表觀遺傳毒性是化學(xué)品安全性評(píng)價(jià)的新問(wèn)題[1]。研究發(fā)現(xiàn)許多通過(guò)現(xiàn)有安全性評(píng)價(jià)檢測(cè)的化合物，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)存在基因突變、染色體畸變等遺傳學(xué)損傷能力，卻依然可以通過(guò)表觀遺傳學(xué)機(jī)制對(duì)人類(lèi)產(chǎn)生深遠(yuǎn)影響[2]。而鉛作為環(huán)境中普遍存在的有毒重金屬，可造成人體多種組織和器官的損害，低劑量接觸就可引起各種亞臨床改變?nèi)绨柶澓Ｄ3]、精神發(fā)育遲滯等[4]。有研究顯示我國(guó)兒童鉛暴露所致精神發(fā)育遲滯的發(fā)病率遠(yuǎn)高于西太平洋地區(qū)的平均水平[5]。因此，評(píng)價(jià)鉛及其化合物的表觀遺傳毒性是其安全性評(píng)價(jià)面臨的新問(wèn)題。近年來(lái)，隨著檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)鉛暴露誘發(fā)的表觀遺傳學(xué)改變，特別是致DNA甲基化異常的研究取得了一些進(jìn)展，但對(duì)其致基因組DNA甲基化改變大小的定量評(píng)價(jià)還未見(jiàn)報(bào)道[6]。而不管是體內(nèi)實(shí)驗(yàn)還是體外實(shí)驗(yàn)，了解環(huán)境化學(xué)物對(duì)于人類(lèi)甲基化水平的作用能力大小，對(duì)豐富化學(xué)物的潛在毒性評(píng)價(jià)信息以及安全性評(píng)價(jià)體系的建立和標(biāo)準(zhǔn)的制定均有重要的參考價(jià)值。有專(zhuān)家已經(jīng)開(kāi)始認(rèn)識(shí)到定量檢測(cè)環(huán)境化合物去甲基化表觀遺傳毒性的重要性[7-8]。

本研究中我們選擇了3種鉛的常見(jiàn)化合物乙酸鉛、硝酸鉛、氯化鉛為研究對(duì)象，以體外培養(yǎng)人Bel-7402肝癌細(xì)胞為模型。分別應(yīng)用MTS方法檢測(cè)細(xì)胞的存活率和通過(guò)前期研究建立的化學(xué)物去甲基化表觀遺傳毒性評(píng)價(jià)方法(簡(jiǎn)稱(chēng)QDMP)[9-12]檢測(cè)其去甲基化表觀遺傳毒性，去甲基化表觀遺傳毒性評(píng)價(jià)結(jié)果以去甲基化藥物5-Aza-CdR的濃度當(dāng)量表示。該方法是將pEGFP-C3質(zhì)粒通過(guò)人工甲基化處理，獲得綠色熒光蛋白基因啟動(dòng)子區(qū)處于高甲基化狀態(tài)的C3質(zhì)粒，并將其轉(zhuǎn)染進(jìn)人類(lèi)Bel-7402肝癌細(xì)胞株，隨后以該細(xì)胞株為載體，與染毒液進(jìn)行共培養(yǎng)，依據(jù)細(xì)胞綠色熒光強(qiáng)度來(lái)定量評(píng)價(jià)去甲基化功能的強(qiáng)弱，是對(duì)污染物表觀遺傳毒性評(píng)價(jià)技術(shù)的新探索。

1 材料與方法 (Materials and methods)

1.1 儀器與試劑

主要儀器：BIO-PRINT008型凝膠成像系統(tǒng)(Vilberlo urmat，法國(guó))；高速離心機(jī)(Sigma 3K30 centrifuge，Sigma，美國(guó))；流式細(xì)胞儀(Bechman Coulter Altra，美國(guó))；水套式CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo，美國(guó))；生物安全柜(Thermo，美國(guó))；Model680酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(Bio-RAD，美國(guó))；IX71型熒光倒置顯微鏡(Olympus，日本)；

主要試劑：Bel-7402細(xì)胞株和大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞由北京工業(yè)大學(xué)提供；Plasid maxi kit試劑盒(QIAGEN，美國(guó))；DNA Fragment Purification Kit Ver.2.0(Sigma，美國(guó))；p-EGFP-C3質(zhì)粒(Sigma，美國(guó))；乙酸鉛、硝酸鉛、氯化鉛(分析純，中國(guó)西亞試劑公司)；DNA甲基化酶M.SssI、HpaII酶、MspI酶(New England Biolabs公司，美國(guó))；X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent(Roche，美國(guó))；500～7 500 bp DNA Marker(北京天根公司)。

