武洪志，宋玉卓，王志龍，郭照宙，許靈敏，王芳芳，刁華杰，許麗，刁新平

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，黑龍江哈爾濱150030）

枯草芽孢桿菌發(fā)酵復(fù)方中草藥工藝優(yōu)化

武洪志，宋玉卓，王志龍，郭照宙，許靈敏，王芳芳，刁華杰，許麗，刁新平*

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，黑龍江哈爾濱150030）

為研究枯草芽孢桿菌發(fā)酵復(fù)方中草藥飼料添加劑的最佳工藝，通過單因素和響應(yīng)面相結(jié)合的試驗(yàn)方法對(duì)枯草芽孢桿菌發(fā)酵復(fù)方中草藥生產(chǎn)工藝進(jìn)行優(yōu)化。選用枯草芽孢桿菌對(duì)復(fù)方中草藥進(jìn)行發(fā)酵，以復(fù)方中草藥多糖含量為檢測(cè)指標(biāo)，在接菌量、含水量、發(fā)酵時(shí)間和發(fā)酵溫度4個(gè)單因素的基礎(chǔ)上，選擇對(duì)發(fā)酵效果影響較大的關(guān)鍵因素進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)來進(jìn)一步優(yōu)化。結(jié)果表明∶4個(gè)單因素中，含水量、接菌量和發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵效果影響較大，為關(guān)鍵因素，經(jīng)響應(yīng)面法進(jìn)一步優(yōu)化后得出最佳條件為含水量為51.50%，接種量為3.60%，發(fā)酵時(shí)間為2.7 d，此條件下測(cè)得復(fù)方中草藥多糖含量平均值為19.59%，與響應(yīng)面預(yù)測(cè)值19.78%接近，相較于未發(fā)酵復(fù)方中草藥中12.70%的復(fù)方中草藥多糖，發(fā)酵后復(fù)方中草藥多糖含量提高了55.75%。

飼料添加劑；復(fù)方中草藥；發(fā)酵；工藝優(yōu)化

中草藥早已以添加劑的形式應(yīng)用于畜牧生產(chǎn)中，但其炮制過程仍以熬制為主，這極大程度限制了其推廣應(yīng)用。中草藥經(jīng)發(fā)酵后其有效成分得到極大程度的釋放，藥效也達(dá)到最佳狀態(tài)（李洪龍等，2007）。蒼術(shù)、白術(shù)、黃柏、板藍(lán)根、山楂、甘草等中草藥均能不同程度提高動(dòng)物機(jī)體的免疫力，且無毒副作用，也不存在殘留問題（張鵬，2013）。本試驗(yàn)以上述幾種中草藥為配伍，用枯草芽孢桿菌對(duì)其進(jìn)行發(fā)酵，使其有效成分得到最大程度的釋放，為其在飼料中的應(yīng)用提供依據(jù)。

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)材料中草藥:復(fù)方中草藥中蒼術(shù)、白術(shù)、黃柏、板藍(lán)根、甘草、山楂等均購自哈爾濱三棵樹中藥材市場(chǎng)，65℃烘干，粉碎后過40目篩，備用。

供試菌種:枯草芽孢桿菌，購于智薈生物科技股份有限公司。

試驗(yàn)試劑:LB培養(yǎng)基、葡萄糖、乙醇、濃鹽酸、蒽酮、濃硫酸等試劑均為分析純，購于哈爾濱市德美實(shí)驗(yàn)儀器經(jīng)銷有限公司；酶聯(lián)免疫試劑盒:免疫球蛋白A（IgA）、免疫球蛋白M（IgM）、免疫球蛋白G（IgG），購于R＆D公司；生化指標(biāo):總蛋白（TP）、總膽固醇（CHOL）、生長(zhǎng)激素（GH），均由黑龍江電力醫(yī)院檢測(cè)。

試驗(yàn)儀器設(shè)備:制冰機(jī)（FM100，GRANT）、高速離心機(jī)（Allegra 64R）、美國(guó)BACKMAN全自動(dòng)生化分析儀等均由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1中草藥發(fā)酵前的預(yù)處理將中草藥于65℃烘箱中烘干，粉碎后過40目篩，于紫外燈下滅菌，放置到超凈工作臺(tái)中備用。

