聶芳紅，蔡吉榛，王小寧，林紅英，Ravi Gooneratne，Anthony Hay，馬驛，巨向紅，鄭錦慶，陳進軍,*

1. 廣東海洋大學食品科技學院，湛江 524088 2. 廣東海洋大學農(nóng)學院，湛江 524088 3. 林肯大學農(nóng)業(yè)與生命學院，基督城 7647，新西蘭 4. 康奈爾大學農(nóng)業(yè)與生命科學學院，伊薩卡 14853，美國

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近海沉積物DlPCBs對斑馬魚胚胎EROD和cyp1a mRNA的影響

聶芳紅1，蔡吉榛2，王小寧2，林紅英2，Ravi Gooneratne3，Anthony Hay4，馬驛2，巨向紅2，鄭錦慶2，陳進軍2,*

1. 廣東海洋大學食品科技學院，湛江 524088 2. 廣東海洋大學農(nóng)學院，湛江 524088 3. 林肯大學農(nóng)業(yè)與生命學院，基督城 7647，新西蘭 4. 康奈爾大學農(nóng)業(yè)與生命科學學院，伊薩卡 14853，美國

為探究湛江近海域海洋沉積物中類二噁英多氯聯(lián)苯(dioxin-like polychlorinated biphenyls, DlPCBs)的生物學毒性效應，選取湛江近海域2個地點(近工業(yè)區(qū)TS和近生活區(qū)JSW)采集沉積物樣品，制備近海域沉積物DlPCBs提取物，將斑馬魚胚胎暴露于不同濃度的DlPCBs提取物，測定斑馬魚胚胎7-乙氧基異吩惡唑脫乙基酶(ethoxyresorufin-O-deethylase, EROD)活性和cyp1a mRNA相對表達量。結果發(fā)現(xiàn)，JSW采樣點DlPCBs提取物染毒組EROD酶活性變化與TS采樣點DlPCBs提取物一致，在各染毒濃度下，斑馬魚仔魚EROD酶活性為對照組的1.1～1.8倍。TS和JSW采樣點不同濃度DlPCBs提取物暴露斑馬魚胚胎96 h后，使斑馬魚仔魚cyp1a mRNA相對表達量是對照組的3.36～19.45倍。說明一定濃度的近海沉積物DlPCBs能誘導斑馬魚仔魚EROD酶活性和cyp1a mRNA表達量升高，且呈現(xiàn)濃度-效應關系。

類二噁英多氯聯(lián)苯；斑馬魚胚胎；EROD酶；cyp1a mRNA；近海沉積物

類二噁英多氯聯(lián)苯(dioxin-like polychlorinated biphenyls, DlPCBs)來源廣泛，具有強毒性、生物蓄積性、全球遷移性等特點，未來很長時間內(nèi)將是動物和人類健康安全的巨大隱患。海洋沉積物是DlPCBs的重要蓄積地，經(jīng)過生物富集而大量存在于魚類體內(nèi)，污染蛋白類飼料原料，最終通過食物鏈污染進入動物及人體內(nèi)[1-2]。斑馬魚(Danio rerio)是毒理學與藥理學的優(yōu)良模式實驗動物[3-4]。本研究提取凈化近海域沉積物中DlPCBs，利用斑馬魚胚胎活體EROD酶活性測定法和熒光定量PCR技術，探索DlPCBs提取物對斑馬魚胚胎EROD酶活性和cyp1a mRNA相對表達量的影響，為利用斑馬魚胚胎CYP1A進行DlPCBs污染的生物檢測提供試驗依據(jù)。

1 材料與方法 (Materials and methods)

1.1 儀器與試劑

氣相色譜儀(GC-ECD，6890N型，配有電子捕獲檢測器，美國Agilent公司)，真空冷凍干燥機(LGJ-10B型，北京四環(huán)科學儀器廠有限公司)，醫(yī)用數(shù)控超聲波清洗器(KQ3200DE型，昆山超聲儀器有限公司)，玻璃層析柱(1997A型，上海子期實驗設備有限公司)，氮吹儀(LBM-1J型，北京萊伯曼公司)；PCR儀(德國Eppendorf公司)，核酸蛋白檢測儀(BioPhotometer plus型，德國Eppendorf公司)，ChemiDoc XRS凝膠成像系統(tǒng)、熒光定量PCR儀(美國Bio-Rad公司)。