1.2 鉛化合物的細(xì)胞毒性檢測(cè)

1.2.1 MTS實(shí)驗(yàn)

獲取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期生長(zhǎng)良好的Bel-7402細(xì)胞，以每孔2×104個(gè)細(xì)胞接種于96孔板，每孔100 μL進(jìn)行細(xì)胞鋪板培養(yǎng)。移入細(xì)胞培養(yǎng)箱中以37 ℃、5% CO2條件培養(yǎng)，待細(xì)胞匯合度達(dá)80%～90%時(shí)進(jìn)行細(xì)胞染毒。將已配好的終濃度染毒溶液臨用前超聲5 min，用無(wú)血清培養(yǎng)基配制所需各濃度的染毒液于1 mL EP管中(根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)和相關(guān)文獻(xiàn)[13-15]將染毒濃度定為0、50、100、200、400 μmol·L-1)，棄去培養(yǎng)板中原培養(yǎng)液，以100 μL每孔加入已配好的各濃度染毒液，每個(gè)染毒濃度設(shè)6個(gè)平行樣，染毒培養(yǎng)24 h。細(xì)胞染毒結(jié)束前1 h以20 μL每孔加入MTS，而后用錫箔紙包好置于細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)，繼續(xù)培養(yǎng)1 h后用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在490 nm波長(zhǎng)下測(cè)吸光度。

1.2.2 數(shù)據(jù)分析處理

對(duì)各染毒化合物進(jìn)行MTS實(shí)驗(yàn)后，計(jì)算細(xì)胞存活率(細(xì)胞存活率=(OD實(shí)驗(yàn)組-OD調(diào)零孔)/(OD對(duì)照孔-OD調(diào)零孔)×100%)。而后參考趙斌等[16]和王姍姍等[17]提到的方法，應(yīng)用SPSS軟件求得PbCl2、Pb(CH3COO)2、Pb(NO3)2的半數(shù)抑制濃度IC50和80%抑制濃度IC80。

1.3 鉛化合物的去甲基化能力檢測(cè)

1.3.1 高甲基化pEGFP-C3質(zhì)粒的獲取

(1) pEGFP-C3質(zhì)粒的擴(kuò)增：參照江艷等[18]使用的方法對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行擴(kuò)增。(2) pEGFP-C3質(zhì)粒的提?。阂罁?jù)Plasid maxi kit試劑盒(QIAGEN)的操作說(shuō)明對(duì)擴(kuò)增好的質(zhì)粒進(jìn)行提取。(3) pEGFP-C3質(zhì)粒的甲基化修飾及純化：參照甲基化酶M.SssI說(shuō)明書(shū)(New England Biolabs)對(duì)提取好的質(zhì)粒進(jìn)行甲基化修飾處理，并用HpaⅡ酶切檢測(cè)甲基化修飾處理效果，未甲基化DNA雙鏈的去除和甲基化DNA的純化按照Wang等[19]和MicroElute DNA Clean-Up Kit試劑盒(OMEGA)的操作說(shuō)明進(jìn)行。最后用微量分光光度計(jì)測(cè)定C3質(zhì)粒的濃度，-20 ℃冷藏備用。1.3.2 高甲基化的pEGFP-C3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Bel-7402細(xì)胞株

Bel-7402細(xì)胞傳代培養(yǎng)后，轉(zhuǎn)入24孔培養(yǎng)板培養(yǎng)(鋪板密度為每毫升2.0×105個(gè)細(xì)胞)，每孔加500 μL含10%胎牛血清和1%雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)，待細(xì)胞匯合度達(dá)80%～90%時(shí)，根據(jù)X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent轉(zhuǎn)染試劑盒說(shuō)明書(shū)(Roche)，F(xiàn)ugene HD和甲基化C3質(zhì)粒以3:1比例配制轉(zhuǎn)染試劑混合物。每孔加入相應(yīng)轉(zhuǎn)染試劑混合物50 μL，轉(zhuǎn)染6 h。

1.3.3 以經(jīng)高甲基化pEGFP-C3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的Bel-7402細(xì)胞株為受試對(duì)象進(jìn)行染毒

