王繼勝，侯良芹，熊克仁

（皖南醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)教研室，蕪湖 241002）

Gas7在大鼠斜角帶核發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)

王繼勝，侯良芹，熊克仁*

（皖南醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)教研室，蕪湖 241002）

目的 研究大鼠發(fā)育過(guò)程中，生長(zhǎng)休止蛋白7（growth arrest-specific protein 7，Gas7）在斜角帶核（diagonal band nucleus，DB）的表達(dá)。方法 應(yīng)用RT-PCR方法、Western blot方法和免疫組織化學(xué)方法觀察胚胎期16.5天（E16.5）、E20.5、出生當(dāng)天（P0）、生后7天（P7）、P14、P21和2月齡（成年）大鼠DB的Gas7表達(dá)及定位。結(jié)果 RT-PCR和Western blot檢測(cè)顯示，在E16.5時(shí)Gas7表達(dá)最弱，其后逐漸增強(qiáng)，至P21時(shí)達(dá)到高峰；免疫組織化學(xué)染色顯示，斜角帶核水平支（horizontal limb of the diagonal band，HDB）在E16.5和E20.5時(shí)出現(xiàn)Gas7免疫反應(yīng)陽(yáng)性產(chǎn)物，Gas7陽(yáng)性神經(jīng)元出現(xiàn)于P0，至P21時(shí)陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)量最多，染色最深；斜角帶核垂直支（vertical limb of the diagonal band，VDB）至P14時(shí)Gas7陽(yáng)性神經(jīng)元最多，P21和成年均有所減少。結(jié)論 Gas7的表達(dá)在大鼠DB發(fā)育過(guò)程中具有時(shí)間和空間上的特異性，提示Gas7可能參與大鼠DB的發(fā)育過(guò)程。

生長(zhǎng)休止蛋白7；發(fā)育；斜角帶核；大鼠

生長(zhǎng)休止基因（growth arrest-specific gene，Gas）是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的在細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化過(guò)程中起重要調(diào)控作用的一類(lèi)因子［1］。生長(zhǎng)休止基因 7（Gas7）最早發(fā)現(xiàn)于體外培養(yǎng)的靜止期NIH3T3成纖維細(xì)胞，其表達(dá)產(chǎn)物Gas7是位于細(xì)胞膜附近的一種很強(qiáng)的F-actin結(jié)合蛋白，參與細(xì)胞骨架的形成［2］。Gas7生物學(xué)功能較為復(fù)雜，不但參加神經(jīng)細(xì)胞的分化和成熟，還可促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞軸突的生長(zhǎng)，此外還參與到某些神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的發(fā)病過(guò)程中［3-5］。Gas7主要表達(dá)于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，特異性大量表達(dá)于大腦、小腦和海馬等處［6-8］。在海馬發(fā)育過(guò)程中，Gas7的表達(dá)呈現(xiàn)時(shí)空特異性［9］，但在斜角帶核（diagonal band nucleus，DB）發(fā)育中的表達(dá)未見(jiàn)報(bào)道。DB作為隔區(qū)的功能性核團(tuán)，其屬于邊緣系統(tǒng)，與海馬、杏仁核和藍(lán)斑等有豐富的纖維聯(lián)系，參與學(xué)習(xí)、記憶和認(rèn)知，并在某些疾病，如阿爾茨海默病，引起的神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙中扮演重要角色［10］。對(duì)DB發(fā)育過(guò)程中的調(diào)控因子的研究，有利于豐富DB發(fā)育的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，并為與之相關(guān)的疾病提供治療的靶點(diǎn)。

材料和方法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

成年SD大鼠60只，體質(zhì)量250±20g，雌雄各半，用于繁殖胚胎鼠和生后各發(fā)育時(shí)期大鼠，由皖南醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。將繁殖的大鼠分為E16.5、E20.5、P0（出生當(dāng)天）、P7、P14、P21和2月（2M，成年）7組不同時(shí)期共126只用于實(shí)驗(yàn)。

2 試劑

山羊抗Gas7一抗購(gòu)自Santa Cruz公司，生物素標(biāo)記兔抗山羊IgG與HRP-DAB增強(qiáng)型顯色劑均購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司，Trizol-A＋總RNA提取試劑與Qunat cDNA第一鏈合成試劑盒及PCR試劑盒均購(gòu)自北京天根生化公司，大鼠Gas7和βactin引物均由上海捷瑞生物科技有限公司合成，D2000 Marker購(gòu)自南京金斯瑞生物科技有限公司。

