鞏艷，李文燕，鄭昕蕊，李雪雪，張紅霞，于麗*，江洪

（1濰坊醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院，濰坊 261053；2濰坊市人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，濰坊 261041）

妊娠期大氣細(xì)顆粒物暴露對新生小鼠肝臟發(fā)育的影響

鞏艷1，李文燕1，鄭昕蕊1，李雪雪1，張紅霞1，于麗1*，江洪2*

（1濰坊醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院，濰坊 261053；2濰坊市人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，濰坊 261041）

目的 建立小鼠妊娠期大氣細(xì)顆粒物（fine particulate matter，AD≤2.5um，PM2.5）暴露模型，探討妊娠期PM2.5暴露對新生小鼠肝臟發(fā)育的影響。方法 孕鼠隨機(jī)分為對照組、PM2.5低劑量組、PM2.5中劑量組，利用氣管滴注方法分別向PM2.5低、中劑量組注入濃度為0.2592μg／μl、1.56695μg／μl的30μl PM2.5混懸液，對照組注入相同體積磷酸鹽緩沖液。孕期間斷滴注7次。HE染色觀察新生小鼠肝臟的組織結(jié)構(gòu)變化，免疫組織化學(xué)技術(shù)和Western blot技術(shù)觀察新生小鼠肝臟PCNA和caspase-3蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果 PM2.5中劑量組新生小鼠肝臟中可見明顯病理學(xué)改變，肝細(xì)胞水腫，明顯脂肪變性。隨著滴注劑量的增加，免疫組織化學(xué)技術(shù)顯示肝臟PCNA陽性細(xì)胞數(shù)逐漸減少，caspase-3陽性細(xì)胞數(shù)逐漸增多；Western blot技術(shù)顯示PM2.5暴露后新生小鼠肝臟PCNA蛋白表達(dá)量有不同程度降低，caspase-3蛋白表達(dá)量升高。結(jié)論 妊娠期PM2.5暴露可通過抑制肝細(xì)胞的增殖和促進(jìn)其凋亡，從而影響新生小鼠肝臟的發(fā)育，并產(chǎn)生病理損害。

妊娠期；PM2.5；新生小鼠；肝臟；PCNA；caspase-3

近年來，隨著霧霾天氣越來越嚴(yán)重，大氣污染成為備受全球關(guān)注的環(huán)境問題，其中PM2.5是影響大氣環(huán)境質(zhì)量和人體健康的主要危害因素之一［1］。PM2.5也稱細(xì)顆粒物，是指空氣動(dòng)力學(xué)直徑小于或等于2.5μm的顆粒物，因其顆粒物的粒徑較小，表面積大，易滯留在體內(nèi)，因此對人體的危害更大［2-3］。大氣中PM2.5主要來源于人類活動(dòng)、污染源的排放以及氣象條件。前期實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)妊娠期PM2.5暴露損傷孕鼠多種器官并抑制妊娠及胎兒生長發(fā)育［4］。肝臟對來自體內(nèi)和體外的許多非營養(yǎng)性物質(zhì)如各種藥物、毒物以及體內(nèi)某些代謝產(chǎn)物，具有生物轉(zhuǎn)化作用。當(dāng)肝臟受到體外毒物及其他有害物質(zhì)的侵入時(shí)，其結(jié)構(gòu)可能會(huì)受到不同程度的損害。因此，本研究選取備受關(guān)注大氣細(xì)顆粒物（PM2.5）和新生小鼠肝臟作為研究對象，通過建立PM2.5暴露的孕鼠動(dòng)物模型，觀察新生小鼠肝臟病理結(jié)構(gòu)及肝臟組織PCNA和caspase-3蛋白的表達(dá)變化，探討妊娠期PM2.5暴露對新生小鼠肝臟發(fā)育的影響，從而為研究PM2.5在妊娠期暴露對人類胎兒肝臟發(fā)育的影響提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材料與方法

1 PM2．5標(biāo)本的采樣和處理［4］

采用大氣顆粒物采樣器，收集2012年12月～2013年3月采暖季某地級(jí)市城區(qū)大氣PM2.5。將載有顆粒物的濾膜裁剪為小塊，浸入去離子水中，低溫超聲振蕩30 min4次，洗脫細(xì)顆粒物，收集濾液，真空冷凍干燥，收集PM2.5并于-20℃保存。滴注時(shí)，以PBS為溶劑配制成需要的濃度，超聲振蕩混勻滅菌。