細(xì)胞轉(zhuǎn)染6 h后進(jìn)行染毒。根據(jù)MTS實(shí)驗(yàn)的結(jié)果確定各化合物的染毒濃度為3.125、12.5、50、200 μmol·L-1，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)平行孔。同時(shí)每組實(shí)驗(yàn)中均要以5-Aza-CdR為陽(yáng)性受試物進(jìn)行細(xì)胞梯度劑量共培養(yǎng)染毒處理，用以繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，通過(guò)前期實(shí)驗(yàn)[10]確定5-Aza-CdR的染毒濃度為 0、0.00016、0.0008、0.004、0.02、0.1 μmol·L-1，每個(gè)濃度同樣設(shè)3個(gè)平行孔。細(xì)胞染毒時(shí)間均為24 h。

1.3.4 細(xì)胞染毒后的熒光差異檢測(cè)

胰酶消化細(xì)胞，離心棄掉上清液后用冷的PBS重懸細(xì)胞2次，經(jīng)300目篩網(wǎng)過(guò)濾后移至流式管，用CELL Quest軟件進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)分析。

1.3.5 基于5-Aza-CdR染毒標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制作

對(duì)染毒濃度為0、0.00016、0.0008、0.004、0.02、0.1 μmol·L-1的5-AZA-CdR進(jìn)行流式熒光檢測(cè)，獲得各濃度的熒光陽(yáng)性細(xì)胞比例，再求出各濃度相對(duì)于空白對(duì)照孔增加的熒光陽(yáng)性細(xì)胞比例，以所得值為縱坐標(biāo)、相應(yīng)染毒濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。以相同方法獲得各重金屬化合物相對(duì)于空白染毒孔增加的熒光陽(yáng)性細(xì)胞比例，將此值作為y值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程中求出相應(yīng)的x，以此x除以其對(duì)應(yīng)的重金屬化合物濃度所得值即為各重金屬化合物相應(yīng)濃度去甲基化能力相對(duì)于5-AZA-CdR的當(dāng)量值。最后計(jì)算它們的幾何均數(shù)，所得結(jié)果即是各重金屬化合物去甲基化能力相對(duì)于5-AZA-CdR的當(dāng)量值。

1.4 分析方法

數(shù)據(jù)采用SPSS for windows 10.0進(jìn)行均數(shù)檢驗(yàn)、相關(guān)分析、回歸分析等統(tǒng)計(jì)處理，曲線(xiàn)擬合采用Excel軟件。

圖1 C3質(zhì)粒甲基化處理效果檢測(cè)注：1，陰性對(duì)照；2，未甲基化處理質(zhì)粒MspΙ酶切；3，未甲基化處理質(zhì)粒HpaⅡ酶切；4，甲基化處理質(zhì)粒MspΙ酶切；5，甲基化處理質(zhì)粒HpaⅡ酶切；6，DNA Marker。Fig. 1 Methylation effects for C3 plasmidNote: 1. negative control; 2. unmethylation control; 3. unmethylation control; 4. methylated plasmid of enzyme by MspΙ; 5. methylated plasmid of enzyme by HpaⅡ; 6. DNA marker.

2 結(jié)果(Results)

2.1 pEGFP-C3質(zhì)粒甲基化處理效果

由圖1可見(jiàn)，未甲基化處理的質(zhì)粒分別經(jīng)HpaII和MspI酶切后電泳呈現(xiàn)涂抹現(xiàn)象，甲基化處理的質(zhì)粒經(jīng)MspI酶切后電泳呈涂抹現(xiàn)象，而經(jīng)HpaⅡ酶切后與未經(jīng)酶切的DNA一樣均呈單一條帶，提示經(jīng)甲基化處理的質(zhì)粒處于甲基化狀態(tài)。HpaII和MspI酶切效果比對(duì)甲基化處理完全。提示經(jīng)甲基化處理的質(zhì)粒處于甲基化狀態(tài)。