3 RT-PCR

取不同時(shí)期大鼠DB，按照RNA提取試劑盒說(shuō)明提取RNA，分裝后，取5ul運(yùn)用凝膠電泳方法檢測(cè)RNA是否降解，如有2～3條清晰條帶，說(shuō)明RNA未降解可用。用紫外分光光度計(jì)測(cè)量RNA濃度，并根據(jù)在260nm和280nm處的吸光值，檢測(cè)RNA的純度。根據(jù)RNA濃度，取1μg RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，構(gòu)建20μl逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系，得 DNA單鏈（cDNA），-20℃保存。以cDNA為膜板，構(gòu)建50μl PCR反應(yīng)體系，分別以5′-AAGAAGAGTCTGGCCGAT-3′和5′-CTCGACTGTGCTTTGGTTGA-3′為Gas7上、下游引物（擴(kuò)增后Gas7 DNA片段長(zhǎng)度為492bp），再分別以5′-CAGGCACCAGGGCGT-3′和 5′-ATGGCTGGGGTGTTGAAG-3′為β-actin上、下游引物（擴(kuò)增后β-actin DNA片段長(zhǎng)度為282bp）。取5μl DNA樣本用1.5%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，結(jié)果用凝膠成像分析系統(tǒng)拍照，測(cè)定不同時(shí)期大鼠DB的Gas7和β-actin的OD值，取Gas7與βactin的比值為校正值，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

4 Western-blot方法

按10μl／mg的比例取適當(dāng)量的裂解液，在使用數(shù)分鐘前加入PMSF，使PMSF的最終濃度為1mmol／L；將混合液加入研磨器中，在冰上充分研磨，待組織完全裂解后倒入1.5ml EP管中，冰上靜置20min；4℃、12000r／min離心10min，取上清液，分裝后于-80℃冰箱保存，一部分用于測(cè)濃度，一部分用于Western blot檢測(cè)Gas7水平；按BCA蛋白定量試劑盒說(shuō)明書(shū)的方法測(cè)定DB蛋白樣本濃度；SDS-Page電泳，濃縮膠90V，分離膠120V；取膠濕轉(zhuǎn)，250mA轉(zhuǎn)膜2h；取膜，5%脫脂牛奶封閉2h，一抗4℃過(guò)夜，TBST清洗，二抗室溫?fù)u床2h，TBST清洗后，按ECL發(fā)光液說(shuō)明書(shū)，暗室曝光，取底片掃描，保存圖片，運(yùn)用凝膠成像分析系統(tǒng)測(cè)定蛋白條帶光密度，取Gas7蛋白條帶光密度值與β-actin光密度值的比值為修正值，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

5 免疫組織化學(xué)染色

各時(shí)期DB組織浸入4℃的4%多聚甲醛磷酸緩沖液中固定24 h，常規(guī)梯度乙醇脫水、二甲苯透明，石蠟包埋，連續(xù)冠狀切片，厚5μm，60℃烤片3 h，備染。組織切片常規(guī)脫蠟入水，新鮮配制的3% H2O2滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，0.02mol／L PBS洗5min×3次；0.01mol／L枸櫞酸緩沖液（pH 6.0）微波抗原修復(fù)，高火2 min，低火12 min；滴加兔血清封閉液37℃封閉60min；滴加山羊抗Gas7抗體稀釋液中（1：100）4℃冰箱過(guò)夜，復(fù)溫，0.02mol／L PBS洗5min×3次，滴加HRP標(biāo)記的兔抗山羊IgG（1：200），37℃孵育30min，0.02mol／L PBS洗5min×3次；滴加SABC，37℃60 min，0.02mol／L PBS洗5min ×3次；DAB顯色5～30min，蒸餾水洗滌；乙醇梯度脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片，顯微鏡下觀察并拍攝照片。每只大鼠取2張切片，利用病理圖像分析系統(tǒng)（Hema GSM-2000P，深圳）對(duì)每張切片在高倍（10×40倍）視野下測(cè)量相同單位面積內(nèi)Gas7免疫陽(yáng)性產(chǎn)物的平均灰度值（平均灰度值的大小與染色深淺成反比），同時(shí)對(duì)輪廓清晰的Gas7免疫陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。

結(jié)　果

1 發(fā)育過(guò)程中斜角帶核內(nèi)Gas7表達(dá)

