陳 群，魏炳棟，李 林，于 維，邱玉朗

(吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料研究所，吉林 公主嶺 136100)

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谷胱甘肽對(duì)實(shí)驗(yàn)性離體雞小腸上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激的干預(yù)研究

陳 群，魏炳棟，李 林，于 維，邱玉朗*

(吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料研究所，吉林 公主嶺 136100)

試驗(yàn)旨在研究氧化應(yīng)激對(duì)動(dòng)物腸道上皮細(xì)胞氧化損傷，以及抗氧化劑對(duì)上皮細(xì)胞的氧化干預(yù)。將培養(yǎng)的雞上皮細(xì)胞分為4組，每組設(shè)6個(gè)重復(fù)。對(duì)照組A加入等量的三蒸水，試驗(yàn)組B、C、D分別加入黃嘌呤氧化酶(50 U/L)和黃嘌呤(12 μmol/L)，并在C、D組分別加入谷胱甘肽(1，1.5 μmol/mL)。結(jié)果表明：添加黃嘌呤/黃嘌呤氧化酶(X/X0)導(dǎo)致小腸上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激，與對(duì)照組比較,顯著降低了小腸上皮細(xì)胞(IEC)增殖和抗氧化酶的活性,顯著提高細(xì)胞的脂質(zhì)氧化和凋亡率(P<0.05)。添加不同劑量的谷胱甘肽(GSH)均對(duì)IEC的氧化損傷產(chǎn)生保護(hù)作用，與B組比較，顯著提高了IEC增殖，降低了細(xì)胞的脂質(zhì)氧化和凋亡率；隨著GSH添加劑量的增加提高了IEC增殖，但C、D組間比較，抗氧化酶活性差異未達(dá)顯著水平(P>0.05)。

氧化應(yīng)激；抗氧化；小腸上皮細(xì)胞；谷胱甘肽

消化道是動(dòng)物體內(nèi)代謝最為旺盛的系統(tǒng)之一。動(dòng)物在正常生理情況下，依靠體內(nèi)抗氧化體系，體內(nèi)的自由基產(chǎn)生和清除處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，保持機(jī)體氧化還原狀態(tài)平衡。當(dāng)動(dòng)物細(xì)胞處于內(nèi)外因素刺激下，機(jī)體內(nèi)產(chǎn)生自由基增多，破壞了機(jī)體氧化與抗氧化系統(tǒng)的平衡，導(dǎo)致氧化應(yīng)激的發(fā)生[1]。幼齡動(dòng)物代謝旺盛，自身氧化還原平衡調(diào)節(jié)能力較低，更易發(fā)生氧化應(yīng)激。氧化應(yīng)激的發(fā)生導(dǎo)致幼畜消化道發(fā)育遲緩和功能下降。具體表現(xiàn)為腸道發(fā)育遲緩、功能低下、消化道疾病頻發(fā)，尤其是腹瀉發(fā)生率較高，加劇了腸道粘膜組織的損傷程度，甚至導(dǎo)致死亡。谷胱甘肽(GSH)是一種由3個(gè)氨基酸組成的小肽，是動(dòng)物體內(nèi)重要的抗氧化劑和自由基清除劑。研究自由基對(duì)幼齡動(dòng)物消化道影響機(jī)理及干預(yù)技術(shù)，成為當(dāng)今熱門研究課題。因此,本試驗(yàn)建立黃嘌呤/黃嘌呤氧化酶(X/X0)誘導(dǎo)的雞小腸上皮細(xì)胞體外氧化應(yīng)激模型，研究過(guò)量自由基對(duì)雛雞小腸上皮細(xì)胞內(nèi)抗氧化能力及細(xì)胞增殖的影響，并研究GSH對(duì)雛雞小腸上皮細(xì)胞氧化損傷的干預(yù)作用。

1 材料與方法

1.1 材料

選未補(bǔ)飼雛雞3只，消毒后迅速處死，剖腹取出小腸，備用于上皮細(xì)胞分離。在超凈臺(tái)中將剛孵化出的雛雞無(wú)菌活體采樣，置于磷酸鹽緩沖液中，清洗小腸組織數(shù)次，至上清液清亮。去除腸系膜，用HBSS液清洗，剪成<1 mm3的組織塊，進(jìn)行上皮細(xì)胞分離[2]。用DMEM培養(yǎng)液調(diào)細(xì)胞數(shù)50 000 K/mL，放置于37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

