牛曰華

(福建省海洋環(huán)境與漁業(yè)資源監(jiān)測中心，福建 福州 350003)

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液相色譜法測定水產(chǎn)品中恩諾沙星殘留量的不確定度評定

牛曰華

(福建省海洋環(huán)境與漁業(yè)資源監(jiān)測中心，福建 福州 350003)

當(dāng)水產(chǎn)品中恩諾沙星殘留量接近最高殘留限量時，為準確判斷產(chǎn)品是否符合要求，開展測量不確定度評定便十分重要。基于此，本文建立了液相色譜法測定水產(chǎn)品中恩諾沙星殘留量的不確定度分析和評定方法。依據(jù)JJF 1059.1—2012《測量不確定度評定與表示》和CNAS—GL06：2006《化學(xué)分析中不確定度的評估指南》規(guī)定的基本方法和程序，建立恩諾沙星殘留量的測量不確定度數(shù)學(xué)模型，分析不確定度的來源，對主要不確定度分量進行計算和合成，最終得到擴展不確定度。當(dāng)樣品中恩諾沙星測量值為97.1 μg/kg時，其擴展不確定度為5.6 μg/kg。分析結(jié)果表明，測定結(jié)果的不確定度主要來源于樣品前處理和標準溶液。

液相色譜法；水產(chǎn)品；恩諾沙星；不確定度評定

測量不確定度是根據(jù)所用到的信息，表征賦予被測量值分散性的非負參數(shù)[1]。一個完整的檢測結(jié)果通常包括測量估計值和其不確定度等有關(guān)信息[2]?！稒z驗檢測機構(gòu)資質(zhì)認定評審準則》對測量不確定度的評定提出了明確要求，主要包括：檢驗檢測機構(gòu)應(yīng)制定測量不確定度的評定程序、建立覆蓋主要檢測類型的測量不確定度評定案例以及在必要時給出測量不確定度。測量不確定度在實驗室間結(jié)果比對和檢測結(jié)果的國際互認方面具有重要意義[3]。此外，當(dāng)檢測結(jié)果處于產(chǎn)品標準要求的臨界值，產(chǎn)品有可能被判定為不合格時，這種情況下應(yīng)給出測量不確定度[4]?；诖?，測量不確定度的評定在檢測領(lǐng)域越來越受到重視。

恩諾沙星(Enrofloxacin，EF)是人工合成的第三代氟喹諾酮類(Fluoroquinolones，F(xiàn)Qs)抗菌藥物，對絕大多數(shù)革蘭氏陰性菌以及部分革蘭氏陽性菌有效[5]，對殺鮭氣單胞菌(Aeromonassalmonicida)、殺鮭氣弧菌(Vibriosalmonicida)、鰻弧菌(V.anguillarum)和紅色耶爾森菌(Yersiniarucheri)等水產(chǎn)動物致病菌高度敏感[6-7]，因此廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)。但不合理的用藥也會對人體健康和生態(tài)環(huán)境帶來危害[8]。因此，恩諾沙星是中國申報無公害水產(chǎn)品必須要檢測的項目，也是水產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)管的重要對象。中國農(nóng)業(yè)部第235號公告《動物性食品中獸藥最高殘留限量》規(guī)定水產(chǎn)動物肌肉中恩諾沙星最高殘留限量為100 μg/kg。農(nóng)業(yè)部783號公告—2—2006《水產(chǎn)品中諾氟沙星、鹽酸環(huán)丙沙星、恩諾沙星殘留量的測定 液相色譜法》[9]是監(jiān)測水產(chǎn)品中恩諾沙星殘留量常用的檢測方法。檢測方法的不確定度是判定測量結(jié)果準確性的重要依據(jù)。當(dāng)水產(chǎn)品中恩諾沙星殘留量檢測值接近最高殘留限量時，為準確判斷產(chǎn)品是否符合要求，對方法開展測量不確定度評定十分必要。因此，本研究根據(jù)JJF 1059.1—2012《測量不確定度評定與表示》[10]以及CNAS—GL06：2006《化學(xué)分析中不確定度的評估指南》[11]規(guī)定的基本方法和程序，對農(nóng)業(yè)部783號公告—2—2006方法的不確定度進行分析和評定，找出影響檢測結(jié)果的主要不確定度分量。在實際操作中可用于指導(dǎo)檢測人員對主要的不確定度分量進行重點控制，以提高檢測結(jié)果的質(zhì)量；為從事水產(chǎn)品藥殘檢測和研究的相關(guān)人員提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Waters H-CLASS超高效液相色譜儀，配FLR檢測器；ALC-210.3電子天平和BP211D電子天平(德國Sartorius公司)；3-30K高速離心機(德國Sigma公司)；LR4000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(德國Heidolph公司)；超聲波清洗器(昆山超聲儀器有限公司)；MS3渦旋混合器(德國IKA公司)；Milli-Q超純水系統(tǒng)(美國Millipore公司)等。