正己烷(色譜純，美國Burdick & Jackon公司)，丙酮(色譜純，美國J.T. Baker公司)，佛羅里土(60～100目，美國Sigma公司)，無水硫酸鈉，PCB77、PCB81、PCB105、PCB114、PCB118、PCB123、PCB126、PCB156、PCB157、PCB167、PCB169、PCB170、PCB180、PCB189(美國o2si公司)；總RNA提取試劑盒(TRIZOL Reagent)、一般PCR試劑盒(TaqTM)、DL 2000 DNA Marker、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(PrimeScript RT reagent Kit With gDNA Eraser)、SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ(Perfect Real Time)均為Takara公司產(chǎn)品。

1.2 近海沉積物DlPCBs提取物的制備

以Khim等[5]和Koh等[6]所述方法為依據(jù)，將采集于湛江調(diào)順島(TS)和金沙灣(JSW)的近海域沉積物樣品冷凍干燥，研碎，過80目篩。稱取30 g于500 mL三角燒瓶中，加入300 mL正己烷和丙酮1∶1(V∶V)，另加1 g銅粉脫硫，超聲波提取30 min，靜置后分離有機溶劑層，重復上述步驟一次，合并2次提取液。轉(zhuǎn)移至旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀50 ℃濃縮至5 mL左右，加入10 mL正己烷繼續(xù)濃縮至2 mL，待凈化。凈化方法為：用正己烷潤濕層析柱，在柱內(nèi)加入10 g已活化的佛羅里硅土，再加10 mm厚的無水硫酸鈉，排出過量正己烷至剛淹沒無水硫酸鈉層，關閉活塞。將樣品提取液移入柱內(nèi)，用100 mL正己烷進行淋洗，將洗脫液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀下濃縮至10 mL左右，轉(zhuǎn)移至濃縮管，用氮氣濃縮至2 mL，1 mL用于氣相色譜法儀器分析，另外1 mL用于后續(xù)斑馬魚胚胎試驗。

1.3 試驗動物

斑馬魚(Danio rerio)，購自湛江花鳥魚市場，由廣東海洋大學水產(chǎn)學院進行品種鑒定。在水族箱適應性飼養(yǎng)1個月后用于繁殖試驗，養(yǎng)殖用水為自然曝氣3 d的自來水，水溫控制在26～28 ℃。挑選體長為3.5 cm左右的斑馬魚(雌∶雄=1∶2)置于繁殖用水族箱中，每天飼喂2次，光照與黑暗周期控制在14 h/10 h，試驗當天早上以光照刺激斑馬魚配對并產(chǎn)卵，0.5 h內(nèi)用胚胎收集器收集斑馬魚胚胎。

1.4 斑馬魚胚胎染毒

近海沉積物DlPCBs提取物的最終染毒濃度依據(jù)斑馬魚胚胎急性毒性試驗96 h的LC50配制，分別以DlPCBs提取物對斑馬魚胚胎的LC50為最高濃度，二倍遞減進行稀釋，配制5個濃度(TS采樣點DlPCBs提取物的染毒濃度為60、30、15、7.5、3.75 mg·mL-1；JSW采樣點DlPCBs提取物的染毒濃度為70、35、17.5、8.75、4.375 mg·mL-1)，設空白對照組和0.1% DMSO對照組。斑馬魚胚胎染毒試驗按照OECD(2012)方法進行[7]，試驗期為96 h，每天定時更換一半染毒溶液。