上皮細(xì)胞培養(yǎng)72 h，鏡檢上皮細(xì)胞增殖狀況，篩選貼壁良好的細(xì)胞。試驗(yàn)分為4組，包括對(duì)照組和3個(gè)試驗(yàn)組，每組設(shè)6個(gè)重復(fù)，對(duì)照組A添加等量的三蒸水，B組加入黃嘌呤(12 μmol/L)和黃嘌呤氧化酶(50 U/L)，C、D組加入黃嘌呤(12 μmol/L)和黃嘌呤氧化酶(50 U/L)，然后再分別加入谷胱甘肽(1，1.5 μmol/mL)。

1.3 上皮細(xì)胞增值測(cè)定

在上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激2和36 h后，重新更換DMEM培養(yǎng)液。采用噻唑藍(lán)比色法測(cè)定上皮細(xì)胞增殖，在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上492 nm處測(cè)光吸收度。

1.4 丙二醛(MDA)含量測(cè)定

在應(yīng)激后2和36 h分別測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)液和上皮細(xì)胞中的MDA濃度，在4 ℃，2 000 g離心5 min，取上清液，進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)液中MDA含量測(cè)定。用三蒸水稀釋細(xì)胞至濃度為5×106cfu/mL，采用超聲波對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行破碎，2 500 g離心10 min，收集裂解后的上清液。進(jìn)行MDA含量測(cè)定，試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程公司。

1.5 抗氧化酶活性測(cè)定

上皮細(xì)胞培養(yǎng)36 h后，去除培養(yǎng)液，采用磷酸鹽緩沖液(pH值7.4)反復(fù)漂洗上皮細(xì)胞3次，采用反復(fù)凍融法裂解上皮細(xì)胞，采用試劑盒進(jìn)行過(guò)氧化氫酶(CAT)和超氧化物歧化酶(SOD)活性測(cè)定，試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程公司。

1.6 細(xì)胞凋亡率測(cè)定

利用0.25%的胰酶消化貼壁培養(yǎng)的細(xì)胞。200 g離心10 min收集細(xì)胞，棄去上清，磷酸鹽緩沖液漂洗1次，將細(xì)胞重懸于預(yù)冷的70%乙醇，在4 ℃條件下固定1 h。PBS洗滌1次，200 g離心10 min，進(jìn)行細(xì)胞的收集，并在4 ℃避光染色30 min。將經(jīng)PI染色細(xì)胞懸液用300目的尼龍膜過(guò)濾后，利用流式細(xì)胞儀進(jìn)行凋亡細(xì)胞定量測(cè)定。

1.7 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析，進(jìn)行Duncan氏分析比較其差異顯著性，以P<0.05作為檢驗(yàn)數(shù)據(jù)差異顯著水平，統(tǒng)計(jì)的結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 谷胱甘肽對(duì)氧化應(yīng)激上皮細(xì)胞增殖的影響

谷胱甘肽對(duì)氧化應(yīng)激上皮細(xì)胞增殖的影響見(jiàn)圖1。

圖1 谷胱甘肽對(duì)氧化應(yīng)激上皮細(xì)胞增殖的影響

添加X(jué)/XO明顯降低了上皮細(xì)胞的增殖，單獨(dú)添加X(jué)/XO的B組細(xì)胞增殖數(shù)量顯著低于其他各組(P<0.05)。與B組比較，添加GSH顯著提高了細(xì)胞增殖數(shù)量，且隨GSH添加劑量的增加而增長(zhǎng)，但C、D 2組間差異未達(dá)顯著水平(P>0.05)。

2.2 谷胱甘肽對(duì)氧化應(yīng)激上皮細(xì)胞抗氧化能力的影響

由表1可知，過(guò)量的自由基降低了抗氧化酶活性，在36 h，B組細(xì)胞內(nèi)SOD和CAT的酶活顯著下降，與對(duì)照組比較差異顯著(P<0.05)。與XO單獨(dú)處理組比較，添加GSH提高了SOD和CAT酶的活性(P>0.05)，抗氧化酶活性隨GSH 的劑量增加呈遞增趨勢(shì)。添加不同劑量的GSH 2組之間抗氧化酶活性差異未達(dá)顯著水平(P>0.05)。

