陳曉勇，王　薇，敦偉濤，趙興波?

（1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，北京　100193；2.河北省畜牧獸醫(yī)研究所，河北　保定　071000）

小尾寒羊TFB2M基因遺傳變異分析

陳曉勇1，2，王薇1，敦偉濤2?，趙興波1?

（1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，北京100193；2.河北省畜牧獸醫(yī)研究所，河北保定071000）

試驗旨在分析小尾寒羊線粒體基因轉(zhuǎn)錄因子B2（M itochondrial Transcription Factors B2，TFB2M）基因遺傳變異，采集小尾寒羊血液，采用直接測序方法，對該基因8個外顯子、5’-UTR和3’-UTR多態(tài)位點進(jìn)行分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，編碼區(qū)錯義突變1個（G226A，GCC→ACC）導(dǎo)致76位蘇氨酸變?yōu)楸彼幔?’-UTR發(fā)現(xiàn)一處顛換（C58G）；3’-UTR有三個突變位點（C98G、A206G和A429T）。生物學(xué)軟件對啟動子和5’-UTR轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測結(jié)果顯示共有54個轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點，5’-UTR 58bp處沒有結(jié)合位點，因此，該突變并沒有改變結(jié)合位點。本研究為綿羊TFB2M基因變異及其功能研究奠定了分子生物學(xué)基礎(chǔ)。

線粒體轉(zhuǎn)錄因子B2；小尾寒羊；變異；轉(zhuǎn)錄因子

線粒體是細(xì)胞中具有獨特結(jié)構(gòu)和功能的細(xì)胞器，其功能的精細(xì)調(diào)節(jié)有賴于細(xì)胞核基因組與線粒體基因組之間的相互調(diào)控。線粒體基因組的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯需要各種不同的核基因產(chǎn)物，而一些核基因的功能與線粒體基因（Mitochondrial DNA，mtDNA）轉(zhuǎn)移、線粒體蛋白質(zhì)的生物合成等有關(guān)，兩者不但在生物發(fā)生、生物合成方面需要相互協(xié)調(diào)，更重要的是通過相互協(xié)調(diào)作用來調(diào)節(jié)呼吸鏈亞基的表達(dá)，從而維持線粒體呼吸鏈功能。在細(xì)胞內(nèi)，線粒體遺傳系統(tǒng)與細(xì)胞核遺傳系統(tǒng)相互協(xié)作進(jìn)行生物合成。

線粒體轉(zhuǎn)錄因子B2（Mitochondrial Transcrip-tion Factors B2，縮寫為TFB2M或者mtTFB2）是調(diào)控哺乳動物線粒體基因（mtDNA）表達(dá)調(diào)控的重要因子[1]，由于與酒精酵母轉(zhuǎn)錄因子mtTFB序列相似而被發(fā)現(xiàn)[2]，二者都是核基因編碼并轉(zhuǎn)運到線粒體的蛋白質(zhì)，其表達(dá)受核轉(zhuǎn)錄因子，如過氧化物體增殖活化受體γ輔活化因子1（Peroxisome prol i feratoractivated receptor(PPAR)-γcoactivatorα，PGC-1α）、核呼吸因子1和2（nuclear respiratory factorsNRF-1,NRF-2）等嚴(yán)格調(diào)控[3-5]。核轉(zhuǎn)錄因子的發(fā)現(xiàn)使細(xì)胞核調(diào)控線粒體呼吸功能途徑的研究有了突破性進(jìn)展。TFB2M蛋白質(zhì)作為轉(zhuǎn)錄元件在轉(zhuǎn)錄起始位置與D-loop結(jié)合，組成轉(zhuǎn)錄起始裝置啟動mtDNA轉(zhuǎn)錄[1，6]。有研究報道發(fā)現(xiàn)牛T F A M 基因編碼區(qū)無多態(tài)性位點，但啟動子區(qū)域存在2個相距9 bp緊密連鎖的A/C（TFAM Hae III）和C/T（TFAM Mbo I）SNP位點。通過對和牛×利木贊群體進(jìn)行基因分型，證實2個SNPs位點都顯著影響大理石紋和皮下脂肪沉積[7-8]。因此，分析該基因遺傳變異將有利于揭示線粒體基因功能及其遺傳效應(yīng)。