2 妊娠期PM2．5暴露小鼠模型的制備

昆明雌鼠30只，雄鼠15只，體重30～38g，由青島動(dòng)物中心提供。小鼠適應(yīng)一周后，按雌雄2：1比例合籠，于每日早8點(diǎn)檢查雌鼠陰道，有精子者定為妊娠第1d，并隨機(jī)分為3組，每組10只。在確認(rèn)雌鼠妊娠當(dāng)天直至妊娠終止，雌鼠經(jīng)4%水合氯醛麻醉后，按照氣管滴注的方法，實(shí)驗(yàn)組每3d給予一次PM2.5混懸液30μl，濃度分別為：中劑量組1. 56695μg／μl，低劑量組0.2592μg／μl，對照組每3d給予一次PBS 30μl。妊娠期共滴注7次。普通飼料喂養(yǎng)，自由飲水。實(shí)驗(yàn)合理使用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行研究，并經(jīng)過動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

3 新生小鼠肝臟病理學(xué)觀察

新生小鼠出生當(dāng)天，每組隨機(jī)選取6只，雌雄各半，剖腹取出肝臟組織，4%多聚甲醛固定保存，制備石蠟切片，切片厚度為4μm，烤片，脫蠟入水，蘇木素-伊紅染色，脫水透明，中性樹膠封片。

4 PCNA和caspase-3蛋白表達(dá)的Western blot檢測

分離新生小鼠肝臟組織，將肝臟組織置于冰上，4℃12000r／min離心15min，提取上清，用BCA法測定蛋白濃度。將20μg蛋白樣品進(jìn)行10%SDS-PADE電泳，恒壓80V將蛋白轉(zhuǎn)自PVDF膜（Millipore），轉(zhuǎn)膜時(shí)間100min。將PVDF膜置于5%脫脂奶粉室溫?fù)u床封閉抗原2h后放入TBST稀釋小鼠抗PCNA（1：1000，Abcam）或兔抗cleaved-caspase-3（（1：800，Abcam）中4℃冰箱孵育過夜，用TBST稀釋辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗小鼠IgG（1：2000）或羊抗兔IgG（1：2000）室溫?fù)u床2h，ECL發(fā)光液（Thermo）反應(yīng)3min，在暗室中進(jìn)行曝光顯影定影。小鼠抗β-actin（1：6000，北京中杉金橋生物技術(shù)公司）檢測內(nèi)參蛋白，檢測方法相同。利用凝膠成像儀分析軟件進(jìn)行光密度測定分析。每組取3張Western blot顯影膠片置于掃描儀掃描，用Quntity one圖像分析軟件測定Western blot顯示條帶的光密度值，進(jìn)行目的條帶與內(nèi)參條帶光密度比值計(jì)算、分析。

5 PCNA、caspase-3表達(dá)的免疫組織化學(xué)檢測

采用S-P免疫組織化學(xué)二步染色法檢測肝組織PCNA、caspase-3蛋白的表達(dá)。每組隨機(jī)選取6只新生小鼠肝臟石蠟切片，經(jīng)脫蠟入水、熱抗原修復(fù)、3%過氧化氫封閉30min、10%羊血清封閉30min，分別加入PCNA（1：10000）、cleavd-caspase-3（1：1000）抗體4℃過夜；羊抗小鼠IgG（1：2000）或羊抗兔IgG（1：2000）二抗孵育、DAB顯色、脫水透明、中性樹膠封片，每組共得出12張圖像。用圖像分析軟件分別對采集圖像的PCNA、caspase-3陽性細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)得出累積光密度值（IOD），并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用SPSS22．0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，計(jì)量資料兩兩比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.01為差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)　果

1 妊娠期PM2．5暴露引起新生小鼠肝臟損害

HE染色結(jié)果顯示，PM2.5中劑量組新生小鼠肝臟肝細(xì)胞排列紊亂，胞漿疏松化，可見明顯病理學(xué)改變，包括大多數(shù)肝細(xì)胞水腫，輕度脂肪變，及少量炎細(xì)胞浸潤；PM2.5低劑量組僅可見輕度肝細(xì)胞水腫（圖1）。

圖1　妊娠期PM2.5暴露后新生小鼠肝臟組織形態(tài)學(xué)改變（HE染色）。箭頭示肝細(xì)胞脂肪變性；比例尺：A1，B1 and C1：50μm；A2，B2 and C2：20μmFig.1　Histomorphological chances of newborn mouse liver after gestational exposure to PM2.5（HE staining）.Arrows indicate fatty degeneration of liver cells；scale bar：50μm in A1，B1 and C1；20μm in A2，B2 and C2.

