畢曉黎 陳 雪 胥愛麗 陳 儀

(1 廣東省中醫(yī)藥工程技術(shù)研究院中醫(yī)藥研究開發(fā)重點實驗室，廣州，510095； 2 廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣州，510405；3 中山大學(xué)新華學(xué)院，廣州，510520)

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中風(fēng)寧合劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

畢曉黎1,2陳 雪2胥愛麗1陳 儀3

(1 廣東省中醫(yī)藥工程技術(shù)研究院中醫(yī)藥研究開發(fā)重點實驗室，廣州，510095； 2 廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣州，510405；3 中山大學(xué)新華學(xué)院，廣州，510520)

目的：建立中風(fēng)寧合劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。方法：采用薄層色譜(Thin-layer Chromatography，TLC)法對方中3味藥進(jìn)行定性鑒別；采用高效液相(High Performance Liquid Chromatography，HPLC)色譜法對方中赤芍所含芍藥苷的含量進(jìn)行測定，以Agilent ZORBAX SB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)為色譜柱，甲醇-0.05 mol/L的磷酸二氫鉀溶液(28∶72)為流動相，檢測波長230 nm。結(jié)果：在TLC中能檢出赤芍、石菖蒲、何首烏的特征斑點，且陰性對照無干擾。芍藥苷在0.185 2～0.926 0 μg范圍內(nèi)與色譜峰峰面積線性關(guān)系較好，相關(guān)系數(shù)r為0.999 9，加樣回收率的平均值為98.55%，RSD%為1.16(n=9)。結(jié)論：所建立的方法簡便準(zhǔn)確，快速，專屬性高，重現(xiàn)性好，結(jié)果可靠，可用于中風(fēng)寧合劑的質(zhì)量控制。

中風(fēng)寧合劑；TLC；芍藥苷；HPLC；質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

中風(fēng)寧合劑是廣東省第二中醫(yī)院名老中醫(yī)的經(jīng)驗方，經(jīng)過一定的工藝制成合劑，具有活血散瘀，化痰通竅的功效，本方由赤芍、石菖蒲、制何首烏、當(dāng)歸等7味中藥材組成，可用于治療“反射性交感神經(jīng)營養(yǎng)不良綜合征”[1]以及中風(fēng)引起的口眼歪斜，小便失禁，吞咽食物困難等后遺癥[2]，為了控制其內(nèi)在質(zhì)量，使臨床用藥更安全，有效，本項目對本品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)展開了研究。

本處方中以涼血散瘀[3]的赤芍為君藥，以醒神開竅的石菖蒲和養(yǎng)血滋陰的制何首烏為臣藥，故本文采用TLC法對處方中的赤芍、石菖蒲、制何首烏進(jìn)行了定性鑒別，同時以主藥赤芍中的芍藥苷為檢測指標(biāo)，采用高效液相色譜法(Agilent 1200高效液相色譜儀)對處方中所含的芍藥苷進(jìn)行了含量測定，為中風(fēng)寧合劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供了實驗依據(jù)。

本實驗通過對中風(fēng)寧合劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行研究，為該中藥復(fù)方制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供有效、可靠的評價參考依據(jù)，為中藥合劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立提供有效的方法和參考。

1 材料

1.1 實驗儀器 高效液相色譜儀型號為Agilent 1200(美國Agilent公司)，DAD檢測器，四元梯度泵，Agilent ZORBAX SB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)色譜柱；ATS4型自動點樣儀(CAMAG瑞士)；Reprostar 3型號的數(shù)碼成像系統(tǒng)(瑞士CAMAG)；梅特勒XS205Du型分析天平(瑞士)；BQ-Ⅱ型薄層自動鋪板器(重慶南岸實驗電器廠)；DHG-9203A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海精宏實驗設(shè)備有限公司)；MilliPore Advantage A10自動純水機(jī)(美國)；KQ52300DE型數(shù)控超聲波輔助提取儀(昆山市超聲儀器有限公司)；SevenCompact pH計(上海梅特勒-托利多儀器有限公司)；電熱恒溫水浴槽(上海)。

1.2 受試藥物 赤芍對照藥材(批號：121093-200402)、石菖蒲對照藥材(批號：121098-201105)、制何首烏對照藥材(批號：121454-200502)；芍藥苷對照品(批號：110736-201035),從中國食品藥品檢定研究院購買；中風(fēng)寧合劑(批號分別為2015080101、2015080102、2015080103)，為廣東省第二中醫(yī)院制劑室中式產(chǎn)品；甲醇為色譜純(默克)、水為屈臣氏蒸餾水，其他的試劑為分析純(廣州化學(xué)試劑廠)。