表1 谷胱甘肽對(duì)氧化應(yīng)激上皮細(xì)胞抗氧化能力的影響

2.3 谷胱甘肽對(duì)氧化應(yīng)激上皮細(xì)胞MDA含量的影響

由表2可知，在應(yīng)激2和36 h 2個(gè)時(shí)相點(diǎn)，與對(duì)照組比較，添加X(jué)O應(yīng)激組顯著提高了小腸上皮細(xì)胞和培養(yǎng)液中MDA的產(chǎn)量(P<0.05)。添加GSH降低了MDA產(chǎn)量，與應(yīng)激組比較，在2 h時(shí)相點(diǎn)，顯著降低了培養(yǎng)液中MDA的產(chǎn)量(P<0.05)，在36 h時(shí)相點(diǎn)，顯著降低了小腸上皮細(xì)胞和培養(yǎng)液中MDA的產(chǎn)量(P<0.05)。在36 h時(shí)相點(diǎn)與對(duì)照組比較，添加1.5 μmol/mL GSH的小腸上皮細(xì)胞中MDA的含量無(wú)顯著差異(P>0.05)。添加不同劑量的GSH試驗(yàn)組之間，在2 h時(shí)相點(diǎn)，培養(yǎng)液中MDA的含量差異不顯著。

表2 谷胱甘肽對(duì)氧化應(yīng)激上皮細(xì)胞中MDA含量的影響

2.4 谷胱甘肽對(duì)氧化應(yīng)激上皮細(xì)胞凋亡率的影響

谷胱甘肽對(duì)氧化應(yīng)激上皮細(xì)胞凋亡率的影響見(jiàn)圖2。

由圖2可知，應(yīng)激處理后36 h，X/XO處理的細(xì)胞凋亡率顯著高于其他各組，與X/XO單獨(dú)處理組比較，添加GSH均顯著降低了細(xì)胞的凋亡率(P<0.05)；添加不同水平的GSH抑制了培養(yǎng)細(xì)胞的凋亡，而且隨著GSH添加劑量的增加而抑制效果明顯，添加不同劑量的GSH兩個(gè)處理組間也差異達(dá)顯著水平(P<0.05)。

圖2 谷胱甘肽對(duì)氧化應(yīng)激上皮細(xì)胞凋亡率的影響

3 討論

3.1 對(duì)小腸上皮細(xì)胞增殖的影響

本試驗(yàn)建立的氧化應(yīng)激模型模擬了腸道產(chǎn)生自由基來(lái)源，避免了動(dòng)物體內(nèi)試驗(yàn)條件下多種因素的影響。在XO作用下IECs增殖明顯低于對(duì)照組，證明氧化應(yīng)激抑制了IECs的增殖和細(xì)胞代謝的活動(dòng)性。Nilsson等(1994)發(fā)現(xiàn)，再灌注導(dǎo)致自由基顯著提高，同時(shí)GSH含量降低少，而次黃嘌呤減少，尿酸增加[3]。

GSH是細(xì)胞內(nèi)巰基含量最高的低分子多肽，對(duì)機(jī)體維持氧化還原狀態(tài)發(fā)揮重要作用[4,5]。其通過(guò)清除自由基來(lái)增強(qiáng)機(jī)體免疫能力，增強(qiáng)機(jī)體防御多種疾病，減少H2O2等毒素的氧化損傷[6,7]。目前許多研究證實(shí)正常小腸細(xì)胞的增殖、分化與細(xì)胞內(nèi)還原型谷胱甘肽與氧化型谷胱甘肽和細(xì)胞外半胱氨酸/胱氨酸氧化還原系統(tǒng)的氧化還原電位密切相關(guān)[8]。還原型谷胱甘肽是體細(xì)胞內(nèi)的主要代謝調(diào)節(jié)物質(zhì)，對(duì)細(xì)胞有多種生化作用，能清除體內(nèi)多種氧自由基，具有保護(hù)細(xì)胞膜的完整性和解毒等作用。本試驗(yàn)中GSH顯著提高了離體小腸上皮細(xì)胞的增殖，可能是固有層細(xì)胞外環(huán)境還原降低，促進(jìn)固有層T淋巴細(xì)胞活化，提高細(xì)胞增殖，而細(xì)胞內(nèi)GSH的減少是固有層T淋巴細(xì)胞增殖減少的重要因素。