1.5 斑馬魚胚胎EROD酶活性測定

采用胚胎活體EROD酶測定法測EROD酶活性，綜合Liu和Marit的方法[2,8]改良后進行。最終的分析結果為5條仔魚熒光強度的平均值。

1.6 斑馬魚胚胎cyp1a mRNA相對表達量的測定

將20個染毒96 h后的斑馬魚仔魚收集于離心管后，馬上放入-80 ℃保存至提取RNA。用Trizol總RNA提取試劑盒提取斑馬魚仔魚總RNA。用TaKaRa公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScript RT reagent Kit With gDNA Eraser(Perfect Real Time)進行總RNA反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物于-20 ℃下保存。cyp1a基因和內(nèi)參基因β-actin序列從Genebank獲得，其序列號分別為AF210727和AF057040，利用軟件Prime 5.0 設計引物。cyp1a基因上游引物為：AGGACAACATCAGAGACATCACCG，下游引物為：CACTAGATAGACAACCGCCCAGG，產(chǎn)物片段大小179 bp；β-actin上游引物為：GATGCGGAAACTGGCAAAGG，下游引物為：GAGGAGGGCAAAGTGGTAAACG，產(chǎn)物片段大小為116 bp。熒光定量PCR反應按設定條件進行，0.5 ℃增值進行熔解曲線分析，以檢驗產(chǎn)物的特異性。最終利用Fold = 2-△△Ct計算基因的相對表達量[9]。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

2 結果(Results)

2.1 斑馬魚胚胎EROD酶活性

熒光生物顯微鏡可觀察到各DlPCBs提取物染毒組斑馬魚仔魚的腸道、眼睛、卵黃囊積累了熒光產(chǎn)物(resorufin)，其熒光強度均強于對照組，而0.1% DMSO對照組仔魚熒光強度很低(圖1F1)。TS采樣點DlPCBs提取物最高濃度組(60 mg·mL-1)仔魚可觀察到心包水腫，在熒光顯微鏡下可觀察到腸道和卵黃囊明顯的熒光產(chǎn)物積累(圖1A1)。

利用光密度分析軟件對腸道和卵黃囊熒光產(chǎn)物進行熒光強度分析，與對照組比較，可得不同染毒濃度的仔魚EROD活性相對大小(圖2)。7.5 mg·mL-1染毒組的斑馬魚EROD活性為對照組的1.1倍(P<0.05)，15 mg·mL-1、30 mg·mL-1、60 mg·mL-1染毒組EROD活性分別為對照組的1.2、1.8和1.5倍(P<0.01)。JSW采樣點DlPCBs提取物染毒組EROD酶活性變化與TS采樣點DlPCBs提取物類似，染毒濃度達17.5 mg·mL-1時，斑馬魚仔魚EROD酶活性為對照組的1.26倍(P<0.05)，35 mg·mL-1和70 mg·mL-1的DlPCBs提取物染毒組EROD活性分別為對照組的1.38和1.42倍(P<0.01)。

圖1 TS采樣點DlPCBs提取物染毒斑馬魚胚胎96 h后的熒光圖和普通顯微鏡圖(100×) 注：A1～F1為熒光圖，A2～F2為普通顯微鏡圖；A、B、C、D、E分別為60 mg·mL-1、30 mg·mL-1、15 mg·mL-1、7.5 mg·mL-1、3.75 mg·mL-1 DlPCBs提取物組，F(xiàn)為0.1% DMSO對照組。Fig. 1 Fluorescent and digital images of zebrafish larvae exposed to different concentrations of TS sediment DlPCBs extracts for 96 h (100×)Note:A1-F1 indicate fluorescent microscopic images of the zebrafish larvae; A2-B2 indicate light microscopic images of the zebrafish larvae. A, B, C, D, E were zebrafish larvae treated with 60 mg·mL-1, 30 mg·mL-1, 15 mg·mL-1, 7.5 mg·mL-1, 3.75 mg·mL-1 of DlPCBs extract, F were zebrafish larvae in the control.

