李小燕 杜成芬 肖 敏 夏俊琳 趙 娟 何華瓊

(1 湖北省十堰市太和醫(yī)院急診科，十堰，442000； 2 湖北醫(yī)藥學(xué)院機(jī)能實(shí)驗(yàn)室，十堰，442000)

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丹參酮ⅡA磺酸鈉注射液對(duì)大鼠急性心肌缺血預(yù)處理VEGF的影響

李小燕1杜成芬1肖 敏1夏俊琳1趙 娟1何華瓊2

(1 湖北省十堰市太和醫(yī)院急診科，十堰，442000； 2 湖北醫(yī)藥學(xué)院機(jī)能實(shí)驗(yàn)室，十堰，442000)

目的：觀察丹參酮ⅡA磺酸鈉注射液對(duì)大鼠急性心肌缺血/再灌注損傷缺血預(yù)處理后血管內(nèi)皮生長因子(Vascular Endothelial Growth Factor，VEGF)表達(dá)的影響。方法：16只健康大鼠隨機(jī)分為缺血/再灌注組、丹參酮預(yù)處理組，丹參酮預(yù)處理組經(jīng)尾靜脈注射1%丹參酮ⅡA磺酸鈉注射液，缺血/再灌注組給予等體積生理鹽水預(yù)處理。于預(yù)處理14 d后采用結(jié)扎左側(cè)冠狀動(dòng)脈前降支30 min再復(fù)灌30 min的方法建立大鼠急性心肌缺血/再灌注損傷模型。檢測缺血預(yù)處理前后靜脈血超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase，SOD)、過氧化氫酶(Catalase，CAT)活性及缺血心肌組織丙二醛(Malondialdehyde，MDA)，心肌缺血區(qū)組織VEGF及VEGF-mRNA、缺氧誘導(dǎo)因子-1a(Hypoxia Inducible Factor-1a，HIF-1a)及HIF-1a mRNA、受體胎肝激酶-1(Fetal Liver Kinase 1，F(xiàn)LK-1)及FLK-1mRNA表達(dá)。結(jié)果：與缺血/再灌注組比較，丹參酮預(yù)處理組VEGF及VEGF-mRNA、FLK-1、FLK-1mRNA、HIF-1a、HIF-1amRNA的表達(dá)均明顯增強(qiáng)，SOD及CAT活性明顯提高，MDA降低(P<0.05)。結(jié)論：丹參酮ⅡA磺酸鈉預(yù)處理可提高VEGF表達(dá)及超氧化物歧化酶活性，對(duì)急性心肌缺血/再灌注損傷大鼠心肌有一定的保護(hù)作用。