3.2 對(duì)上皮細(xì)胞中SOD和CAT活性的影響

維持細(xì)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)平衡及自由基適度水平對(duì)維持細(xì)胞功能有著重要作用，當(dāng)自由基數(shù)量超出生物體自身抗氧化能力時(shí)導(dǎo)致氧化應(yīng)激。張蓉等(2009)證實(shí)，高脂日糧造成小鼠機(jī)體活性氧水平升高，抗氧化能力顯著下降，同時(shí)腸道菌群失衡，大腸桿菌增多，乳桿菌減少[9]。本試驗(yàn)中，XO處理組顯著降低了細(xì)胞內(nèi)SOD和CAT的酶活，過(guò)量自由基的產(chǎn)生降低了抗氧化酶的活性。氧化應(yīng)激導(dǎo)致機(jī)體自由基產(chǎn)生量增加,而機(jī)體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)的活性也提高,隨著應(yīng)激時(shí)間的延長(zhǎng),氧化應(yīng)激仍然造成細(xì)胞破壞,組織損傷[10,11]。冷應(yīng)激使小鼠腦組織SOD活性下降[12]。機(jī)體的氧化還原系統(tǒng)保持著動(dòng)態(tài)平衡，SOD和GSH-Px等通過(guò)清除自由基對(duì)維持機(jī)體平衡發(fā)揮著重要作用，保護(hù)機(jī)體組織細(xì)胞免受損傷[13]。在應(yīng)激條件下，抗氧化物活性的提高可能是由于機(jī)體的自身保護(hù)代償機(jī)制，使清除超氧陰離子的能力增強(qiáng)。本試驗(yàn)中，GSH抑制了XO導(dǎo)致的抗氧化酶活性的降低，表明GSH提高了離體細(xì)胞抗氧化能力。添加GSH增加了SOD和CAT酶的活性，主要是通過(guò)GSH清除H2O2，降低H2O2鈍化抗氧化酶的能力，由谷胱甘肽/氧化谷胱甘肽(GSH/GSSG)組成腸腔的氧化還原狀態(tài)，更好的維持腸黏膜完整性。

3.3 對(duì)上皮細(xì)胞培養(yǎng)液和細(xì)胞內(nèi)容物中MDA含量的影響

MDA是動(dòng)物體內(nèi)主要的脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物，測(cè)定MDA的濃度可反映體內(nèi)的氧化還原狀態(tài)，其濃度提高被認(rèn)為是自由基通過(guò)脂質(zhì)過(guò)氧化誘發(fā)的，氧自由基引起細(xì)胞膜內(nèi)的脂質(zhì)和血漿脂質(zhì)氧化，因此可間接表明體細(xì)胞受損傷的程度，并作為毒理學(xué)的評(píng)價(jià)指標(biāo)[14-16]，本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在2 h和36 h，X/XO處理均顯著提高了細(xì)胞內(nèi)游離的MDA含量，而且隨著培養(yǎng)時(shí)間增加，培養(yǎng)細(xì)胞脂質(zhì)氧化程度越高。因此，證實(shí)細(xì)胞膜和細(xì)胞內(nèi)膜均受到了自由基的攻擊。慢性應(yīng)激誘發(fā)大鼠腦組織中脂質(zhì)過(guò)氧化加劇，腦組織中MDA濃度顯著提高氧自由基生成增加[17]。氧化應(yīng)激引起小鼠小腸旁細(xì)胞滲透性提高，活性氧起著重要作用[18]。與單獨(dú)應(yīng)激處理組比較，添加GSH后的2個(gè)時(shí)相點(diǎn)細(xì)胞內(nèi)MDA均明顯下降，主要原因是GSH能夠把H2O2還原為H2O，自身被氧化為GSSG。GSH通過(guò)減少H2O2數(shù)量，減輕了自由基對(duì)細(xì)胞的氧化損傷。