2 妊娠期PM2．5暴露降低新生小鼠肝臟PCNA水平

Western blot檢測顯示，PCNA在各組新生小鼠肝臟組織提取的總蛋白中均有表達(dá)，隨PM2.5滴注劑量的增加，PCNA蛋白的表達(dá)量有不同程度降低（圖2A），以中劑量組更為明顯。

免疫組織化學(xué)染色顯示，PCNA蛋白表達(dá)部位主要在細(xì)胞核，呈黃色或棕黃色顆粒，表示肝細(xì)胞對PCNA的表達(dá)程度強(qiáng)弱不等（圖2B1）。對照組肝臟組織PCNA陽性細(xì)胞數(shù)多，染色較深，多數(shù)為肝細(xì)胞；與對照組相比，PM2.5低劑量組PCNA陽性細(xì)胞數(shù)量略有減少，而PM2.5中劑量組PCNA陽性細(xì)胞數(shù)量減少明顯，且染色淺，表達(dá)程度較低。圖像分析結(jié)果顯示，與對照組比較，PM2.5中劑量組新生小鼠肝臟PCNA陽性細(xì)胞數(shù)明顯減少，累積光密度值降低；而PM2.5低劑量組與對照組比較，新生小鼠肝臟PCNA陽性細(xì)胞數(shù)略有減少，累積光密度值略有降低（圖2B2）。

圖2　妊娠期PM2.5暴露后新生小鼠肝臟PCNA蛋白的表達(dá)。A1，新生小鼠肝臟PCNA蛋白表達(dá)水平的Western blot檢測；A2，新生小鼠肝臟PCNA蛋白表達(dá)水平Western blot檢測的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；B1，新生小鼠肝臟PCNA蛋白表達(dá)的代表性免疫組織化學(xué)檢測（a，對照組；b，PM2.5低劑量組；c，PM2.5中劑量組）；比例尺，20μm；B2，新生小鼠肝臟PCNA蛋白表達(dá)免疫組織化學(xué)檢測的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；*，與對照組比較，0.01＜P＜0.05；**，與對照組比較，P＜0.01Fig.2　Expression of PCNA protein in newborn mouse liver after gestational exposure to PM2.5.A1，Western blot detection of PCNA level in newborn mouse liver；A2，statistical analysis of the PCNA level detected by Western blot in newborn mouse liver；B1，representative immunohistochemical detection of PCNA expression in newborn mouse liver（a，the control group；b，PM2.5low dose group；c，PM2.5medium dose group）；scale bar，20μm；B2，statistical analysis of PCNA expression detected by immunohistochemistry in newborn mouse liver；*，0.01＜P＜0.05，compared with the control group；**，P＜0.01，compared with the control group

3 妊娠期PM2．5暴露后新生小鼠肝臟cleavedcaspase-3蛋白表達(dá)升高

Western blot檢測顯示，cleaved-caspase-3在各組新生小鼠肝臟組織提取的總蛋白中均有表達(dá)，PM2.5暴露后cleaved-caspase-3水平明顯增加，中劑量滴注動(dòng)物增加更明顯（圖3A）。

免疫組織化學(xué)染色顯示，cleaved-caspase-3表達(dá)部位在細(xì)胞漿及細(xì)胞核周，呈棕黃色或黃色顆粒。對照組中，cleaved-caspase-3陽性的肝細(xì)胞很少，僅肝血竇區(qū)可見少量cleaved-caspase-3陽性細(xì)胞，且染色較淺，呈低度表達(dá)；PM2.5低劑量組cleaved-caspase-3陽性的肝細(xì)胞也很少，但肝血竇區(qū)可見較多cleaved-caspase-3陽性細(xì)胞；PM2.5中劑量組cleavedcaspase-3陽性的肝細(xì)胞增多，且PM2.5中劑量組肝血竇區(qū)可見較多cleaved-caspase-3陽性細(xì)胞且染色較深，表達(dá)程度高（圖3B1）。圖像分析結(jié)果顯示，與對照組比較，PM2.5低劑量組新生小鼠肝臟組織cleaved-Caspase-3陽性細(xì)胞數(shù)增多，累積光密度值升高，且隨著滴注劑量的增加，新生小鼠肝臟組織cleaved-Caspase-3陽性細(xì)胞數(shù)增多明顯，累積光密度值升高也明顯（圖3B2）。