RT-PCR檢測(cè)顯示，492bp Gas7條帶及282bp βactin條帶在DB各時(shí)期均清晰可見(jiàn)，且表達(dá)穩(wěn)定。在大鼠DB不同發(fā)育時(shí)期Gas7 mRNA的表達(dá)經(jīng)βactin校正后發(fā)現(xiàn)，在E16.5最低，之后逐漸升高至P21達(dá)高峰，2M齡時(shí)較P21減弱（圖1）。

圖1　不同發(fā)育時(shí)期大鼠斜角帶核內(nèi)Gas7m RNA表達(dá)。A，Gas7 mRNA水平RT-PCR檢測(cè)；B，Gas7 mRNA水平統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；*，與前一時(shí)間點(diǎn)比較，P＜0.01Fig.1　Expression of Gas7 mRNA in the DB of rats during different developmental periods.A，RT-PCR detection of Gas7 mRNA；B，statistical analysis of Gas7 mRNA levels；*，P＜0.01，compared with the previous time point

Western blot檢測(cè)顯示，各個(gè)時(shí)期的DB中均可見(jiàn)38kD Gas7條帶和42kD β-actin條帶。經(jīng)β-actin校正后發(fā)現(xiàn)，DB中Gas7水平在發(fā)育過(guò)程中的變化趨勢(shì)與其mRNA相似，在E16.5表達(dá)最低，之后逐漸升高至P21達(dá)高峰，2M時(shí)較P21減弱（圖2）。

圖2　不同發(fā)育時(shí)期大鼠斜角帶核內(nèi)Gas7的表達(dá)。A，Gas7水平Western blot檢測(cè)；B，Gas7水平統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；*，與前一時(shí)間點(diǎn)比較，P＜0.01Fig.2　Expression of Gas7 in the DB of rats at different developmental periods.A，Western blot detection of Gas7；B，statistical analysis of Gas7 protein levels；*，P＜0.01，compared with the previous time point

3 發(fā)育過(guò)程中斜角帶核內(nèi)Gas7空間表達(dá)特點(diǎn)

E16.5時(shí)，斜角帶核水平支（horizontal limb of the diagonal band，HDB）出現(xiàn)藍(lán)色斑片狀或絮狀物結(jié)構(gòu)，斜角帶核垂直支（vertical limb of the diagonal band，VDB）內(nèi)出現(xiàn)少量神經(jīng)細(xì)胞，無(wú)突起，并散在一些藍(lán)色顆粒狀結(jié)構(gòu)。E20.5時(shí)HDB和VDB均可見(jiàn)神經(jīng)細(xì)胞，但細(xì)胞輪廓不清，相比E16.5時(shí)，顆粒大小明顯增大。P0時(shí)，HDB在高倍視野下開(kāi)始有細(xì)胞核出現(xiàn)，染色較深，周?chē)|(zhì)著色相對(duì)較淺；VDB未見(jiàn)胞核，可見(jiàn)較多突起，形態(tài)不規(guī)則。P7時(shí)散在分布一些神經(jīng)細(xì)胞和突起，神經(jīng)細(xì)胞境界較清楚，細(xì)胞數(shù)目明顯增多，細(xì)胞突起較多；HDB較 VDB內(nèi)細(xì)胞著色稍淺。P14時(shí)，細(xì)胞體積增大，境界清楚，胞體呈橢圓形或圓形者居多，可見(jiàn)較多的細(xì)胞突起，此時(shí)VDB灰度值最低，細(xì)胞數(shù)最多，提示此時(shí)VDB內(nèi)Gas7表達(dá)最強(qiáng)烈。P21時(shí)HDB和VDB細(xì)胞大小均進(jìn)一步增大，此時(shí)HDB染色最深，細(xì)胞數(shù)最多，提示HDB在這一時(shí)間點(diǎn)Gas7表達(dá)水平最高。成年時(shí)HDB和VDB細(xì)胞大小及形態(tài)與P21時(shí)相比無(wú)明顯改變。HDB和VDB內(nèi)Gas7達(dá)峰時(shí)間點(diǎn)不同，提示Gas7對(duì)二者的調(diào)控作用可能不同。（圖3，表1，表2）

圖3　大鼠發(fā)育過(guò)程中　Gas7在　HDB和VDB表達(dá)的免疫組織化學(xué)檢測(cè)；比例尺，25μmFig.3　Immunohistochemical detection of Gas7 expression in HDB and VDB in the development of the rats.Scale bar，25μm

表1　大鼠發(fā)育過(guò)程中　DB內(nèi)Gas7免疫反應(yīng)性變化Table 1　Change of Gas7 immunoreactivity in the DB during rat development