2.2 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)前面提到的方法分別計(jì)算出各化合物各染毒濃度的細(xì)胞存活率后發(fā)現(xiàn)，隨著染毒濃度的增加，Bel-7402細(xì)胞的細(xì)胞存活率均呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)，并與染毒濃度間有良好的線(xiàn)性關(guān)系，表明鉛的這3種化合物均會(huì)抑制Bel-7402細(xì)胞的增值。應(yīng)用SPSS軟件求得PbCl2、Pb(CH3COO)2、Pb(NO3)2的IC50值分別為2 524、1 977、1 899 μmol·L-1，IC80值分別為264、221、281 μmol·L-1。通過(guò)對(duì)3種染毒物不同染毒濃度的細(xì)胞存活率進(jìn)行隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)的方差分析顯示3種化合物間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F= 0.11；P= 0.897)，詳細(xì)結(jié)果見(jiàn)圖2。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)結(jié)果，為保證具有適當(dāng)?shù)募?xì)胞存活率，選擇細(xì)胞存活率在80%以上的濃度作為各個(gè)鉛化合物的染毒劑量，分別是3.125、12.5、50、200 μmol·L-1。

圖2 鉛的3種化合物PbCl2、Pb(CH3COO)2、Pb(NO3)2對(duì)Bel-7402細(xì)胞存活率的影響Fig. 2 Changes in cell viability in Bel-7402 cells after exposure to lead compounds PbCl2，Pb(CH3COO)2，Pb(NO3)2

圖3 代表性5-Aza-CdR流式細(xì)胞綠色熒光檢測(cè)圖注：從左到右各圖的5-Aza-CdR濃度分別為0、0.00016、0.0008、0.004、0.02、0.1 μmol·L-1。Fig. 3 Representative radiograph of detection effect on green fluorescence of flow cytometryNote: The exposure dose of 5-Aza-CdR from left to right were 0, 0.00016, 0.0008, 0.004, 0.02, 0.1 μmol·L-1.

2.3 各染毒化合物的去甲基化情況

2.3.1 5-Aza-CdR染毒標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)制作

依據(jù)上述方案用CELL Quest軟件，以DNA熒光寬度為橫坐標(biāo)，GFP熒光陽(yáng)性率為縱坐標(biāo)(擬定對(duì)照組80%百分位數(shù)的GFP強(qiáng)度為GFP表達(dá)陽(yáng)性基準(zhǔn))，進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)分析(檢查通道為FL1，設(shè)置為log)。得出2組甲基化能力測(cè)試5-Aza-CdR染毒標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程分別為y= 0.279ln(x) +4.764和y= 0.314ln(x) +9.285，其代表性5-Aza-CdR流式細(xì)胞綠色熒光檢測(cè)圖及相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)如圖3及圖4所示。結(jié)果顯示，5-Aza-CdR各染毒組的熒光陽(yáng)性細(xì)胞比例均高于空白對(duì)照組，且隨著染毒濃度的上升，各組的熒光陽(yáng)性細(xì)胞比例也隨之上升，呈現(xiàn)良好的對(duì)數(shù)線(xiàn)性關(guān)系。

圖4 代表性5-Aza-CdR流式細(xì)胞綠色熒光檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)Fig. 4 Representative graph of 5-Aza-CdR exposure standard curve for detection by green fluorescence of flow cytometry

2.3.2 鉛化合物的表觀遺傳毒性檢測(cè)結(jié)果

通過(guò)檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)，在熒光陽(yáng)性細(xì)胞比例方面，PbCl2、Pb(NO3)2、Pb(CH3COO)2的各染毒濃度組熒光陽(yáng)性細(xì)胞比例均高于空白對(duì)照組，但各染毒濃度組間的比較顯示均無(wú)顯著性差異，表明鉛的這3種化合物在所研究的濃度范圍內(nèi)均具有去甲基化表觀遺傳毒性。在相對(duì)于5-Aza-CdR的去甲基化當(dāng)量方面，如表1所示，在(3.125～200) μmol·L-1的染毒濃度范圍內(nèi)，Pb(CH3COO)2的去甲基化表觀遺傳毒性當(dāng)量介于8.15E-05～4.85E-03的5-Aza-CdR之間；Pb(NO3)2去甲基化表觀遺傳毒性當(dāng)量介于7.08E-05～2.84E-02的5-Aza-CdR之間；PbCl2去甲基化表觀遺傳毒性當(dāng)量介于2.17E-04～2.15E-01的5-Aza-CdR之間。這3種染毒物去甲基化當(dāng)量幾何均值從小到大依次為PbCl2> Pb(NO3)2> Pb(CH3COO)2。通過(guò)對(duì)這3種染毒物的去甲基化表觀遺傳毒性當(dāng)量值進(jìn)行方差分析后顯示，F(xiàn)= 0.855，P= 0.457。表明鉛的3種化合物相對(duì)于5-Aza-CdR的去甲基化當(dāng)量之間的差異沒(méi)有顯著性。