目前，還未見綿羊TFB2M基因變異研究報道，本試驗以小尾寒羊為研究對象分析TFB2M基因變異，將為該基因功能及其與表型性狀的關(guān)系研究提供參考。

1　材料與方法

1.1試驗動物和D D N N A A提取選擇成年小尾寒羊10只個體，采用頸靜脈方法用5 mL注射器采集全血(每只羊一個注射器)，每個樣品采集血液1.5 mL左右裝入備好含有抗凝劑的2 mL EP管中，待采血結(jié)束后帶回實驗室。采用酚氯仿方法提取總DNA，具體如下：①向1.5 mL離心管（EP管）中加入200μL血樣。加入500μL SNET（1%SDS，400 mM NaCl，5 mM EDTA，20 mM Tris-cl pH 8.0），混勻。②向以上溶液中加入蛋白酶K至終濃度100 ng/mL，混勻。③55℃孵育4 h。④加入等體積的Tris-飽和酚，緩慢顛倒離心管數(shù)次，12 000 r/min，離心10 min。⑤取水相于新的EP管中，加入等體積氯仿/異戊醇（24：1），震蕩搖勻10 min，12 000 r/min，離心10 min。⑥取水相于新的EP管中，加入1/10體積的3 M NaAc及2.5倍體積的無水乙醇，搖勻，-20℃靜置30 min，12 000 r/min，離心10 min。⑦去水相，干燥后用適量的超純水溶解。

1.2外顯子引物設(shè)計從NCBI中查找綿羊TFB2M基因序列（GenBank：NC_019469）作為參考序列，針對所有外顯子設(shè)計引物，引物信息如表1。TFB2M基因含有8個外顯子，每個外顯子設(shè)計一對引物，其中第3和第4外顯子緊鄰，因此設(shè)計一對引物。

1.3P P C C R R擴(kuò)增測序PCR反應(yīng)體系（25μL）：ddH2O 17.85μL，10×PCR buf fer 2.5μL，dNTP(10 mM)0.5μL，正向引物(10 mM)1.0μL，反向引物(10 mM)1.0μL，Taq DNA Polymerase（5 U/μL) 0.15μL，DNA 1μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min；循環(huán)條件95℃變性30 s，退火30～60 s（退火溫度見表1），72℃延伸30 s，35個循環(huán)，72℃延伸7 min；4℃保存。將PCR產(chǎn)物純化后直接測序，獲得DNA序列信息。

1.4遺傳變異分析測序圖譜用Chromas 2.22軟件進(jìn)行堿基核查，以膠圖文件為準(zhǔn)，使用DNAStar軟件包中SeqMan軟件（DNASTAR Inc，2007）校對原始序列文件中明顯的錯誤位點，根據(jù)測序峰圖和序列比對獲得遺傳變異信息。使用DNAMAN 7.0對所有位點進(jìn)行翻譯，分析突變類型。根據(jù)同源性以已經(jīng)解析蛋白結(jié)構(gòu)（PDB ID：4GC5）為模板在SWISS-Model進(jìn)行了TFB2M的結(jié)構(gòu)建模，然后用Pymol軟件進(jìn)行處理，以Car toon圖的形式展示蛋白三維結(jié)構(gòu)，其中的突變位點以Stick形式表示。(Swissmodel：http：//swissmodel.expasy.org/interactive;Pymol：ht tp：//www.pymol.org/)

5’-UTR轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測網(wǎng)址：ht tp：//www. cbrc.jp/research/db/TFSEARCH.html

蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)分析：SOPMA（ht tp：//npsapbi.ibcp.f r/）

2　結(jié)果與分析

2.1TFB2M多態(tài)分析綿羊TFB2M基因由8個外顯子組成，其中5’-UTR為158 bp，3’-UTR為550 bp，編碼區(qū)（CDS）1 185 bp，編碼394個氨基酸（圖1）。小尾寒羊mtDNA發(fā)現(xiàn)編碼區(qū)錯義突變1個（G226A，GCC→ACC）導(dǎo)致76位蘇氨酸變?yōu)楸彼幔?’-UTR發(fā)現(xiàn)一處顛換（C58G）；3’-UTR有3個突變（C98G、A206G和A429T）。

2.2蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測分析利用swiss-model在線軟件預(yù)測比對TFB2M野生型和突變型蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)，共394個氨基酸，野生型和突變型蛋白質(zhì)二級機(jī)構(gòu)在α-螺旋和無規(guī)則卷曲方面存在差異，Thr76Ala導(dǎo)致TFB2M野生型蛋白質(zhì)α-螺旋比例由36.55%減少為36.04%，無規(guī)則卷曲由35.53%增加到36.04%，其他參數(shù)沒有變化（圖2）。

表1　TFB2M外顯子擴(kuò)增引物Table1　Primers for am p lifying exons of TFB2M gene

圖1　TFB2M基因結(jié)構(gòu)示意圖Fig.1　Schem atic structure of TFB2M gene

2.3蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)預(yù)測分析錯義突變導(dǎo)致晶體結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，突變位點氨基酸左上方的環(huán)和多肽鏈的羧基端發(fā)生改變，可能是由于氨基酸之間的作用發(fā)生改變，進(jìn)而影響構(gòu)象（圖3）。

2.4啟動子和55’--U U T T R R轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點預(yù)測分析采用TFSEARCH生物學(xué)軟件對小尾寒羊TFB2M基因啟動子和5’-UTR轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測，結(jié)果顯示共有54個轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點，5’-UTR 58 bp處沒有結(jié)合位點，因此該突變并沒有改變結(jié)合位點（圖4）。