表2　大鼠發(fā)育過(guò)程中DB內(nèi)　Gas7免疫陽(yáng)性平均細(xì)胞數(shù)變化Table 2　Change of the average number of Gas7 positive cells in the DB during rat development

討　論

隔區(qū)亞細(xì)胞核團(tuán)按位置可分為背內(nèi)側(cè)、腹外側(cè)、背側(cè)和尾側(cè)四個(gè)核群。腹外側(cè)核群主要為外側(cè)隔核（LS，lateral septal nucleus），可影響下丘腦內(nèi)分泌調(diào)節(jié)、自主反應(yīng)和攝食行為；背側(cè)核群主要為終紋床核（BNST，bed nucleus of stria terminals）與神經(jīng)內(nèi)分泌和內(nèi)臟活動(dòng)有關(guān)；尾側(cè)核群分為海馬傘核（SFi，septafimbrial nucleus）和三角隔核（TS，triargular septal nuleus）與情緒有關(guān)；背內(nèi)側(cè)核群分為內(nèi)側(cè)隔核（MS，media septum）和DB，以前連合交叉平面為界，將DB分為后方的HDB和前方的VDB。背、腹側(cè)海馬及海馬后部均有纖維投射到VDB，且腹海馬投射到 VDB的纖維多于背海馬到 VDB的投射，同時(shí)，VDB背、腹側(cè)部均有纖維投射至背、腹側(cè)海馬及海馬后部，其投射量占隔-海馬通路的1／3，在功能上與學(xué)習(xí)和記憶有關(guān)。此外，杏仁外側(cè)核投射至VDB背、腹側(cè)部及HDB，而杏仁皮質(zhì)核只投射至VDB；以前曾有學(xué)者推測(cè)藍(lán)斑有纖維投射至VDB和HDB，后經(jīng)Font等的實(shí)驗(yàn)得到證實(shí)［11］。近期實(shí)驗(yàn)證明，通過(guò)注射RXFP3激活MS／DB（內(nèi)側(cè)隔核／斜角帶核復(fù)合體）內(nèi)的ERK磷酸化，可使大鼠的空間記憶功能受損［12］，而注射丁卡因、東莨菪堿等毒蕈堿藥物或持續(xù)接觸錳等有毒物質(zhì)時(shí)，由于其毒性作用，使MS／DB內(nèi)的膽堿能神經(jīng)元受損，大鼠的連續(xù)條件反射的精確性下降［13，14］。DB除參與到阿爾茨海默病的病理過(guò)程中外［10］，還可通過(guò)抑制DB神經(jīng)細(xì)胞的凋亡，有效改善由一型糖尿病引起學(xué)習(xí)和記憶障礙［15］。因此，研究DB發(fā)育過(guò)程中新的調(diào)控因子，有助于豐富DB發(fā)育的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，并為與DB相關(guān)的神經(jīng)系統(tǒng)功能和疾病提供新的改善和治療靶點(diǎn)。