2 試驗方法

2.1 薄層色譜(TLC)的定性鑒別

2.1.1 赤芍薄層鑒別 取批號為2015080101、2015080102、2015080103的3批中風(fēng)寧合劑各5 mL，通過D101大孔樹脂柱，先用自來水洗脫，把大孔樹脂柱洗至無色，洗脫液丟棄，再用20%的乙醇洗脫，用量為30 mL，丟棄洗脫液，然后用70 mL 20%乙醇洗脫[4～5]，將洗脫液收集，于蒸發(fā)皿中置水浴鍋上蒸干，用1 mL甲醇溶解，即得供試品溶液。另取0.5 g的赤芍對照藥材，置于100 mL的廣口瓶中，加50 mL飲用水，煎煮時間為30 min，放冷，過濾至蒸發(fā)皿中，濃縮濾液為5 mL，對照藥材的溶液依據(jù)此方法制得。取缺赤芍藥材的陰性樣品，同上述方法制得赤芍陰性對照溶液。照薄層色譜法《中華人民共和國藥典》(以下簡稱《中國藥典》)2015年版四部通則0502試驗，吸取15 μL的陰性對照溶液，3 μL的對照藥材溶液，15 μL的上述3批供試品溶液,分別點于同一自制的硅膠G薄層板上，甲醇-乙酸乙酯-三氯甲烷-甲酸(10∶5∶40∶0.2)為展開劑，顯色劑為5%香草醛硫酸溶液，顯色之后，晾干，取出，將薄層板放于105 ℃烘箱至斑點顯色清晰，放于白光下檢視[6-7]，在TLC薄層板上，供試品色譜與赤芍對照藥材色譜有對應(yīng)的斑點。且赤芍陰性對照無干擾，如圖1。

2.1.2 石菖蒲薄層鑒別[6]取批號為2015080101、2015080102、2015080103的3批中風(fēng)寧合劑各10 mL，用稀鹽酸調(diào)pH值至2～3，將此溶液用20 mL乙醚液萃取兩次，合并，蒸干，殘渣用1 mL的甲醇溶解，即得供試品溶液。另取0.20 g的石菖蒲對照藥材，置于250 mL的廣口錐形瓶中加飲用水100 mL，煎煮時間為30 min，放冷，過濾，得濾液，濾液用稀鹽酸調(diào)節(jié)pH值至2～3，用上述方法制得對照藥材溶液[6]。取缺石菖蒲藥材的陰性樣品，同上述方法制得石菖蒲陰性對照溶液。照薄層色譜法《中國藥典》四部通則0502試驗，吸取3 μL的陰性對照溶液，5 μL的對照藥材溶液，3 μL的供試品溶液，把樣品點于同一自制的硅膠G薄層板上。展開劑為乙酸乙酯-二氯甲烷-環(huán)己烷-甲酸(1∶1∶4∶0.1)，置室溫下晾干。將薄層板在365 nm的紫外光燈下檢視，在TLC薄層板上，供試品色譜與石菖蒲對照藥材色譜有對應(yīng)的斑點。且石菖蒲陰性對照無干擾,如圖2。

圖1 赤芍TLC色譜圖

注：1赤芍陰性;2赤芍對照藥材;3赤芍供試品2015080101;4赤芍供試品2015080102;5赤芍供試品2015080103。

圖2 石菖蒲TLC色譜圖

注：1石菖蒲陰性;2石菖蒲對照藥材;3 石菖蒲供試品2015080101;4石菖蒲供試品2015080102;5石菖蒲供試品2015080103。

2.1.3 制何首烏薄層鑒別[6]取批號為2015080101、2015080102、2015080103的3批中風(fēng)寧合劑各10 mL，用稀鹽酸調(diào)pH值至2～3，將此溶液用20 mL乙醚液萃取兩次，合并，蒸干，溶解溶劑為1 mL的甲醇，即得供試品溶液。另取0.25 g的制何首烏對照藥材于250 mL的廣口錐形瓶中，加飲用水100 mL，煎煮30 min，過濾，濾液用稀鹽酸調(diào)節(jié)pH值至2～3，同法處理作為對照藥材溶液。取缺制何首烏藥材的陰性對照藥材，用相同的方法制備供試品溶液制成制何首烏陰性樣品。照薄層色譜法(《中國藥典》四部通則0502)試驗，吸取5 μL的陰性對照溶液,1 μL的對照藥材溶液，5 μL的供試品溶液，把樣品點于同一自制的硅膠G薄層板上，展開劑為乙酸乙酯-二氯甲烷-環(huán)己烷-甲酸(1∶1∶4∶0.1)，置室溫下晾干。將薄層板在365 nm的紫外燈光下檢視，在TLC薄層板上，供試品色譜與制何首烏對照藥材色譜有對應(yīng)的斑點。且制何首烏陰性對照無干擾，如圖3。