1.2.2 LB培養(yǎng)基的配制本試驗(yàn)采用液體LB培養(yǎng)基。配制1 L培養(yǎng)基，需要在950 mL去離子水中加入10 g胰蛋白胨、5 g酵母提取物和10 g氯化鈉，攪拌直至溶質(zhì)完全溶解，之后用5 mol/L氫氧化鈉調(diào)pH至7.0。用去離子水定容至1 L，然后121℃高壓蒸汽滅菌20 min，放置到超凈工作臺(tái)中備用。

1.2.3枯草芽孢桿菌菌種活化在超凈工作臺(tái)中，用無菌水將枯草芽孢桿菌菌粉充分溶解，然后用移液槍準(zhǔn)確吸取1 mL該菌溶液加入到裝有99 mL液體LB培養(yǎng)基的三角瓶中，搖勻封口，于37℃電熱恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，連續(xù)培養(yǎng)兩代，之后采用平板計(jì)數(shù)法檢測(cè)枯草芽孢桿菌的數(shù)量，當(dāng)達(dá)到109個(gè)/mL時(shí)，即視為達(dá)標(biāo)。最后用接種環(huán)轉(zhuǎn)接到裝有100 mL液體LB培養(yǎng)基的三角瓶中，封口密封，于37℃電熱恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，備用。

1.2.4接種發(fā)酵準(zhǔn)確稱取粉碎烘干后的中草藥粉末18份于250 mL三角瓶中，每份22.5 g，將適量無菌水加入到事先活化好的菌液中，搖勻，取出超凈工作臺(tái)中的中草藥（發(fā)酵培養(yǎng)基），加入菌液，邊加邊攪拌。上述操作過程都在無菌環(huán)境中進(jìn)行，并盡快完成。將接種后的中草藥于恒溫培養(yǎng)箱中發(fā)酵適當(dāng)天數(shù)。

1.2.5復(fù)方中草藥發(fā)酵工藝單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)本試驗(yàn)選取接菌量、含水量、發(fā)酵時(shí)間和發(fā)酵溫度為單因素進(jìn)行試驗(yàn)，將活化好的枯草芽孢桿菌接種到復(fù)方中草藥中進(jìn)行發(fā)酵，以復(fù)方中草藥多糖含量為指標(biāo)（蘭時(shí)樂等，2010），試驗(yàn)因素和水平見表1。

1.2.6響應(yīng)面優(yōu)化發(fā)酵工藝

1.2.6.1對(duì)發(fā)酵效果影響較大因素的篩選利用SPSS 20.0對(duì)單因素試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，比較接菌量、含水量、發(fā)酵時(shí)間和發(fā)酵溫度4個(gè)因素之間的差異，篩選出對(duì)發(fā)酵效果影響較大的因素。

表1試驗(yàn)因素和水平

1.2.6.2響應(yīng)面對(duì)發(fā)酵條件的優(yōu)化利用Design Exepert.V.8.0.6.根據(jù)Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)原理，采用響應(yīng)面分析，建立復(fù)方中草藥多糖含量與各關(guān)鍵因素的數(shù)學(xué)模型，來計(jì)算分析復(fù)方中草藥的最佳發(fā)酵條件，從而確定對(duì)發(fā)酵效果影響較大因素的最佳水平組合。

1.2.6.3模型驗(yàn)證試驗(yàn)以優(yōu)化后的最佳水平組合進(jìn)行5次重復(fù)試驗(yàn)，對(duì)該模型的預(yù)測(cè)值進(jìn)行驗(yàn)證，檢驗(yàn)該模型的預(yù)測(cè)結(jié)果是否準(zhǔn)確，通過對(duì)試驗(yàn)結(jié)果與模型預(yù)測(cè)結(jié)果的比較，進(jìn)行可靠性分析，最終確定最優(yōu)發(fā)酵條件組合。

1.3復(fù)方中草藥多糖含量測(cè)定

1.3.1葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制準(zhǔn)確稱取105℃烘干至恒重的葡萄糖樣品10 mg于100 mL容量瓶中，加蒸餾水定容至刻度，搖勻備用。精確量取該溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9 mL，分別置于干凈的具塞試管中，加蒸餾水至1 mL，然后迅速加入4 mL新配制的蒽酮-濃硫酸溶液（準(zhǔn)確稱取0.1 g蒽酮，溶于100 mL 80%的濃硫酸），搖勻后于沸水浴中加熱10 min，冷卻至室溫。以未加葡萄糖樣品的溶液為參比，在625 nm處檢測(cè)其吸光度。根據(jù)所測(cè)結(jié)果繪制出葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線得到回歸方程:y=83.94x+0.012，R2=0.9987。