恩諾沙星標準品(德國Dr.Ehrenstorfer公司)；乙腈、正已烷為色譜純，購于Merck公司；三乙胺、無水硫酸鈉為分析純，購于國藥集團有限公司；磷酸，優(yōu)級純，購于美國Tedia公司。

1.2 樣品前處理方法

參照農(nóng)業(yè)部783號公告—2—2006《水產(chǎn)品中諾氟沙星、鹽酸環(huán)丙沙星、恩諾沙星殘留量的測定 液相色譜法》進行樣品前處理。

1.3 標準溶液的配制

標準儲備液的配制：準確稱取恩諾沙星標準品10.0 mg，用流動相溶解后，定容至100 mL。該標準儲備液濃度為100 mg/L。

標準中間液的配制：準確移取5.00 mL標準儲備液，用流動相定容至100 mL，得到5 mg/L的標準中間液。

標準工作液的配制：分別移取1.00 mL標準中間液至10、25、50、100、200 mL容量瓶中，用流動相定容，搖勻，得到500、200、100、50、25 μg/L的標準工作液。

1.4 色譜條件

色譜柱為BEH C18柱，規(guī)格100 mm×2.1 mm，粒徑1.7 μm；流動相A相為0.025 mol/L磷酸(用三乙胺調(diào)pH至3.0)，B相為乙腈，A∶B=87∶13(V/V)，流速0.30 mL/min；柱溫40℃；進樣量2.00 μL；檢測波長：激發(fā)波長280 nm，發(fā)射波長450 nm。

2 測量不確定度的評定

2.1 數(shù)學(xué)模型

水產(chǎn)品中恩諾沙星殘留量的數(shù)學(xué)模型如式(1)所示。

式(1)

式(1)中，X為樣品中恩諾沙星的含量(μg/kg)；m為樣品的稱取量(g)；v為樣品的定容體積(mL)；Cs為標準溶液濃度(μg/L)；As為標準溶液的峰面積；A為樣液中恩諾沙星的峰面積；f為回收率校正因子。

2.2 不確定度來源分析

根據(jù)數(shù)學(xué)模型和檢測過程分析，水產(chǎn)品中恩諾沙星殘留量的不確定度來源主要包括：樣品稱量、標準溶液、標準曲線擬合、樣品定容、樣品前處理以及測量儀器。其中，樣品稱量的不確定度主要來自于天平；標準溶液的不確定度由配制過程中產(chǎn)生，主要由標準物質(zhì)本身、標準物質(zhì)的稱量以及配制過程中使用玻璃量器等引入；樣品定容的不確定度主要來自于移液器；樣品前處理的不確定度主要來自樣品的提取和凈化等操作步驟。

2.3 不確定度分量的計算

2.3.1 樣品稱量的不確定度

2.3.2 標準溶液的不確定度

標準溶液配制過程產(chǎn)生的不確定度主要由標準物質(zhì)純度、標準物質(zhì)的稱量以及標準溶液配制過程中使用的移液管和容量瓶等引入。

1) 標準物質(zhì)純度的不確定度

2) 標準物質(zhì)稱量的不確定度

3) 標準溶液配制過程中玻璃量器引入的不確定度

恩諾沙星標準溶液配制過程中使用了經(jīng)檢定為A級的容量瓶和單標線吸量管。使用容量瓶和吸量管引入的不確定度主要包括量器校準產(chǎn)生的不確定度ur(c3，v)和配制標準溶液時的溫度與檢定標準溫度(20℃)不同產(chǎn)生的不確定度ur(c3，t)。