2.2 DlPCBs提取物對斑馬魚仔魚cyp1a mRNA相對表達量的影響

不同濃度的DlPCBs提取物暴露斑馬魚胚胎96 h后，使斑馬魚仔魚cyp1a mRNA表達發(fā)生變化(圖3)。TS采樣點3.75 mg·mL-1、7.5 mg·mL-1濃度組的斑馬魚仔魚cyp1a mRNA相對表達量是對照組的3.36、3.37倍(P<0.05)，15 mg·mL-1、30 mg·mL-1、60 mg·mL-1濃度組的斑馬魚仔魚cyp1a mRNA相對表達量為對照組4.87、7.11和7.59倍(P<0.01)；JSW采樣點4.375 mg·mL-1的DlPCBs提取物對仔魚cyp1a mRNA的表達量與對照組相比差異不顯著(P>0.05)，8.75 mg·mL-1濃度組的斑馬魚仔魚cyp1a mRNA相對表達量與對照相比差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，17.5 mg·mL-1、35 mg·mL-1和70 mg·mL-1的JSW采樣點DlPCBs提取物濃度組的斑馬魚仔魚cyp1a mRNA相對表達量為對照組的8.39、18.82和19.45倍(P<0.01)。DlPCBs提取物與斑馬魚仔魚cyp1a mRNA表達量呈現(xiàn)濃度-效應關系。

圖2 TS和JSW采樣點的DlPCBs提取物染毒斑馬魚胚胎96 h后活體EROD酶相對活性變化 注：n=5；*與對照組比，P<0.05，**與對照組比較，P<0.01。Fig. 2 In vivo EROD activity in zebrafish larvae exposed to DlPCBs extracts from TS and JSW for 96hNote: Mean±SEM, n=5. * P<0.05, **P<0.01, compared with control.

圖3 TS和JSW采樣點DlPCBs提取物染毒96 h對供試斑馬魚胚胎cyp1a基因mRNA相對表達量的影響 注：n=3；與對照組相比，*P<0.05，**P<0.01。Fig. 3 Fold-change in cyp1a mRNA expression in zebrafish embryos exposed to different concentrations of TS and JSW sediment DlPCBs extracts for 96 h Note: Mean±SEM (n=3). *P<0.05, **P<0.01, compared with control.

3 討論(Discussion)

3.1 DlPCBs提取物使斑馬魚仔魚EROD酶活性增加

哺乳動物的EROD酶是由CYP1A1介導的，是二噁英類污染物的生物標志物[10]。Tsang等[11-12]利用EROD法檢測了水體、沉積物、魚肉和雞蛋的二噁英類化合物污染水平。斑馬魚胚胎EROD酶活性的檢測方法有2種。一種是基于熒光分光光度計或多功能酶標儀的檢測方法；另外一種方法稱為胚胎活EROD酶檢測法，利用熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡測定resorufin的熒光強度，反映EROD酶活性大小[12]。Liu等[2]和Tsang等[12]利用斑馬魚胚胎活體EROD酶檢測法研究發(fā)現(xiàn)，一定劑量的DlPCBs、TCDD或PAHs能誘導斑馬魚胚胎EROD酶活性升高。本研究結果表明，DlPCBs提取物能誘導胚胎EROD酶活性升高，通過熒光顯微鏡可觀測到resorufin主要分布于斑馬魚胚胎的腸道、眼睛、卵黃囊和血管，這與Otte利用激光共聚焦顯微鏡觀測到的結果基本一致[13]。

Khim等[5]和Koh等[6]用正己烷和丙酮1:1(V/V)進行浸提，再用佛羅里硅土柱層析法凈化，將沉積物中的PCBs與PAHs、OCPs和PCDD/Fs分離，有效提高了儀器和生物學分析的特異性。本研究將沉積物用正己烷和丙酮1:1(V/V)結合超聲波進行提取和佛羅里土柱層析凈化得到DlPCBs提取物，染毒斑馬魚胚胎96 h后發(fā)現(xiàn)一定濃度的DlPCBs提取物能使胚胎EROD酶活性增加，呈現(xiàn)明顯的濃度-效應關系，這與PCB126對斑馬魚胚胎EROD酶活性的影響相類似[2]。由此說明，斑馬魚仔魚EROD活性對DlPCBs敏感，能有效指示沉積物DlPCBs污染，胚胎活體EROD酶測定方法簡單方便，具有一定的應用前景。