1.3.2樣品液的制備與測(cè)定準(zhǔn)確稱取烘干至恒重的復(fù)方中草藥樣品0.5 g于150 mL三角瓶中，加入80%乙醇45 mL，靜置30 min后超聲提取30 min，于100 mL容量瓶中過濾，棄上清液，重復(fù)上述操作一次，蒸干濾渣后加入2%鹽酸45 mL，沸水浴提取1 h，充分放冷，于100 mL容量瓶中濾過，重復(fù)操作一次，合并濾液后用2%鹽酸定容至刻度，混勻，取1 mL于25 mL容量瓶中，用2%鹽酸定容至刻度。取上述制備好的溶液1 mL于10 mL干燥潔凈的試管中，加入新配制的蒽酮-濃硫酸溶液4 mL，混勻，沸水浴加熱10 min，充分放冷，在625 nm處測(cè)量其吸光度。樣品經(jīng)紫外分光光度計(jì)測(cè)定后，以標(biāo)準(zhǔn)曲線為準(zhǔn)，計(jì)算得出相應(yīng)的多糖含量，并以如下

式中:W為發(fā)酵復(fù)方中草藥多糖含量；C為標(biāo)準(zhǔn)曲線中相對(duì)應(yīng)的糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)（mg/L）；V為發(fā)酵復(fù)方中草藥試樣稀釋的總體積，L；M為發(fā)酵復(fù)方中草藥樣品的質(zhì)量，g。

2　結(jié)果與分析

2.1復(fù)方中草藥發(fā)酵工藝單因素試驗(yàn)

2.1.1含水量對(duì)發(fā)酵復(fù)方中草藥多糖含量的影響由圖1可見，當(dāng)含水量在30%～80%時(shí)，復(fù)方中草藥多糖含量呈先上升后降低的趨勢(shì)，含水量在50%時(shí)，復(fù)方中草藥多糖含量達(dá)到最大值，因此，選擇含水量50%對(duì)其他因素進(jìn)行篩選。公式計(jì)算出多糖得率:

圖1含水量對(duì)發(fā)酵后多糖含量的影響

2.1.2接菌量對(duì)發(fā)酵后復(fù)方中草藥多糖含量的影響由圖2可見，當(dāng)接菌量在2%～12%時(shí)，復(fù)方中草藥多糖含量呈先上升后降低的趨勢(shì)，接菌量在4%時(shí)，復(fù)方中草藥多糖含量達(dá)到最大值，因此，選擇接菌量4%，含水量50%對(duì)其他因素進(jìn)行篩選。

圖2接菌量對(duì)發(fā)酵后多糖含量的影響

2.1.3發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵后復(fù)方中草藥多糖含量的影響由圖3可見，當(dāng)發(fā)酵時(shí)間為1～6 d時(shí)，復(fù)方中草藥多糖含量呈先上升后降低的趨勢(shì)，發(fā)酵時(shí)間為3 d時(shí)，復(fù)方中草藥多糖含量達(dá)到最大值，因此，選擇發(fā)酵時(shí)間3 d，接菌量4%，含水量50%對(duì)發(fā)酵溫度進(jìn)行篩選。

圖3發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵后多糖含量的影響

2.1.4發(fā)酵溫度對(duì)發(fā)酵后復(fù)方中草藥多糖含量的影響由圖4可見，當(dāng)發(fā)酵溫度為29～39℃時(shí)，復(fù)方中草藥多糖含量呈先上升后降低的趨勢(shì)，發(fā)酵溫度為31℃時(shí)，復(fù)方中草藥多糖含量達(dá)到最大值，因此，最佳發(fā)酵溫度為31℃。

圖4發(fā)酵溫度對(duì)發(fā)酵后多糖含量的影響

2.2利用響應(yīng)面法優(yōu)化復(fù)方中草藥發(fā)酵工藝

2.2.1篩選對(duì)發(fā)酵效果影響較大的因素統(tǒng)計(jì)4個(gè)因素的單因素試驗(yàn)數(shù)據(jù)，用SPSS 20.0軟件對(duì)其結(jié)果進(jìn)行方差分析，并比較4個(gè)因素之間的差異，結(jié)果見表2。通過對(duì)4個(gè)因素F值的比較可知，4個(gè)因素對(duì)發(fā)酵復(fù)方中草藥多糖含量的影響強(qiáng)弱依次為:含水量、發(fā)酵時(shí)間、接菌量、發(fā)酵溫度，因此選擇對(duì)結(jié)果影響較大的含水量、發(fā)酵時(shí)間、接菌量3個(gè)因素進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)。