3.4 對(duì)上皮細(xì)胞凋亡率的影響

在正常生理?xiàng)l件下，細(xì)胞活性取決于線粒體內(nèi)氧化還原狀態(tài)的平衡。代謝過(guò)程使細(xì)胞始終處于自由基的氧化攻擊狀態(tài)，大量研究發(fā)現(xiàn)，許多誘發(fā)細(xì)胞程序死亡的試劑是氧化劑,其可能是細(xì)胞程序死亡的主要介質(zhì)。通過(guò)提高氧化劑可以使凋亡的誘導(dǎo)因子活化，增強(qiáng)誘導(dǎo)凋亡的活性[19]。細(xì)胞內(nèi)抗氧化物和自由基失衡，就會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡和器官損傷。氧化應(yīng)激導(dǎo)致大量自由基耗盡抗氧化物導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。朱麗慧(2014)發(fā)現(xiàn)，斷奶仔豬腸細(xì)胞凋亡的增加與仔豬抗氧化能力的降低和自由基產(chǎn)生增加顯著相關(guān)[20]。通過(guò)細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)途徑氧自由基可以對(duì)細(xì)胞的增殖、凋亡產(chǎn)生影響，其通過(guò)影響?zhàn)つぜ?xì)胞的基因表達(dá)，調(diào)節(jié)腸道的功能。氧化應(yīng)激產(chǎn)物MDA可促進(jìn)刺激Ca2+從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體釋放。Ca2+濃度的增加可激活導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的多個(gè)各個(gè)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑[21]。楊瑞麗等(2008)證實(shí)，高脂日糧可使小鼠肝臟基因表達(dá)195個(gè)顯著下調(diào)，135個(gè)顯著上調(diào)[22]。氧化應(yīng)激誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的原因，可能是導(dǎo)致細(xì)胞膜上的各種不飽和脂肪酸及膽固醇脂質(zhì)過(guò)氧化有關(guān)。誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的因子種類很多，有些能夠誘發(fā)自由基形成，間接地使部分敏感細(xì)胞氧化損傷。自由基引起的氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的DNA損傷超過(guò)了動(dòng)物機(jī)體細(xì)胞自我修復(fù)的能力，將會(huì)對(duì)動(dòng)物機(jī)體造成各種損傷，甚至凋亡[23]。

細(xì)胞內(nèi)GSH貯存與氧化應(yīng)激造成的前期細(xì)胞凋亡相關(guān)[24]。該試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，添加GSH顯著降低了上皮細(xì)胞的凋亡率，可能與GSH一定程度上緩減氧化應(yīng)激、提高細(xì)胞抗氧化能力、保護(hù)腸細(xì)胞結(jié)構(gòu)的完整性有關(guān)。

4 結(jié)論

X/XO系統(tǒng)導(dǎo)致離體雛雞IEC的增殖明顯降低，細(xì)胞膜氧化脂質(zhì)化和細(xì)胞凋亡率明顯提高。外源性GSH能夠有效抑制誘發(fā)性氧化應(yīng)激對(duì)IEC造成的氧化損傷，抑制能力隨著GSH添加劑量的增加而提高。

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Intervention effect of glutathione against oxidative injury in intestinal epithelial cells of chicken in vitro

CHEN Qun, WEI Bingdong, LI Lin, YU Wei, QIU Yulang*

(InstituteofAnimalNutritionandFeed,JilinAcademyofAgriculturalSciences,GongzhulingJilin136100,China)

To study the injury effect of oxidative stress on intestinal epithelial cells (IECs) of chicken and antioxidative action of glutathione(GSH)in vitro. IECs were randomly assigned to four groups with six replicates per group, B, C, D groups were added xanthine (12 μmol/L) and xanthine oxidase (50 U/L), C, D groups were adde-d GSH (1, 1.5 μmol/mL), respectively. The results showed that X/XO supplementation significantly inhibited the proliferation of IECs and the activities of catalase (CAT) and super oxide dismutase (SOD), increased the lipid peroxidation and the apoptosis of IECs compared with the control group (P<0.05). Presence of GSH could protect from oxidative injury of IECs in vitro, remarkably enhanced the proliferation of IECs, and decreased the lipid peroxidation and the apoptosis of IECs in a dose-dependent manner compared with X/XO alone-group (P<0.05). However, there were no significant differences in proliferation and activity of antioxidant enzyme between groups C and D (P>0.05).

oxidative stress; antioxidation; intestinal epithelial cells; glutathione

2016-07-25 基金項(xiàng)目：吉林省科技廳自然基金重點(diǎn)項(xiàng)目(20140101024JC)

陳群(1968—)，男，山東莒縣人，研究員，博士，研究方向?yàn)閯?dòng)物營(yíng)養(yǎng)調(diào)控與生物飼料研究。邱玉朗為通信作者，

E-mail: qiuyulang2002@163.com

1004-7999(2016)03-0251-05

10.13478/j.cnki.jasyu.2016.03.013

R96

A