Gas7首先發(fā)現(xiàn)于生長(zhǎng)停滯的NIH3T3成纖維細(xì)胞內(nèi)，其不但參與胚胎干細(xì)胞的遷移和保護(hù)，與細(xì)胞早期的分化和形態(tài)的形成有關(guān)，還能促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的發(fā)育、分化和成熟，在神經(jīng)元突起的形成和延伸過(guò)程中起重要作用。Gas7與PCH蛋白在基因序列上具有高度相似性，PCH蛋白可協(xié)同調(diào)節(jié)細(xì)胞的分裂、肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的重構(gòu)和細(xì)胞膜的動(dòng)力學(xué)特性，這種功能的實(shí)現(xiàn)，依賴于PCH蛋白中的一個(gè)結(jié)構(gòu)，即FCH結(jié)構(gòu)域［16］。同樣，Gas7基因序列中也存在FCH結(jié)構(gòu)域［3］，Gas7通過(guò)它與細(xì)胞骨架成分F-actin結(jié)合，進(jìn)而介導(dǎo)微絲的組裝和／或去組裝，參與細(xì)胞的生長(zhǎng)過(guò)程，并可促進(jìn)細(xì)胞突起的形成。另有實(shí)驗(yàn)表明，Gas7基因敲除的小鼠，微管蛋白的延伸功能受損，提示Gas7是細(xì)胞穩(wěn)定生長(zhǎng)的重要因素［17］。本實(shí)驗(yàn)免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，HDB和VDB在胚胎期均無(wú)典型形態(tài)的Gas7陽(yáng)性細(xì)胞，陽(yáng)性產(chǎn)物呈絮狀或斑片狀，著色較淺，P0和P7時(shí)出現(xiàn)Gas7陽(yáng)性細(xì)胞，染色加深，但無(wú)清晰可見(jiàn)的細(xì)胞突起，不同于HDB，VDB在P7時(shí)細(xì)胞數(shù)達(dá)到最大，P14時(shí)著色最深，HDB在P21時(shí)細(xì)胞數(shù)最多，著色最深。胚胎期大鼠DB內(nèi)有Gas7表達(dá)，但并不出現(xiàn)陽(yáng)性神經(jīng)元，提示這一時(shí)期Gas7并沒(méi)有作用于神經(jīng)元，或者可能表達(dá)于神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞；近期有文獻(xiàn)報(bào)道適量的Gas7表達(dá)可促進(jìn)神經(jīng)元的遷移［18］，本實(shí)驗(yàn)中，VDB在P7是細(xì)胞數(shù)最多，在P14時(shí)染色最深，提示VDB在P7時(shí)可能已完成神經(jīng)元的遷移，P14時(shí)染色進(jìn)一步加深可能表明此時(shí)神經(jīng)元細(xì)胞并未完全成熟，Gas7表達(dá)仍然處于峰值。對(duì)比HDB中 Gas7的表達(dá)，提示Gas7在參與DB的發(fā)育過(guò)程中，對(duì)其內(nèi)的兩個(gè)核團(tuán)的調(diào)控有時(shí)間上的先后順序，這種調(diào)控時(shí)序的不同是否與核團(tuán)的功能相關(guān)，有待進(jìn)一步研究。

通過(guò)RT-PCR和Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Gas7在DB的表達(dá)均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，胚胎期Gas7表達(dá)較弱，隨著時(shí)間推移和核團(tuán)的不斷發(fā)育，Gas7表達(dá)逐漸增強(qiáng)，至P21達(dá)到高峰，成年后又有所減弱。圍生期（E16.5、E20.5、P0、P7、P14、P21）是DB神經(jīng)細(xì)胞發(fā)育和成熟、細(xì)胞突起形成和構(gòu)建的最重要時(shí)期，根據(jù)本實(shí)驗(yàn)結(jié)果，DB內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞在圍生期已基本成熟。結(jié)合Gas7在DB發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)，提示Gas7不僅參與了DB神經(jīng)細(xì)胞突起的形成和延伸以及突起的構(gòu)建和重塑，且對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的發(fā)育和成熟起到一定的調(diào)控作用。但圍生期以外，成年至老年大鼠的Gas7表達(dá)如何，尚待進(jìn)一步研究。

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Expression of Gas7 in the development of rat diagonal band nucleus

Wang Jisheng,Hou Liangqin,Xiong Keren*
（Department of Anatomy，Wannan Medical College，Wuhu 241002，China)

Objective To investigate the expression of growth arrest-specific protein 7(Gas7)in the diagonal band nucleus (DB)of rats at different developmental stages.Methods RT-PCR,Western blot and the immunohistochemistry were used to study the expression and histological localization of Gas7 protein in the DB of the septal area in rats at seven developmental stages:embryo 16.5-day(E16.5),E20.5,postnatal 0-day(P0),P7,P14,P21,and 2-month-old(adult).Results RT-PCR and Western blot results showed that the expression of Gas7 was the weakest at E16.5,then gradually increased and reached a peak at P21.Gas7 positive staining was observed in the horizontal limb of the diagonal band(HDB)through immunohistochemistry at E16.5 and E20.5；Gas7 positive immunoreactive product appeared at P0,while the positive cells and stain reached peak at P21.The number of Gas7 positive cells in the vertical limb of the diagonal band(VDB)reached maximum at P14,while reduced at P21 and the adult period.Conclusion The expression of Gas7 in the DB of the septal area in rats showed specificity in both time and space,suggesting that Gas7 may be involved in the development of DB in the septal area.

Growth arrest-specific protein 7；development；diagonal band nucleus；rat

Q132.4

A

10.16705／j.cnki.1004-1850.2016.05.006

2016-07-23

2016-10-10

安徽省高校省級(jí)自然科學(xué)項(xiàng)目（11040606M162）；安徽省名師工作室（2014msgzs 152）；皖南醫(yī)學(xué)院中青年科研基金項(xiàng)目（WK 201618）

王繼勝，男（1980年），漢族，助教

（To whom correspondence should be addressed）：xkrn＠sohu.com