表2單因素試驗(yàn)結(jié)果方差分析

2.2.2響應(yīng)面優(yōu)化復(fù)方中草藥發(fā)酵工藝根據(jù)Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)原理，選擇含水量（A）、發(fā)酵時(shí)間（B）、接菌量（C）進(jìn)行三因素三水平的響應(yīng)面試驗(yàn)，以復(fù)方中草藥多糖得率（Y）為響應(yīng)值進(jìn)行分析，結(jié)果如表3所示。

通過Design Expert.V.8.0.6.統(tǒng)計(jì)軟件，Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表4。其中2、6、12、15、16組的含水量、發(fā)酵時(shí)間、接菌量分別為50%、3 d、4%，是中心試驗(yàn)組，其他試驗(yàn)組為析因試驗(yàn)組。

表3響應(yīng)面因素水平及設(shè)計(jì)

表4 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及復(fù)方中草藥多糖測(cè)定結(jié)果

其他發(fā)酵條件:發(fā)酵溫度37℃。以復(fù)方中草藥多糖含量為響應(yīng)值，每個(gè)發(fā)酵試驗(yàn)重復(fù)3次。

2.2.3模型的建立及顯著性檢驗(yàn)對(duì)Box-Behnken試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表5。同時(shí)對(duì)模型進(jìn)行可信度分析，結(jié)果見表6。

表5回歸方程統(tǒng)計(jì)分析

用F值檢驗(yàn)三元二次回歸方程各部分對(duì)響應(yīng)值（Y）的影響，由表5可知，該模型的回歸項(xiàng)中P值＜0.0001，說明該模型高度顯著（P＜0.0001）。失擬項(xiàng)P值為0.1868＞0.05，差異不顯著（P＞0.05），說明該模型預(yù)測(cè)結(jié)果與實(shí)際結(jié)果較擬合。R2（回歸模型決定系數(shù)）=0.9545，說明該模型能夠解釋發(fā)酵復(fù)方中草藥多糖含量的95.45%，說明該模型比較可靠，能夠?qū)Πl(fā)酵復(fù)方中草藥多糖含量進(jìn)行預(yù)測(cè)。由表5可知，含水量的二次項(xiàng)A2對(duì)模型影響高度顯著（P＜0.0001），發(fā)酵時(shí)間的二次項(xiàng)B2、接菌量的二次項(xiàng)C2對(duì)模型影響顯著（P＜0.05），其他系數(shù)（含水量A、發(fā)酵時(shí)間B、接菌量C、AB、AC、BC）影響不顯著（P＞0.05）。

對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行二次線性回歸擬合，如表6所示。

表6方程回歸系數(shù)估計(jì)

根據(jù)表6分析，得到三元二次回歸方程:

Y=19.77+0.10A-0.094B-0.14C-5.00E-03AC-0.018BC-1.89A2-0.5B2-0.72C2

2.2.4各因素最佳水平分析對(duì)三元二次回歸方程模型進(jìn)行最優(yōu)化分析，得到各因素的最佳水平，如表7所示。

由表7可知，當(dāng)含水量為51.5%，發(fā)酵時(shí)間為2.7 d，接菌量為3.6%時(shí)預(yù)測(cè)復(fù)方中草藥多糖含量最大值為19.78%，與未發(fā)酵復(fù)方中草藥多糖含量12.70%相比，提高55.75%。

表7各因素的最佳水平分析

2.2.5 Box-Behnken響應(yīng)面及等高線圖結(jié)合三元二次回歸方程，運(yùn)用Design Exepert.V.8.0.6.軟件，繪制兩兩因素的響應(yīng)曲面圖及等高線圖，從中可以直觀地看出兩兩因素的交互作用對(duì)發(fā)酵復(fù)方中草藥多糖含量的影響，如圖1、2、3所示。

圖1含水量和發(fā)酵時(shí)間相互作用對(duì)復(fù)方中草藥多糖含量影響的響應(yīng)面和等高線圖

圖1、2、3可以直觀地反應(yīng)含水量、發(fā)酵時(shí)間和接菌量三因素及其相互作用對(duì)復(fù)方中草藥多糖含量的影響。兩兩因素之間交互作用的強(qiáng)弱是由等高線的形狀來反映的，橢圓形表示交互作用強(qiáng)，圓形表示交互作用弱（武洪志等，2016）。由圖1和圖2可以看出，響應(yīng)面的坡度陡峭、等高線密集，表明含水量和發(fā)酵時(shí)間的交互作用及含水量與接菌量的交互作用對(duì)復(fù)方中草藥多糖含量影響較強(qiáng)；由圖3可知，發(fā)酵時(shí)間和接菌量的交互作用對(duì)復(fù)方中草藥多糖含量影響較弱。