圖3 制何首烏TLC色譜圖

注：1制何首烏陰性;2制何首烏對照藥材;3制何首烏供試品2015080101;4制何首烏供試品2015080102;5制何首烏供試品2015080103。

2.2 芍藥苷的含量測定

2.2.1 色譜條件[6]色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相：甲醇-0.05 mol/L的磷酸二氫鉀溶液(28∶72)；流速：0.800 mL/min；柱溫：25 ℃；測波長：230 nm；進(jìn)樣量：10 μL；按芍藥苷峰計算理論塔板數(shù)應(yīng)不低于3 000。

2.2.2 對照品溶液的制備[6]稱得芍藥苷4.63 mg精密稱定，取出五氧化二磷減壓干燥器中干燥36 h的芍藥苷對照品，溶解溶劑為甲醇，制成芍藥苷的濃度為0.463 mg/mL，作為芍藥苷的對照品溶液，備用。

2.2.3 供試品溶液的制備[6]精密吸取中風(fēng)寧合劑1 mL，99 ℃水浴鍋上蒸至九成干，加硅藻土適量，與樣品充分拌勻，移至錐形瓶中，精密加入10.00 mL甲醇，稱重，浸泡4 h，超聲波輔助提取20 min，放冷，補(bǔ)足失重，搖勻，過濾，取續(xù)濾液，通過0.45 μm微孔濾膜進(jìn)行過濾，制得供試品溶液，備用。

2.2.4 陰性對照溶液制備[6]按照處方比例，取缺赤芍的處方藥材，按照中風(fēng)寧合劑的制備方法制成赤芍陰性樣品，99 ℃水浴鍋上蒸至九成干，同供試品處理方法制成赤芍陰性對照溶液，備用。

2.2.5 專屬性考察[8-14]取中風(fēng)寧合劑(批號：2015080101)，依據(jù)“2.2.1”項下的色譜條件對赤芍的陰性對照溶液和芍藥苷對照品溶液進(jìn)行測定，HPLC色譜峰顯示，在芍藥苷色譜峰的位置上，陰性對照溶液沒有吸收，該圖譜表明，該方法的專屬性較強(qiáng)，如圖4。

圖4 HPLC色譜圖

2.6 線性考察[8-14]芍藥苷對照品溶液(0.463 mg/mL)0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL用移液槍精密吸取，并分別置于5 mL的容量瓶中，用色譜純甲醇定容，振勻，制成濃度分別為18.52 μg/mL，37.04 μg/mL，55.56 μg/mL，74.08 μg/mL，92.60 μg/mL的芍藥苷對照品溶液，進(jìn)樣體積均為10 μL，按“2.2.1”項下色譜條件對峰面積進(jìn)行測定。以芍藥苷峰面積積分值(Y)為縱坐標(biāo)，以進(jìn)樣量(X/μg)為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，可得線性回歸方程：Y=2587.6X-130.38(相關(guān)系數(shù)r為0.999 9)。結(jié)果表明芍藥苷具有良好的線性關(guān)系在0.185 2～0.926 0 μg范圍內(nèi)。

2.7 精密度試驗[8-14]取中風(fēng)寧合劑1.00 mL(批號：2015080101)，按“2.2.3”項下的供試品制備方法制得供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次。測得其峰面積，經(jīng)計算得芍藥苷峰面積RSD%值為0.35%(n=6)，結(jié)果表明此高效液相色譜儀的精密度良好。

2.8 穩(wěn)定性試驗[8-14]用移液槍分別吸取供試品溶液1.00 mL(批號：2015080101)，分別于0、2、6、8、12、24 h時進(jìn)樣，按“2.2.1”項下確立的色譜條件進(jìn)行測定。測得其峰面積，經(jīng)計算得芍藥苷峰面積RSD%值為0.69%(n=6),結(jié)果表明該中風(fēng)寧合劑在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.9 重復(fù)性試驗[8-14]取中風(fēng)寧合劑(批號：2015080101)，分別精密吸取6份，把供試品溶液按“2.2.3”項下的制備方法處理即得，照“2.2.1”項下確立的色譜條件進(jìn)行測定，即得其峰面積值，計算得芍藥苷含量。結(jié)果顯示芍藥苷的平均含量為0.60 mg/mL，含量的RSD%值為0.60%(n=6)，結(jié)果表明該方法的重復(fù)性良好。