圖3　妊娠期PM2.5暴露后新生小鼠肝臟　cleaved-caspase-3蛋白的表達(dá)。A1，新生小鼠肝臟cleaved-caspase-3蛋白表達(dá)水平的　Western blot檢測；A2，新生小鼠肝臟cleaved-caspase-3蛋白表達(dá)水平Western blot檢測的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；B1，新生小鼠肝臟cleaved-caspase-3蛋白表達(dá)的代表性免疫組織化學(xué)檢測（a，對照組；b，PM2.5低劑量組；c，PM2.5中劑量組）；比例尺，20μm；B2，新生小鼠肝臟　cleavedcaspase-3蛋白表達(dá)免疫組織化學(xué)檢測的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；*，與對照組比較，0.01＜P＜0.05；**，與對照組比較，P＜0.01Fig.3　Expressions of cleaved-caspase-3 protein in newborn mouse liver after gestational exposure to PM2.5.A1，Western blot detection of cleaved-caspase-3 level in newborn mouse liver；A2，statistical analysis of the cleaved-caspase-3 level detected by Western blot in newborn mouse liver；B1，representative immunohistochemical detection of cleaved-caspase-3 expression in newborn mouse liver（a，the control group；b，PM2.5low dose group；c，PM2.5medium dose group）scale bar，20μm；B2，statistical analysis of cleaved-caspase-3 expression detected by immunohistochemistry in newborn mouse liver；*，0.01＜P＜0.05，compared with the control group；**，P＜0.01，compared with the control group

討 論

大氣細(xì)顆粒物（PM2.5）是空氣中一種非均質(zhì)的混合物，是普遍存在的環(huán)境污染物，其化學(xué)組成和顆粒物的大小不同取決于其來源及化學(xué)轉(zhuǎn)變形式。PM2.5組成成分復(fù)雜，可吸附大量重金屬元素和有毒有機(jī)污染物，通過支氣管和肺泡進(jìn)入血液循環(huán)并經(jīng)胎盤直接影響孕婦和新生兒。中國國家環(huán)境保護(hù)部發(fā)布了新環(huán)境空氣質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)（GB 3095-2012），課題設(shè)計(jì)的低劑量組按照其規(guī)定的PM2.5日均劑量的上限值計(jì)算，中劑量組依據(jù)監(jiān)測到的最大日均值計(jì)算［4］。前期實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)妊娠期PM2.5暴露損傷孕鼠多種器官并抑制妊娠及胎兒生長發(fā)育［4-5］。大量研究還發(fā)現(xiàn)，大氣細(xì)顆粒物能夠引起遺傳性DNA損傷，即生殖細(xì)胞的DNA損傷可遺傳至下一代［6］。妊娠期高濃度PM2.5暴露可以影響嬰兒的生長發(fā)育，對新生兒產(chǎn)生不良影響［7-8］。

有文獻(xiàn)證實(shí)，成年大鼠氣管灌注PM2.5混懸液后，重金屬鉛、錳在肝內(nèi)的沉積顯著升高。高濃度的PM2.5刺激肝臟失代償，肝臟解毒功能受損［9］；PM2.5成分中含有的重金屬及有毒有機(jī)污染物，可通過胎盤屏障，直接損傷胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞，引起胎盤的炎癥反應(yīng)和氧化損傷，進(jìn)一步影響母體與胎兒的物質(zhì)交換和轉(zhuǎn)運(yùn)，造成胎兒的營養(yǎng)供應(yīng)不足，阻礙胎兒的生長發(fā)育［10］。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，PM2.5中劑量組新生小鼠肝臟可見大量肝細(xì)胞水腫，輕度脂肪變的病理學(xué)改變，說明PM2.5作為體外毒物通過肝生物轉(zhuǎn)化和代謝導(dǎo)致新生小鼠肝臟結(jié)構(gòu)改變?？梢奝M2.5成分可穿過母體胎盤屏障，對新生小鼠肝臟造成病理學(xué)改變，進(jìn)而引發(fā)炎性損傷。

增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）是一種核內(nèi)合成所必需的、無種屬和組織特異性、廣泛存在于增殖活性細(xì)胞中的細(xì)胞周期相關(guān)蛋白，是DNA聚合酶的輔因子，其陽性程度，可以直接反應(yīng)DNA復(fù)制的活躍程度［11］。通過研究PCNA可以了解肝細(xì)胞增殖狀態(tài)，其含量越高，細(xì)胞增殖越活躍。新生鼠肝細(xì)胞處于增殖非常活躍的時(shí)期，當(dāng)受到體外毒物的浸入時(shí)，其增殖活性可能被抑制。研究顯示，PM2.5中劑量組新生小鼠肝組織PCNA蛋白表達(dá)水平明顯低于對照組。說明妊娠期PM2.5暴露可以抑制肝細(xì)胞增殖，抑制新生小鼠肝細(xì)胞PCNA蛋白的表達(dá)，進(jìn)一步說明妊娠期PM2.5暴露可致新生小鼠肝細(xì)胞損傷，從而影響新生小鼠肝臟發(fā)育。