圖2含水量和接菌量相互作用對(duì)復(fù)方中草藥多糖含量影響的響應(yīng)面和等高線圖

圖3發(fā)酵時(shí)間和接菌量相互作用對(duì)復(fù)方中草藥多糖含量影響的響應(yīng)面和等高線圖

2.2.6模型驗(yàn)證試驗(yàn)在含水量51.5%，發(fā)酵時(shí)間為2.7 d，接菌量為3.6%，發(fā)酵溫度為37℃的發(fā)酵條件下，分別進(jìn)行5次驗(yàn)證試驗(yàn)。實(shí)測(cè)發(fā)酵復(fù)方中草藥多糖平均值為19.59%，與預(yù)測(cè)值19.78%接近，進(jìn)一步說明該數(shù)學(xué)模型能夠較好地預(yù)測(cè)實(shí)際發(fā)酵情況。與未發(fā)酵復(fù)方中草藥相比，多糖含量增加54.25%。

3　討論

3.1枯草芽孢桿菌發(fā)酵復(fù)方中草藥工藝優(yōu)化目前，發(fā)酵是提高中草藥多糖提取率最重要的方法之一，發(fā)酵過程中最關(guān)鍵的是對(duì)發(fā)酵條件的優(yōu)化，最常用的分析方法有單因素試驗(yàn)、正交試驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)（Bandaru等，2006）。單因素試驗(yàn)是在假設(shè)各個(gè)因素之間沒有交互作用的前提下，研究各個(gè)因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響，因此分析結(jié)果比較片面，而正交試驗(yàn)與單因素試驗(yàn)相比能夠分析部分因素之間的線性關(guān)系，但其試驗(yàn)結(jié)果只能是試驗(yàn)中某種組合，不會(huì)超越試驗(yàn)所選取水平范圍，倘若因素過多，工作量會(huì)非常大。響應(yīng)面分析方法具有試驗(yàn)次數(shù)少、周期短、回歸方程精度高、能同時(shí)研究各因素間交互作用的特點(diǎn)，單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)合后，單因素試驗(yàn)結(jié)果可以作為響應(yīng)面設(shè)計(jì)因素和水平的依據(jù)，響應(yīng)面可以彌補(bǔ)單因素試驗(yàn)的不足。

3.2單因素試驗(yàn)結(jié)果本次試驗(yàn)選擇了含水量、接菌量、發(fā)酵時(shí)間和發(fā)酵溫度4個(gè)單因素，測(cè)定其對(duì)發(fā)酵復(fù)方中草藥多糖含量的影響。結(jié)果表明，接菌量是發(fā)酵過程中最重要的影響因素，不同水平的接菌量對(duì)發(fā)酵效果有不同的影響。朱秀清等（2012）在微生物發(fā)酵高溫豆粕的菌種篩選及發(fā)酵工藝優(yōu)化的研究中發(fā)現(xiàn)，高溫豆粕的水解度隨接種量的增加呈先上升后下降的趨勢(shì)，與本試驗(yàn)中隨著接菌量的增加多糖含量也呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)一致，因此，適宜的接菌量是保證發(fā)酵效果的前提；含水量是發(fā)酵過程中的重要參數(shù)，含水量的高低直接影響發(fā)酵的品質(zhì)，王鵬等（2006）研究含水量對(duì)狗尾草發(fā)酵品質(zhì)影響的結(jié)果表明，在適宜的含水量條件下，各處理組的發(fā)酵品質(zhì)均為優(yōu)或良，因此，適宜的含水量是保證發(fā)酵效果的必要條件。發(fā)酵時(shí)間是發(fā)酵工藝中不可缺少的因素，由微生物生長(zhǎng)曲線可知，其最佳生長(zhǎng)時(shí)期是對(duì)數(shù)期和穩(wěn)定期，因此，適宜的發(fā)酵時(shí)間是發(fā)酵效果的重要保障。