3 討論(Discussion)

開(kāi)展環(huán)境污染物的毒性效應(yīng)綜合評(píng)價(jià)是未來(lái)環(huán)境污染管理不可避免的關(guān)鍵科學(xué)問(wèn)題，到目前為止，已經(jīng)開(kāi)展的健康危害評(píng)價(jià)涵蓋急性毒性評(píng)價(jià)和慢性毒性評(píng)價(jià)等方面。而以去甲基化能力為代表的表觀遺傳毒性則并沒(méi)有得到足夠重視，但這種新型的表觀遺傳毒性在環(huán)境中更為廣泛，比“三致”毒性更容易出現(xiàn)[20]。因此，評(píng)價(jià)環(huán)境化合物的去甲基化能力是化學(xué)品安全性評(píng)價(jià)面臨的新問(wèn)題，有專(zhuān)家已經(jīng)開(kāi)始認(rèn)識(shí)到定量檢測(cè)去甲基化表觀遺傳毒性的重要性[7-8]。

表1 各化合物相對(duì)于5-Aza-CdR的去甲基化當(dāng)量情況

Table 1 Toxic equivalent quantity of each compounds (based on 5-Aza-CdR demethylation)

注：Pb(NO3)2、Pb(CH3COO)2組所對(duì)應(yīng)的5-Aza-CdR標(biāo)準(zhǔn)方程為y = 0.279ln(x) +4.764，R2=0.946；PbCl2組對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)方程為y = 0.314ln(x) +9.285，R2= 0.883。

Note:The corresponding 5-Aza-CdR standard equation of Pb(NO3)2and Pb(CH3COO)2are “y = 0.279ln(x) +4.764, R2=0.946”; the corresponding 5-Aza-CdR standard equation of PbCl2is “y = 0.314ln(x) +9.285, R2= 0.883”.

鉛是一種在細(xì)胞內(nèi)不能被代謝轉(zhuǎn)化降解的有毒重金屬，但其可與DNA形成加合物，從而對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生影響。在細(xì)胞研究方面，徐進(jìn)等[21]發(fā)現(xiàn)鉛能導(dǎo)致大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞損傷，包括細(xì)胞凋亡率和壞死率的增加；王秋菊等[15]發(fā)現(xiàn)鉛可致C2C12成肌細(xì)胞發(fā)生凋亡損傷；還有研究顯示鉛暴露會(huì)抑制神經(jīng)細(xì)胞SH-SY5Y的增值[22]。本研究應(yīng)用體外培養(yǎng)Bel-7402細(xì)胞從DNA甲基化改變和凋亡損傷的角度闡釋了鉛對(duì)癌細(xì)胞的損害作用。通過(guò)比較發(fā)現(xiàn)，在相同染毒濃度時(shí)，Bel-7402肝癌細(xì)胞的細(xì)胞存活率均高于上述幾種非癌細(xì)胞。

近年來(lái)，隨著DNA甲基化檢測(cè)技術(shù)的持續(xù)發(fā)展和不斷完善，越來(lái)越多的體外細(xì)胞試驗(yàn)、動(dòng)物試驗(yàn)及人群流行病學(xué)研究表明，鉛暴露會(huì)改變基因組DNA和某些基因啟動(dòng)子區(qū)胞嘧啶的甲基化水平[6]。本次實(shí)驗(yàn)以人Bel-7402肝癌細(xì)胞為載體，通過(guò)以5-Aza-CdR為參照標(biāo)準(zhǔn)，獲得了鉛的這3種化合物相對(duì)于5-Aza-CdR的去甲基化能力當(dāng)量值，實(shí)驗(yàn)中經(jīng)過(guò)鉛化合物染毒后，染毒組的熒光陽(yáng)性細(xì)胞比例均低于空白對(duì)照組，表明鉛暴露可使重組Bel-7402細(xì)胞中質(zhì)粒上EGFP基因啟動(dòng)子的甲基化水平降低，顯示其去甲基化表觀遺傳毒性。但與濃度間并無(wú)良好的線(xiàn)性關(guān)系，這與王麗君[22]和Rossiello等[23]的細(xì)胞研究結(jié)果類(lèi)似。而通過(guò)對(duì)它們的細(xì)胞抑制率和去甲基化能力當(dāng)量值的比較發(fā)現(xiàn)，各化合物間并無(wú)顯著性差異，提示鉛的各化合物對(duì)細(xì)胞增殖的影響和去甲基化能力大小可能并不隨其陰離子類(lèi)型的變化而產(chǎn)生顯著性的改變。