圖2　TFB2M編碼蛋白二級結(jié)構(gòu)Fig.2　Secondary construction o f TFB2M coding protein

圖3　TFB2M基因編碼蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)Fig.3　TFB2M coding protein crysta l structure

3　討論

線粒體DNA生物合成和維持主要依賴于1 500個核內(nèi)編碼的基因調(diào)控，并且這些基因編碼的蛋白質(zhì)在細(xì)胞質(zhì)合成，之后進(jìn)入線粒體發(fā)揮調(diào)控作用，并整合與生產(chǎn)、繁殖、代謝和抗病性相關(guān)的信號通路。線粒體轉(zhuǎn)錄因子主要分為三大類：第一類是直接與mtDNA結(jié)合的因子如TFAM、TFB2M、甲狀腺激素受體（T3）、RNA聚合酶等；第二類是調(diào)控第一類因子的蛋白質(zhì)，如雌激素受體（ER）、核呼吸因子（NRF-1）等；第三類因子是調(diào)控第二類因子的蛋白質(zhì)，如甲狀腺素受體T3。

圖4　TFB2M部分啟動子和5’-UTR轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點預(yù)測Fig.4　Binding sites prediction of transcrip tion factor in partia l promotor and 5’-UTR o f TFB2M

TFB2M是線粒體基因表達(dá)調(diào)控的關(guān)鍵因子，是核基因編碼的蛋白質(zhì)，與TFMA、線粒體RNA聚合酶、TFB1M等組成基本轉(zhuǎn)錄裝置負(fù)責(zé)mtDNA轉(zhuǎn)錄。本研究的TFB2M基因錯義突變導(dǎo)致蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，進(jìn)而影響表型性狀?；虮磉_(dá)是基因與多種轉(zhuǎn)錄因子相互作用的結(jié)果，參與基因表達(dá)調(diào)控的序列往往位于基因的非翻譯區(qū)（UTR）。其中5’-UTR決定轉(zhuǎn)錄水平和方式，5’-UTR的啟動子和轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點是影響真核生物基因表達(dá)的重要調(diào)控元件。本研究小尾寒羊TFB2M基因部分啟動子和5’-UTR轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測，結(jié)果顯示共有54個轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點，5’-UTR 58 bp處沒有結(jié)合位點，因此該突變并沒有改變結(jié)合位點。轉(zhuǎn)錄后調(diào)控主要包括轉(zhuǎn)錄本在細(xì)胞內(nèi)的定位、穩(wěn)定性和翻譯效率，而相關(guān)調(diào)控元件主要多位于非翻譯區(qū)，其中以3’-UTR更為重要，3’-UTR包含調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的終止子、順式作用元件、多聚腺苷酸化信號等多種重要的功能元件，調(diào)節(jié)mRNA的穩(wěn)定性、亞細(xì)胞定位和翻譯水平，決定某一特定轉(zhuǎn)錄本的命運，對基因表達(dá)起重要調(diào)控作用。本研究的ERα基因3’-UTR野生型和突變型分析比對，結(jié)果發(fā)現(xiàn)了一些UTR作用元件結(jié)合序列變化，但與表型性狀無直接關(guān)聯(lián)。

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Analysis ofgenetic variation of TFB2M for Small-tailed Han sheep

Chen Xiaoyong1,2,Wang Wei1,Dun Weitao2*,Zhao Xingbo1*
（1.Col lege Animal Science＆ Technology,China Agricul tural University;Bei j ing100193; 2.Institute of Animal Science and Veterinary of Hebei Province,HebeiBaoding071000）

s:In order to discusse genetic variation of TFB2M,the polymorphism in 8 exons,5’-UTR and 3’-UTR were analyzed through gene sequencing of Smal l-tai led Han sheep.The resul ts demonst rated that there were one missense mutations(G226A，GCC→ACC),which lead to the threonine change to alanine,one t ransversion C58G in 5’-UTR,and three substitutions C98G,A206G,A429T in 3’-UTR.Bioinformatics toos was used to predict the promoter and 5’-UTR t ranscription factor,it indicated that 54 transcription factor binding sites were found,however,the substitution(C58G) did not change the binding site.This work provided the molecular biological foundation for the variation and function of TFB2M gene in sheep.

TFB2M;Smal l-tai led Han sheep;Variation;Transcription factor

S826.2

B

1672-9692(2016)02-0015-06

2016-01-04

陳曉勇（1980-），男，河北省灤縣人，高級畜牧師，博士，主要研究方向：動物遺傳繁育及其生物技術(shù)。

敦偉濤（1963-），男，本學(xué)，研究員，從事羊遺傳繁育與生物技術(shù)研究。趙興波（1969-），男，博士，教授，從事動物分子遺傳學(xué)與分子育種研究。

轉(zhuǎn)基因生物新品種培育重大專項（2014ZX08009-002），河北省科技支撐計劃項目（No.14226315D）和（No.15226308D）。