式(2)

式(2)中，V1為量器的標稱容量，V2為量器容量最大允許誤差。

式(3)

由公式(2)和公式(3)，得到ur(c3，v)和ur(c3，t)，進而得到各量器的相對合成標準不確定度，結(jié)果如表1所示。

表1 量器的不確定度

續(xù)表1

根據(jù)量器的使用次數(shù)，得到標準溶液配制過程中使用量器產(chǎn)生的不確定度：

因此，標準溶液引入的不確定度：

2.3.3 標準曲線擬合產(chǎn)生的不確定度

將配制的標準工作液進行上機檢測，得到恩諾沙星各濃度的色譜峰面積，如表2所示。

表2 恩諾沙星標準工作液的色譜峰面積

用最小二乘法進行線性擬合，得到恩諾沙星濃度標準曲線，曲線方程為y=6 380x-5 164(其中y表示峰面積，x表示恩諾沙星濃度)，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 9，標準曲線斜率a=6 380，標準曲線截距b=-5 164。標準溶液峰面積殘差的標準偏差S用式(4)表示。

式(4)

式(4)中，a、b、n、xi、yi分別代表標準曲線斜率、標準曲線截距、標準溶液總的測量次數(shù)(n=5)、第i個標準溶液的濃度(μg/L)和第i個標準溶液的色譜峰面積(μV·s)。

由式(4)得到標準溶液峰面積殘差的標準偏差S=7 230。

標準溶液濃度殘差的平方和Scc用式(5)表示。

式(5)

由式(5)得到標準溶液濃度殘差的平方和Scc=150 000。

對水產(chǎn)品樣品中的恩諾沙星進行2次平行檢測，得到的峰面積分別為2 910 879 μV·s和3 275 113 μV·s，通過標準曲線查得的樣液濃度分別為457.06 μg/L和514.15 μg/L，平均值為485.60 μg/L。

由最小二乘法擬合標準曲線引入的標準不確定度u(q)用式(6)表示。

式(6)

式(6)中，X為樣液中恩諾沙星的濃度，X=485.60 μg/L；p為樣品測量次數(shù)，p=2。

2.3.4 樣品定容的不確定度

2.3.5 樣品前處理引入的不確定度

樣品前處理主要包括酸化乙腈提取、正己烷除脂凈化以及濃縮等操作步驟，其產(chǎn)生的不確定度通常用加標回收率進行評定。用陰性草魚樣品做6份平行加標實驗，加標濃度為國家規(guī)定的最高殘留限量濃度100 μg/kg。測定結(jié)果如表3所示。

表3 加標回收率結(jié)果

設(shè)顯著水平α=0.05，tα(0.05，5)=2.571。t>tα(0.05，5)=2.571，說明平均回收率與100%差異顯著，因此必須考慮方法回收率引入的不確定度。

2.3.6 檢測儀器引入的不確定度

2.4 標準不確定度的合成和擴展

2.4.1 合成標準不確定度

根據(jù)得到的各不確定度分量，得到總的相對合成標準不確定度：

由樣液中恩諾沙星的濃度485.60 μg/L，得到樣品中恩諾沙星測量值為97.1 μg/kg。因此樣品測定中恩諾沙星合成標準不確定度uc(X)=97.1×0.028 78 μg/kg=2.79 μg/kg。

2.4.2 擴展不確定度

取包含因子k=2，擴展不確定度U=k×uc(X)=2×2.79 μg/kg=5.6 μg/kg。

2.5 不確定度報告

采用農(nóng)業(yè)部783號公告—2—2006《水產(chǎn)品中諾氟沙星、鹽酸環(huán)丙沙星、恩諾沙星殘留量的測定 液相色譜法》，測得水產(chǎn)品中恩諾沙星殘留量為X=(97.1±5.6)μg/kg，k=2。