研究進(jìn)一步豐富了人們對(duì)鉛化合物毒性的認(rèn)識(shí)，對(duì)安全性評(píng)價(jià)體系的建立和標(biāo)準(zhǔn)的制定也有重要的參考價(jià)值。但本實(shí)驗(yàn)中僅對(duì)單一鉛化合物的細(xì)胞毒性及表觀遺傳改變進(jìn)行了研究，而環(huán)境中的污染狀況多以多種污染物并存的復(fù)合污染為主，所以探究多種污染物并存的復(fù)合表觀遺傳毒性還有待我們進(jìn)一步研究。

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◆

Lead Toxicity to Human Liver Cancer Cells Bel-7402 and Their Effect on DNA Methylation Levels at Promoter Region of EGFP Gene

Wu Jiabing1,2, Yang Yongjian1,*, Wang Xianliang2,3,#, Ye Dan3, Yang Wenjing3, Qian Yan2, Lv Zhanlu2, Guo Chen2, Liang Bao1,2, Zhao Shuli4

1. School of Public Health, Anhui Medical University, Hefei 230032, China 2. State Key Laboratory of Environmental Criteria and Risk Assessment, Chinese Research Academy of Environmental Sciences, Beijing 100012, China3. Institute of Environmental Health and Related Product Safety, Chinese Center for Disease Control and Prevention, Beijing 100050, China 4. China National Environmental Monitoring Center, Beijing 100029, China

Human liver cancer Bel-7402 cells were used to estimate the cell toxicity and demethylation toxicity of 3 lead compounds including lead chloride (PbCl2), lead acetate (Pb(CH3COO)2) and lead nitrate (Pb(NO3)2). Cell viability was estimated firstly by MTS assay, and the demethylation toxicity of lead compounds was quantified by the method established and reported in earlier study. The results showed PbCl2, Pb(CH3COO)2and Pb(NO3)2all significantly inhibited the Bel-7402 cell proliferation and the IC50values were 2 524 μmol·L-1, 1 977 μmol·L-1, 2 524 μmol·L-1; the IC80values were 264 μmol·L-1, 221 μmol·L-1, 281 μmol·L-1. There was no significant difference of cell viability among 3 cell groups treated with different lead compounds (F= 0.11; P= 0.897). However significant epigenetic demethylation toxicity was observed for 3 compounds and their demethylation toxicity equivalency was 2.82E-03, 1.50E-03 and 5.09E-04 folds of 5-AZA-CdR, respectively. No significant difference was observed among their demethylation toxicity equivalency. The study revealed that lead compounds can inhibit Bel-7402 cell proliferation and induce obvious demethylation effect on DNA methylation levels at promoter region of EGFP gene.

lead; Bel-7402 cells; demethylation; MTS

10.7524/AJE.1673-5897.20150923001

國(guó)家環(huán)保公益性行業(yè)科研專(zhuān)項(xiàng)(201309045)；國(guó)家自然科學(xué)基金(20907047)；國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展(973)計(jì)劃(2012CB525005)

吳家兵(1989-)，男，碩士研究生，研究方向?yàn)槁殬I(yè)環(huán)境毒理學(xué)，E-mail：wujiabing159@sina.cn

*通訊作者(Corresponding author)， E-mail: yyj580719@163.com

2015-09-23 錄用日期：2015-10-28

1673-5897(2016)2-708-07

X171.5

A

簡(jiǎn)介：楊永堅(jiān)(1958-)，男，學(xué)士，教授，主要從事環(huán)境與職業(yè)衛(wèi)生研究，公開(kāi)發(fā)表學(xué)術(shù)論文50余篇。

吳家兵, 楊永堅(jiān), 王先良, 等. 鉛對(duì)人Bel-7402肝癌細(xì)胞毒性及EGFP基因DNA甲基化的影響[J]. 生態(tài)毒理學(xué)報(bào)，2016, 11(2): 708-714

Wu J B, Yang Y J, Wang X L, et al. Lead toxicity to human liver cancer cells Bel-7402 and their effect on DNA methylation levels at promoter region of EGFP gene [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2016, 11(2): 708-714 (in Chinese)

# 共同通訊作者(Co-corresponding author )， E-mail: xlwang@craes.org.cn