Caspase家族蛋白酶的激活在細(xì)胞凋亡過程中起著重要的作用，而cleaved-caspase-3是最重要的凋亡執(zhí)行者，因此cleaved-caspase-3是應(yīng)用較多的細(xì)胞凋亡水平檢測指標(biāo)［12］。通過檢測cleaved-caspase-3可以了解肝細(xì)胞凋亡狀態(tài)，其水平越高，細(xì)胞凋亡越嚴(yán)重。有研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)肝細(xì)胞受到病理損傷時(shí)，可抑制細(xì)胞增殖的活性和促進(jìn)細(xì)胞凋亡的發(fā)生［13］。本研究顯示，PM2.5低劑量組及PM2.5中劑量組新生小鼠肝組織cleaved-caspas-3水平明顯高于對照組，說明妊娠期PM2.5暴露可激活新生小鼠肝細(xì)胞caspase-3，以誘發(fā)肝細(xì)胞凋亡，進(jìn)一步說明妊娠期PM2.5暴露可致新生小鼠肝細(xì)胞損傷，從而影響新生小鼠肝臟發(fā)育。

本研究采取氣管滴注大氣細(xì)顆粒物的暴露方式，較好地模仿了人群大氣細(xì)顆粒物吸入量，從一定程度上為評估大氣細(xì)顆粒物對新生兒健康危害提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。研究結(jié)果表明：母鼠妊娠期PM2.5暴露可引起其新生小鼠肝臟結(jié)構(gòu)改變、PCNA陽性表達(dá)減少、cleaved-caspas-3陽性表達(dá)升高，表明一定水平的大氣細(xì)顆粒物可以對新生小鼠肝臟發(fā)育產(chǎn)生影響，可為全面評價(jià)PM2.5對機(jī)體的毒性、防治環(huán)境污染物毒性作用提供理論基礎(chǔ)，具有一定的科學(xué)價(jià)值和現(xiàn)實(shí)意義，其相關(guān)機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。

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Effects of gestational exposure to atmospheric fine particulate matter on liver development of newborn mice

Gong Yan1,Li Wenyan1,Zheng Xinrui1,Li Xuexue1,Zhang Hongxia1,Yu Li1*,Jiang Hong2*
（1Clinical medicine college，Weifang Medical University，Weifang 261053，China；2Department of Gynecology and Obstetrics，Weifang People＇s Hospital，Weifang 261041，China）

Objective To establish mice model of exposure to atmospheric fine particles matter(AD≤2.5um,PM2.5)during gestation to investigate the effects of PM2.5on the development of liver in newborns.Methods Pregnant mice were randomly divided into three groups:the control group,PM2.5low dose group,and PM2.5medium dose group.The tracheal instillation method was used to inject the experimental groups of mice with 30μl PM2.5suspension of different doses(low dose:0.2592 μg／μl,medium dose: 1.56695 μg／μl)respectively,and the control group with phosphate buffer saline of the same volume.The instillation was intermittently performed for a total of seven times during pregnancy.The liver structural change was observed with HE staining in newborn mouse, and the expressions of PCNA and caspase-3 proteins were detected by immunohistochemistry and Western blot.Results Compared with the control group,obvious pathological changes were observed in the livers of newborn mice in the medium dose group of PM2.5exposure,including liver cell edema and significant fatty degeneration.Immunochemistry results showed that the number of PCNA positive liver cells decreased with the increase of instilled PM2.5dose,while that of caspase-3 positive cells increased.Western blot showed that the expression of PCNA protein decreased while caspase-3 increased to varying degrees in the newborn mouse liver after gestational PM2.5exposure.Conclusion PM2.5exposure during gestation can affect newborn mouse liver development and cause pathological lesion through the inhibition of liver cell proliferation and promotion of its apoptosis.

Pregnancy；PM2.5；newborn mouse；liver；PCNA；caspase-3

R317

A

10.16705／j.cnki.1004-1850.2016.05.005

2016-07-15

2016-10-10

山東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（ZR2014JL016）

鞏艷，女（1988年），漢族，研究生在讀

（To whom correspondence should be addressed）：yulidoctor＠wfmc.edu.cn，jianghongwf＠126.com