3.2 DlPCBs提取物上調(diào)斑馬魚仔魚cyp1a mRNA表達量

生物體cyp1a mRNA的基底表達量很低，一定濃度的DlPCBs可通過AhR途徑使cyp1a mRNA表達量呈濃度依賴升高。因此cyp1a基因的表達量常用于指示DlPCBs等二噁英類化合物污染的生物標志物[14-15]。本研究將斑馬魚胚胎暴露于DlPCBs提取物中96 h，發(fā)現(xiàn)TS采樣點不同濃度的DlPCBs提取物均能顯著誘導cyp1a mRNA表達量升高(P<0.05)，JSW采樣點除最低濃度(4.375 mg·mL-1)外，其他濃度的DlPCBs提取物均能顯著誘導cyp1a mRNA表達量升高(P<0.05)，cyp1a mRNA表達量的變化與EROD酶活性的變化一致，呈現(xiàn)濃度-效應關系?？梢娡ㄟ^測定斑馬魚胚胎cyp1a mRNA表達量能反映沉積物DlPCBs的污染水平[16]。

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◆

EROD Activity andcyp1amRNA Expression in Zebrafish Embryo Exposed to Marine Sediment DlPCBs Extract

Nie Fanghong1, Cai Jizhen2, Wang Xiaoning2, Lin Hongying2, Gooneratne Ravi3, Hay Anthony4, Ma Yi2, Ju Xianghong2, Zheng Jinqing2, Chen Jinjun2,*

1. Food Sci-Tech College, Guangdong Ocean University, Zhanjiang 524088, China 2. Agricultural College, Guangdong Ocean University, Zhanjiang 524088, China 3. Faculty of Agriculture & Life Sciences, Lincoln University, Christchurch 7647, New Zealand 4. College of Agriculture and Life Sciences, Cornell University, Ithaca 14853, USA

Received 9 July 2015 accepted 31 August 2015

To study the bio-toxicity of dioxin-like polychlorinated biphenyls (DlPCBs) in marine sediment, the sediments from Zhanjiang industrial and living area (TS and JSW) were collected and extracted focusing on DlPCBs, respectively. Then a range of zebrafish embryos were exposed to different concentrations of the sediment DlPCBs extracts to examine the ethoxyresorufin-O-deethylase (EROD) activity and the expression of cyp1a mRNA. The results showed that the DlPCBs extract from TS and JSW sediments had similarity to cause marked induction of EROD in the zebrafish embryos.The EROD activities in zebrafish embryos induced by different concentrations of the DlPCBs extract were 1.1 to 1.8 times higher than that in the control embryos, respectively, and after the zebrafish embryos were exposed to different concentrations of the DlPCBs for 96 h, the juvenile cyp1a mRNA relative expressions were significantly enhanced by 3.36 to 19.45 times of that in the control group, respectively. It is indicated that certain concentrations of the DlPCBs extract increased EROD activity and cyp1a mRNA in zebrafish larvae, with a concentration-effect relationship.

dioxin-like polychlorinated biphenyls; zebrafish embryo; EROD; cyp1a mRNA; marine sediment

10.7524/AJE.1673-5897.20150709001

廣東省科技計劃國際合作項目(2010B050600004，2016A050502062)

聶芳紅(1969-)，女，碩士，高級實驗師，研究方向為食品毒理學，E-mail：15913577717@163.com；

*通訊作者(Corresponding author)， E-mail: jjchen777@aliyun.com

2015-07-09 錄用日期：2015-08-31

1673-5897(2016)2-364-05

X171.5

A

簡介：陳進軍( 1967-)，男，動物毒理學博士，三級教授，主要研究方向為動物毒理學和環(huán)境健康，發(fā)表學術論文80 余篇。

聶芳紅, 蔡吉榛, 王小寧, 等. 近海沉積物DlPCBs對斑馬魚胚胎EROD和cyp1a mRNA的影響[J]. 生態(tài)毒理學報，2016, 11(2): 364-368

Nie F H, Cai J Z, Wang X N, et al. EROD activity and cyp1a mRNA expression in zebrafish embryo exposed to marine sediment DlPCBs extract [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2016, 11(2): 364-368 (in Chinese)