丹參酮ⅡA磺酸鈉；急性心肌缺血預(yù)處理；血管內(nèi)皮生長因子

VEGF具有增加微、小靜脈血管的通透性、促使血管內(nèi)皮細(xì)胞分裂增殖及誘導(dǎo)血管生成再生等作用[1]。在心肌缺血再灌注中，VEGF作為一種高度特異性的促血管生長因子也因缺血刺激而出現(xiàn)增高以彌補(bǔ)心肌缺血缺氧。由于VEGF具有促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖遷移再生、誘導(dǎo)多種血管活性物質(zhì)合成并參與缺血心臟冠狀動(dòng)脈側(cè)支循環(huán)形成的作用，故VEGF在臨床上常作為血管內(nèi)皮功能的重要指標(biāo)之一[2]。而急性心肌梗死(Cute Myocrdil Infrction，MI)是在冠狀動(dòng)脈病變?nèi)缰鄻佑不⒐Ｗ璧牟±砘A(chǔ)上導(dǎo)致冠狀動(dòng)脈血供急劇減少或中斷，使缺血區(qū)心肌嚴(yán)重而持久地急性缺血[3]。近年來的流行病學(xué)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表明我國MI發(fā)病率呈升高趨勢[4]。急性心肌梗死、冠脈溶栓術(shù)、冠脈搭橋術(shù)、心肌梗死再通術(shù)等疾病和手術(shù)常引起急性心肌缺血再灌注損傷再灌注損傷[5]。在發(fā)生心肌缺血再灌注損傷再灌注損傷前及時(shí)的進(jìn)行干預(yù)(即缺血預(yù)處理)以減輕心肌缺血再灌注損傷再灌注損傷顯得尤其重要。近年來心肌缺血再灌注損傷再灌注損傷的防治已取得了明確的成果，丹參酮ⅡA磺酸鈉注射液可提高心肌細(xì)胞耐缺氧能力，增強(qiáng)心肌收縮力，擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈進(jìn)而改善心臟功能,預(yù)防和治療血管再狹窄及缺血心肌保護(hù)等作用[6]。為探討丹參酮ⅡA磺酸鈉注射液對(duì)急性心肌缺血再灌注損傷預(yù)處理后VEGF表達(dá)及心肌酶譜等的影響，我們建立大鼠心肌缺血再灌注損傷模型，采用丹參酮ⅡA磺酸鈉對(duì)大鼠進(jìn)行缺血預(yù)處理來研究其作用機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)健康Wistar大鼠16只，鼠齡(50±5)d，體質(zhì)量(180±50)g，采用隨機(jī)數(shù)字表編號(hào)隨機(jī)分隨機(jī)分為缺血/再灌注組、丹參酮預(yù)處理組，每組8只(n=8)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物由湖北醫(yī)藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物設(shè)施使用許可證SYXK(鄂)2011-0031，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證SCXK(鄂)2011-0008。動(dòng)物房溫度18～25 ℃，濕度50%～75%，12 h交替光照，分籠飼養(yǎng)，自由飲水，普通飼料喂養(yǎng)，每日觀察動(dòng)物進(jìn)食情況，稱體重，及時(shí)清理糞便，本研究中動(dòng)物處置方法符合動(dòng)物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 儀器及試藥 MDA、CAT、SOD測試盒(廠家：上海江萊生物科技有限公司，批號(hào)：KB13297)，大鼠VEGF共調(diào)節(jié)趨化因子1(VCC1)ELISA試劑盒(廠家：上海酶聯(lián)生物科技有限公司，產(chǎn)品貨號(hào)：028457)。提取mRNA試劑及反轉(zhuǎn)錄試劑(美國Invitrogen公司)。丹參酮ⅡA磺酸鈉注射液粉(杭州正大青春寶藥業(yè)有限公司，10 mg/瓶，國藥準(zhǔn)字GR0532)，使用前用蒸餾水配制成1%溶液并保存于4 ℃冰箱備用。

1.3 缺血預(yù)處理方法 丹參酮預(yù)處理組大鼠在制備急性心肌缺血?jiǎng)游锬Ｐ颓?4 d經(jīng)尾靜脈注射丹參酮ⅡA磺酸鈉注射液2 mL/100 g/d，按此劑量連續(xù)預(yù)處理14 d，缺血/再灌注組注射等量生理鹽水。

1.4 急性心肌缺血?jiǎng)游锬Ｐ椭苽?在經(jīng)缺血預(yù)處理14 d后，參照文獻(xiàn)[7]，所有動(dòng)物在造模前夜停止喂食，不禁水，手套法抓取大鼠，碘伏消毒局部皮膚腹腔注射2%戊巴比妥鈉(120 mg/kg)麻醉、腹部向上固定，接Ⅱ?qū)?lián)以記錄Ⅱ?qū)?lián)心電圖(EEG)，接小動(dòng)物呼吸機(jī)并調(diào)整潮氣量使麻醉大鼠呼吸與之同步，于(5-6)肋間用手術(shù)刀開胸，剪開心包暴露心臟，用玻璃分針向右輕輕按壓心臟，充分暴露冠狀動(dòng)脈前降支，用微創(chuàng)園縫合針自肺動(dòng)脈圓錐進(jìn)針、從左心房邊緣后外測出針，于縫合線與心臟前降支表面置一軟管，然后拉緊縫合線結(jié)扎左側(cè)冠狀動(dòng)脈前降支30 min再復(fù)灌30 min，并反復(fù)3次阻斷與再灌注的方法建立大鼠急性心肌梗死動(dòng)物模型。此時(shí)心電圖會(huì)立刻出現(xiàn)新的Q波并有ST段抬高、T波高聳或倒置等EEG改變，大鼠術(shù)后存活1 d以上就可判斷為造模型成功。