3.3響應(yīng)面優(yōu)化發(fā)酵工藝響應(yīng)面法本質(zhì)上是一種統(tǒng)計(jì)方法，由于單因素中選擇了四個(gè)對(duì)發(fā)酵效果有影響的因素進(jìn)行試驗(yàn)，所以需要先做一個(gè)篩選試驗(yàn)，去掉對(duì)發(fā)酵效果影響不大的因素，本試驗(yàn)中發(fā)酵溫度對(duì)發(fā)酵效果影響最小，因此剔除發(fā)酵溫度因素。之后要確定當(dāng)前發(fā)酵條件水平是否接近響應(yīng)面的最優(yōu)位置，當(dāng)遠(yuǎn)離時(shí)，采用響應(yīng)面一階逼近；接近時(shí)，獲得對(duì)響應(yīng)面在最優(yōu)值附近某個(gè)小范圍內(nèi)的一個(gè)精確逼近并識(shí)別出最優(yōu)發(fā)酵條件，最后采用二階設(shè)計(jì)，即Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)確定最優(yōu)點(diǎn)，從而確定最優(yōu)發(fā)酵條件。本試驗(yàn)選取含水量、發(fā)酵時(shí)間和接菌量三個(gè)因素建立響應(yīng)面模型，通過模型回歸分析和可信度分析確定本試驗(yàn)所得模型合理，能夠?qū)ψ罴寻l(fā)酵條件進(jìn)行預(yù)測(cè)，并求數(shù)學(xué)模型的一階偏導(dǎo)得到優(yōu)化的發(fā)酵條件:含水量為51.5%，發(fā)酵時(shí)間為2.7 d，接菌量為3.6%。在此條件下，模型預(yù)測(cè)發(fā)酵復(fù)方中草藥多糖含量最大值為19.78%，通過試驗(yàn)驗(yàn)證測(cè)得實(shí)際值為19.59%，兩個(gè)結(jié)果相差不大，進(jìn)一步說明本試驗(yàn)?zāi)Ｐ陀行?。武洪志等?016）在黑曲霉發(fā)酵茯苓工藝優(yōu)化的研究中，用單因素加響應(yīng)面的試驗(yàn)設(shè)計(jì)，對(duì)發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化，最終測(cè)得茯苓多糖含量和模型預(yù)測(cè)值相差不大，與本試驗(yàn)結(jié)果一致。

4　結(jié)論

利用單因素試驗(yàn)和三因素三水平響應(yīng)面試驗(yàn)，確定枯草芽孢桿菌發(fā)酵復(fù)方中草藥（蒼術(shù)、白術(shù)、黃柏、板藍(lán)根、甘草和山楂）的最佳發(fā)酵工藝為含水量51.5%，發(fā)酵時(shí)間2.7 d，接菌量3.6%。此工藝下測(cè)得復(fù)方中草藥多糖含量為19.59%，與響應(yīng)面預(yù)測(cè)值19.78%接近，相較于未發(fā)酵復(fù)方中草藥多糖含量12.70%提高了55.75%。

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[7]朱秀清，王玲．微生物發(fā)酵高溫豆粕菌種篩選及發(fā)酵工藝優(yōu)化[J]．食品與發(fā)酵工業(yè)，2012，38（4）∶82～88．

[8]Bandaru V V R，Som lanka S R，Menduc D R，et al．Optim ization of fermentation conditions for the production of ethanol from sago starch by co-immobilized amyloglucosidase and cells of Zymomonasmobilis using response surface methodology[J]．Enzyme and M icrobial Technology，2006，38∶209～214．■

DOI∶10.15906/j.cnki.cn11-2975/s.20162007

The aim of this experiment was to study the optimum process of compound Chinese herbal medicine fermented by Bacillus subtilis.The compound Chinese herbal medicine process fermented by Bacillus subtilis was optimized through test method combining single factor and response surface.Using Bacillus subtilis fermented compound Chinese herbal medicine，and selected key factors which had greater impact on ferment from inoculation quantity，water content，fermentation time and fermentation temperature and for further optimization by response surface，with compound Chinese herbal medicine polysaccharide content as detection index.The results showed that water content，inoculation and fermentation time were the key factors in the four single factors，after further optimized by response surface the water content was 51.50%，inoculum was 3.60%，fermentation time was 2.7 days，and in this optimized condition the average value compound Chinese herbal medicine polysaccharide content was 19.59%，closed to predicted value 19.78%，and increased by 55.75%，compared with the compound Chinese herbal medicine polysaccharide content 12.70%in unfermented compound Chinese herbal medicine.

feed additive；compound Chinese herbal medicine；fermentation；process optimization

S816.3

A

1004-3314（2016）20-0026-06

國(guó)家科技支撐計(jì)劃（2014BAD13B03-1）