2.10 加樣回收率試驗[8-14]用移液槍吸取9份已知芍藥苷含量(0.60 mg/mL)的供試品溶液(批號：2015080101)，將供試品溶液依據(jù)“2.2.3”項下制備方法處理，即得，按“2.2.1”項下確立的色譜條件進(jìn)行測定，計算得回收率。見表1。

表1 芍藥苷加樣回收率試驗結(jié)果

圖5 當(dāng)歸尾TLC色譜圖

注：1、2、3當(dāng)歸尾對照藥材8 μL、10 μL、12 μL;4、5、6供試品8 μL、10 μL、12 μL。

圖6 當(dāng)歸尾TLC色譜圖

注：1當(dāng)歸尾陰性;2當(dāng)歸尾藥材;3當(dāng)歸尾供試品2015080101;4當(dāng)歸尾供試品2015080102;5當(dāng)歸尾供試品2015080103。

2.11 供試品測定結(jié)果 取批號為2015080101、2015080102、2015080103的3批中風(fēng)寧合劑各一定量，按“2.2.3”項下的方法處理，即得供試品溶液，按“2.2.1”項下的色譜條件進(jìn)行測定，計算3批供試品中芍藥苷的含量。見表2。

表2 樣品中芍藥苷含量測定結(jié)果(n=3)

圖7 石菖蒲TLC色譜圖

注：1、2、3石菖蒲對照藥材1 μL、2 μL、5 μL;4、5、6供試品1 μL、2 μL、5 μL。

3 討論

實驗過程中曾嘗試對方中所有藥味的薄層鑒別方法進(jìn)行摸索，結(jié)果除赤芍、石菖蒲、制何首烏外，其余藥味均存在分離度不佳、背景干擾大或陰性干擾等問題，故未列入標(biāo)準(zhǔn)。在對當(dāng)歸尾進(jìn)行薄層鑒別時，運用《中國藥典》2015年版四部通則0502，供試品與對照藥材沒有對應(yīng)的斑點，如圖5，故嘗試鑒別項下鑒別(3)中的方法，陰性有干擾，故未列入標(biāo)準(zhǔn)，但在供試品TLC色譜圖中，如圖6有一明顯的黃色斑點，在365 nm檢視下，此點前后無干擾。因黃色斑點對應(yīng)的化合物必為方中某味藥材的成分，經(jīng)查閱資料,此點可能為制何首烏中的成分[15-16]，故將此方法運用到制何首烏的TLC中。

在石菖蒲的TLC鑒別中，按照《中國藥典》2010年版藥材鑒別項下鑒別(2)，365 nm下檢視，對照藥材對應(yīng)位置沒有斑點，供試品中斑點展開效果差，如圖(7)。遂嘗試用《中國藥典》2015年版一部當(dāng)歸項下的薄層鑒別方法，對照藥材與供試品有對應(yīng)的藍(lán)色斑點，且分離度良好，陰性無干擾。

本實驗所建立的TLC鑒別方法和HPLC含量測定方法專屬性強(qiáng)，陰性無干擾，且方法簡單準(zhǔn)確，故可用于中風(fēng)寧合劑的質(zhì)量分析與控制。

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(2015-11-25收稿 責(zé)任編輯：張文婷)

Research on Quality Standard for Zhong-feng-ning Mixture

Bi Xiaoli1,2,Chen Xue2,Xu Aili1,Chen Yi3

(1GuangdongProvincialKeyLaboratoryofTraditionalChineseMedicineResearchandDevelopment,GuangdongProvincialTCMScienceandTechnologyInstitute,Guangzhou510095,China; 2GuangzhouUniversityofChineseMedicine,Guangzhou510405,China; 3XinhuaCollegeofSunYat-senUniversity,Guangzhou510520,China)

Objective:To establish the quality standard of Zhong-feng-ning mixture.Methods:TLC was used for the qualitative identification of paeoniae radix rubar, acori tatarinowii rhizome and polygoni multiflori radix. The samples were separated on the Agilent ZORBAX SB C18column. The mobile phase was set as methanol-0.05% monopotassium phosphate(28∶72)and the detection wave length was set at 230 nm.Results:The TLC spots of paeoniae radix rubar, acori tatarinowii rhizoma, polygoni multiflori radix were clear and well-separated without interference of negative samples. The linear relationship of peaoniflorin was good in the range of 0.1852-0.9260 μg (r=0.999 9). The average recovery rate was 98.55%. (RSD=1.16).Conclusion:The method is simple, accurate and fast with great repeatability, high specificity and good repeatability, which can be used for the quality control of Zhong-feng-ning mixture.

Zhong-feng-ning mixture; TLC; Peaoniflorin; HPLC; Quality standard

廣東省科技計劃項目(編號：2013B040200040)

R284.1

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2016.10.053