1.5 檢測指標(biāo) 參照文獻(xiàn)[8]，分別于缺血預(yù)處理前后經(jīng)大鼠眼眶靜脈采血，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)測定SOD、CAT活性。參照文獻(xiàn)[9]，在缺血預(yù)處理前及缺血預(yù)處理14 d后，3組動(dòng)物取血完畢后用手術(shù)剪斷頭處死動(dòng)物，剪下心臟,取左心室部位心肌缺血區(qū)組織，暫存至-30 ℃低溫冰箱保存待測，以備VEGF蛋白分析。檢測時(shí)取心肌缺血區(qū)組織標(biāo)本研磨，以3 000 r/min高速離心(離心半徑70 mm)取上清液，嚴(yán)格按SP試劑盒說明操作，采用雙抗體夾心EUSA法測定心肌缺血區(qū)組織FLK-1及FLK-1mRNA、HIF-1a及HIF-1amRNA、VEGF蛋白質(zhì)及mRNA的表達(dá)；采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)嚴(yán)格按試劑盒說明檢測心肌缺血區(qū)MDA含量。

2 結(jié)果

2.1 大鼠SOD、MDA、CAT水平比較 缺血/再灌注組心肌缺血區(qū)MDA增高，血清SOD、CAT水平明顯降低，與本組預(yù)處理前比較(P<0.05),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在缺血預(yù)處理14 d后丹參酮預(yù)處理組MDA降低、SOD、CAT含量明顯增高，與缺血/再灌注組及本組預(yù)處理前比較(P<0.05),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示丹參酮ⅡA磺酸鈉注射液具有促進(jìn)SOD、CAT的釋放，增強(qiáng)組織對(duì)自由基清除活性酶，抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的作用。見表1。

2.2 大鼠缺血區(qū)VEGF、VEGFmRNA表達(dá)比較 缺血/再灌注組在造模后VEGF、VEGFmRNA表達(dá)均有增強(qiáng)趨勢，與本組預(yù)處理前比較(P<0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示缺血、缺氧可促進(jìn)VEGF分泌。丹參酮預(yù)處理組在缺血預(yù)處理14 d后VEGF、VEGFmRNA表達(dá)明顯增強(qiáng)，且明顯高于缺血/再灌注組，與本組預(yù)處理前及缺血/再灌注組比較(P<0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表2。

2.3 大鼠HIF-l、HIF-lamRNA表達(dá)比較 在缺血預(yù)處理14 d后，缺血/再灌注組HIF-l、HIF-lamRNA表達(dá)呈升高趨勢，與本組預(yù)處理前比較(P>0.05)。丹參酮預(yù)處理組HIF-la、HIF-lamRNA比缺血/再灌注組增加更為明顯，與本組預(yù)處理前及缺血/再灌注組比較(P<0.05),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表3。

2.4 大鼠FLK-1、FLK-1mRNA表達(dá)比較 缺血/再灌注組在缺血預(yù)處理14 d后，F(xiàn)LK-1、FLK-1mRNA表達(dá)無明顯變化,與本組預(yù)處理前比較(P>0.05)，丹參酮預(yù)處理組FLK-1、FLK-1mRNA陽性表達(dá)均明顯增強(qiáng)，與本組預(yù)處理前及缺血/再灌注組比較(P<0.05),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表4。

表1 大鼠SOD、MDA、CAT水平比較

注：與本組預(yù)處理前比較，aP<0.05；與缺血/再灌注組比較,bP<0.05。

組別時(shí)間VEGF(Pg/mL)VEGFmRNA缺血再灌注組預(yù)處理前55.47±4.220.52±0.07預(yù)處理14d88.90±7.39a0.86±0.17a丹參酮預(yù)處理組預(yù)處理前56.50±5.870.54±0.08預(yù)處理14d110.37±9.12ab1.84±0.24ab

注：與本組預(yù)處理前比較，aP<0.05；與缺血/再灌注組比較,bP<0.05。

表3 大鼠缺血預(yù)處理HIF-l、HIF-lamRNA陽性表達(dá)比較

注：與本組預(yù)處理前比較，aP<0.05；與缺血/再灌注組比較,bP<0.05。

表4 大鼠缺血預(yù)處理FLK-1、FLK-1mRNA表達(dá)比較

注：與本組預(yù)處理前比較，aP<0.05；與缺血/再灌注組比較，bP<0.05。

3 討論

丹參酮ⅡA磺酸鈉注射液是從中草藥丹參塊莖中純化分離出的二萜醌類化合物經(jīng)磺化反應(yīng)而制成的滅菌注射液，主要藥理成份有丹參酮甲酯、丹參酚酸及丹參酮ⅡA等[10-11]。中醫(yī)典籍《吳普本草》中記載其味辛性涼、具涼血消癰、活血通經(jīng)之功效[12]，主治心肌腹痛[13]。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)亦證實(shí)其中的丹參素及丹參酮ⅡA具有擴(kuò)張心肌血管、增加缺血心肌組織血液流量，抑制缺血區(qū)組織細(xì)胞內(nèi)鈣超載而發(fā)揮心肌保護(hù)作用[14]。