由此結(jié)果可以看出，樣品中恩諾沙星殘留量檢測值97.1 μg/kg小于國家規(guī)定的最高殘留限量100 μg/kg，可以判定為合格產(chǎn)品。但同時由于該檢測值已經(jīng)較為接近最高殘留限量，并且該檢測值的擴展不確定度為5.6 μg/kg，樣品仍可能存在一定的風(fēng)險，需要進一步加以關(guān)注。

2.6 不確定度分量分布

根據(jù)上述計算，得到各主要不確定度分量，結(jié)果如表4所示。由表4可以看出，對不確定度的貢獻：樣品前處理>標準溶液>樣品定容>檢測儀器>標準曲線擬合>樣品稱量。在這些不確定度分量中，樣品前處理對不確定度的貢獻在50%以上，標準溶液對不確定度的貢獻約占22%，樣品稱量對不確定度的貢獻最小。

表4 不確定度分量分布表

3 結(jié)論

當(dāng)水產(chǎn)品中恩諾沙星殘留量接近最高殘留限量時，為準確判斷產(chǎn)品是否符合要求，開展不確定度評定便十分重要。本研究表明，采用農(nóng)業(yè)部783號公告—2—2006《水產(chǎn)品中諾氟沙星、鹽酸環(huán)丙沙星、恩諾沙星殘留量的測定 液相色譜法》進行水產(chǎn)品中恩諾沙星測定，當(dāng)樣品中恩諾沙星檢測值為97.1 μg/kg時，其擴展不確定度為5.6 μg/kg。樣品前處理是恩諾沙星測量不確定度的最主要來源，占各不確定度分量總和的50%以上；其次是標準溶液，約占各不確定度分量總和的22%；樣品稱量、標準曲線擬合、樣品定容和檢測儀器對不確定度的貢獻較小。因此，在檢測過程中，應(yīng)保證實驗操作的規(guī)范性，增加平行樣的檢測，加強對標準物質(zhì)和標準溶液的管理，以及對配制標準溶液所用的玻璃量器定期進行檢定校準。

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[10]國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局.JJF 1059.1—2012 測量不確定度評定與表示[S].北京：中國質(zhì)檢出版社，2013.

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Uncertainty evaluation for determination of enrofloxacin residue in aquatic products by liquid chromatography

NIU Yuehua

(Fujian Marine Environment and Fishery Resources Monitoring Center，F(xiàn)uzhou 350003，China)

When enrofloxacin residue is close to the maximum residue limit in aquatic products，it is very important to carry out evaluation of measurement uncertainty to accurately determine whether the products meet the quality standards.So a method of uncertainty evaluation for the determination of enrofloxacin residue in aquatic products by liquid chromatography was established.According to “Evaluation and Expression of Uncertainty in Measurement”(JJF 1059.1—2012)and “Guidance on Evaluating the Uncertainty in Chemical Analysis”(CNAS—GL06：2006)，a mathematical model was constructed and the uncertainty sources were analyzed，and then the main components of uncertainty were quantified and combined.Finally the expanded uncertainty was achieved.When the measured value of enrofloxacin residue in aquatic products was 97.1 μg/kg，its expanded uncertainty was 5.6 μg/kg.The results showed that the major factors of uncertainty were sample pre-treatment and standard solution.The uncertainties of sample pre-treatment and standard solution accounted for more than 50% and 22% of the total uncertainties，respectively.

liquid chromatography；aquatic products；enrofloxacin；uncertainty evaluation

2016-07-12 作者簡介：牛曰華(1981-)，男，工程師，農(nóng)業(yè)推廣碩士，研究方向：主要從事水產(chǎn)品中藥物殘留檢測.Tel：0591-87836015.E-mail：yhniu99@126.com

S94

A

1006-5601(2016)05-0402-07

牛曰華.液相色譜法測定水產(chǎn)品中恩諾沙星殘留量的不確定度評定[J].漁業(yè)研究，2016，38(5)：402-408.