在本實(shí)驗(yàn)中，丹參酮預(yù)處理組HIF-1a及HIF-1amRNA、VEGF蛋白及mRNA、FLK-1及FLK-1mRNA的陽性表達(dá)明顯增強(qiáng)，這可能與丹參酮ⅡA磺酸鈉注射液誘導(dǎo)缺血急性心肌的血管再生、擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈而改善微循環(huán)、增加冠脈灌注血流量，保證急性缺血心肌血液供應(yīng)、活血化瘀的藥性特征有關(guān)，另一方面也可能與其促進(jìn)Ca2+-ATP酶活性恢復(fù),增強(qiáng)鈉鉀ATP酶活力,減少細(xì)胞內(nèi)鈣超載,并通過鈉鉀ATP酶調(diào)節(jié)鈉氫交換來抑制鈉鈣交換,阻止Ca2+內(nèi)流,改善急性心肌組織能量代謝，進(jìn)而改善急性心肌缺血而起到保護(hù)作用有關(guān)。由于機(jī)體代謝過程中產(chǎn)生有害過氧化氫等代謝產(chǎn)物，在發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)時(shí)對(duì)機(jī)體組織器官造成嚴(yán)重?fù)p害，而CAT是細(xì)胞催化過氧化氫分解成氧和水的酶，清除體內(nèi)的過氧化氫，從而使細(xì)胞免于遭受過氧化氫的毒害，是生物防御體系的關(guān)鍵酶之一[15]。實(shí)驗(yàn)觀察到，丹參酮預(yù)處理組MAD明顯降低，SOD、CAT酶活性增強(qiáng)，說明丹參酮ⅡA磺酸鈉注射液可增強(qiáng)SOD及CAT等自由基清除活性酶的活性[16-17]，抑制有害代謝產(chǎn)物過氧化氫造成的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，改善急性心肌組織的能量代謝，改善病灶缺血、水腫，促進(jìn)細(xì)胞功能恢復(fù)，減輕缺血再灌注后組織損傷而起到急性心肌缺血/再灌注損傷保護(hù)作用。

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(2015-11-09收稿 責(zé)任編輯：張文婷)

Effect of Sodium SulfonateⅡ A Sulfonate Injection on VEGF of Rats with Acute Myocardial Ischemia Preconditioning

Li Xiaoyan1，Du Chengfen1，Xiao Min1，Xia Junlin1，Zhao Juan1，He Huaqiong2

(1Departmentofemergency，HubeiShiyanTaiheHospitalAffiliatedHospitaltoHubeiMedicalCollege，Shiyan442000，China； 2HubeiMedicalCollege，Shiyan442000，China)

Objective:To observe the effect of sodium sulfonate A sulfonate injection on the expression of vascular endothelial growth factor(VEGF)in rats with acute myocardial ischemia / reperfusion injury.Methods:Sixteen healthy rats were randomly divided into two groups，ischemia / reperfusion group and Salvia miltiorrhiza group.The two rats were treated with 1% sodium sulfonateⅡ A sulfonate injection and sodium chloride injection from caudal vein.After fourteen days，rats underwent a 30 min left anterior descending coronary artery occlusion and a 30 min reperfusion.This process was repeated 3 times.Mycardial tissue and serum were assessed by Western blot，quantitative RT-PCR and assay kit.Results:The expression of FLK-1，F(xiàn)LK-1mRNA，HIF-1a，HIF-1amRNA，VEGF and VEGF-mRNA were increased.The activity of SOD and CAT were significantly enhanced，however the content of MDA was decreased compared with IR.The difference showed statistically significant(P<0.05).Conclusion:Sodium Sulfonate A Sulfonate may enhance the expression of VEGF and the activity of SOD.It has certain protective effects on rats with acute myocardial ischemia / reperfusion injury.

Sodium Sulfonate A Sulfonate； Acute myocardial ischemia preconditioning； Vascular endothelial growth factor

十堰市科技局項(xiàng)目(編號(hào)：ZD2013013)

R285.5

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2016.10.046