常孟然 林 燕 李文靜 趙程博文 王紅彬

(北京中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，北京，100029)

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實(shí)驗(yàn)研究

免疫復(fù)合法建立大鼠潰瘍性結(jié)腸炎模型的探討

常孟然 林 燕 李文靜 趙程博文 王紅彬

(北京中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，北京，100029)

目的：探討免疫復(fù)合法和化學(xué)法建立大鼠潰瘍性結(jié)腸炎模型的優(yōu)劣，尋求更接近人類發(fā)病機(jī)制的潰瘍性結(jié)腸炎動物模型。方法：將Wistar大鼠隨機(jī)分成正常組、免疫復(fù)合組和化學(xué)組，免疫復(fù)合組前3周每周給予抗原乳化液(含異體抗原8 mg)注射1次，共注射3次，第4周免疫復(fù)合組和化學(xué)組均用100 mgTNBS/kg+50%乙醇灌腸。分別于造模后第1天、第14天、第56天取材，比較造模后各組大鼠的癥狀、體征、病理反應(yīng)等方面的變化。結(jié)果：與正常組比較，免疫復(fù)合組與化學(xué)組在造模后第1天均出現(xiàn)稀溏便、潰瘍、炎性反應(yīng)等典型潰瘍性結(jié)腸炎病變，但免疫復(fù)合組黏膜下層炎性反應(yīng)劇烈，維持時間長達(dá)8周，化學(xué)組潰瘍較免疫復(fù)合組深，但黏膜下層炎性反應(yīng)強(qiáng)度不及免疫復(fù)合組，潰瘍持續(xù)時間短，2周后趨向自愈。結(jié)論：免疫復(fù)合法模型表現(xiàn)穩(wěn)定，重復(fù)性好，病變持續(xù)時間長，發(fā)病機(jī)制更類似人類潰瘍性結(jié)腸炎，是較為理想的潰瘍性結(jié)腸炎模型。

免疫復(fù)合法；化學(xué)法；潰瘍性結(jié)腸炎；大鼠模型

潰瘍性結(jié)腸炎(Ulcerative Colitis，UC)，又稱慢性非特異性結(jié)腸炎，是以大腸(結(jié)腸與直腸)黏膜與黏膜下炎性反應(yīng)為主要特征的病變。臨床表現(xiàn)以反復(fù)發(fā)作的腹瀉、腹痛、黏液膿血便和里急后重為主。病程呈慢性過程，發(fā)作期與緩解期交替，少數(shù)癥狀持續(xù)并逐漸加重，遷延難愈。UC發(fā)病機(jī)制尚不明確，目前認(rèn)為主要與遺傳、環(huán)境、免疫等因素有關(guān)[1]，其中免疫異常被認(rèn)為是UC發(fā)病的重要因素[2-3]。近年來UC發(fā)病率呈上升的趨勢[4]，UC發(fā)病機(jī)制與藥物療效的實(shí)驗(yàn)研究已成為醫(yī)學(xué)界關(guān)注的重點(diǎn)，因此選擇何種動物模型對UC的實(shí)驗(yàn)研究意義重大。實(shí)驗(yàn)表明，免疫復(fù)合法重復(fù)性好，病變更類似人類UC，持續(xù)時間長，是較理想的造模方法[5]。本實(shí)驗(yàn)通過對免疫復(fù)合法與化學(xué)法獲取的UC模型進(jìn)行比較，試圖為免疫損傷致瘍更能獲得類似人類發(fā)病機(jī)制的UC動物模型尋求客觀依據(jù)。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 Wistar大鼠66只，雄性，SPF級，體重約120 g，由北京斯貝福實(shí)驗(yàn)動物有限公司提供。實(shí)驗(yàn)用家兔9只，雄性，體重約2 kg，由北京興隆動物養(yǎng)殖有限公司提供。

1.2 主要試劑與儀器 三硝基苯磺酸和完全弗氏佐劑(Sigma)；BCA蛋白濃度測定試劑(北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司)；無水乙醇、水合氯醛、4%多聚甲醛溶液(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑北京有限公司)；恒溫高速離心機(jī)(Eppendorf，型號5810R)；紫外分光光度計(jì)(UNICAM，型號HE10Sα)。

2 方法

2.1 分組與造模 將Wistar大鼠隨機(jī)分成正常組18只、免疫復(fù)合組24只和化學(xué)組24只。刮取家兔結(jié)腸黏膜后組織勻漿，漿液以12 000 r/min速度離心15 min，取上清液與等量完全弗氏佐劑配成抗原乳化液，分別于適應(yīng)性飼養(yǎng)后第1周、第2周、第3周在大鼠腹股溝皮下注射，每只每次注射8 mg抗原蛋白，現(xiàn)配現(xiàn)用。第4周，將禁食(不禁水)48 h的大鼠用3.5%水合氯醛按1 mL/100 g麻醉后，用石蠟油涂于灌胃針外，從大鼠肛門輕柔插入結(jié)腸約5 cm后，按100 mgTNBS/kg+50%乙醇劑量緩慢灌腸，倒置1 min后傾倒平躺放置5 min?；瘜W(xué)組前3周不注射抗原乳化液，第4周操作與免疫復(fù)合組相同。

2.2 取材 各組于造模后第1天、第14天、第56天禁食(不禁水)48 h后麻醉取肛門上端2 cm處結(jié)腸5 cm，沿腸系膜縱行切開，展開用生理鹽水洗凈，4%多聚甲醛溶液固定后編號，常規(guī)石蠟包埋行HE染色。

2.3 觀察指標(biāo) 1)外觀體征；2)解剖開腹后肉眼觀察腹腔整體狀態(tài)、結(jié)腸大體形態(tài)及結(jié)腸黏膜損傷程度；3)光鏡下觀察病理HE染色切片。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用(均值±標(biāo)準(zhǔn)差)表示，用SPSS 20軟件對數(shù)據(jù)作統(tǒng)計(jì)分析，2組間正態(tài)分布比較采用T檢驗(yàn)，偏態(tài)分布用非參數(shù)檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 一般情況 免疫復(fù)合組大鼠每次注射抗原乳化液后，活動減少，毛色及光澤度較正常略淺，飲食減少。免疫復(fù)合組和化學(xué)組在造模完成后第1天，均逐漸出現(xiàn)懶動、食少、大便次數(shù)增多、軟便或稀便、大便末端有黏液，毛色逐漸變暗、光澤度差，第3天最為嚴(yán)重。免疫復(fù)合組大便溏表現(xiàn)時長約為2周，便質(zhì)稀軟直至第8周，活動減少、飲食減少、毛色澤差持續(xù)時間約為8周；化學(xué)組癥狀持續(xù)2周后，第3周活動飲食及毛色逐漸開始好轉(zhuǎn)。

3.2 形態(tài)學(xué)表現(xiàn) 根據(jù)潰瘍、炎性反應(yīng)及損傷程度，每只大鼠結(jié)腸得分為3項(xiàng)得分之和，參照CMDI評分體系(表1)，各組結(jié)果如下(表2)。

表1 CMDI評分標(biāo)準(zhǔn)

表2 各組不同時間CMDI評分比較

注：*與化學(xué)組比較P<0.01，◇同組內(nèi)第1天比較P<0.05，△第56天形態(tài)學(xué)表現(xiàn)無潰瘍和炎性反應(yīng)。

3.3 病理表現(xiàn) 光鏡下正常組可清楚地觀察到細(xì)胞形態(tài)正常，各層結(jié)構(gòu)完整，上皮排列整齊，結(jié)腸腺規(guī)則，杯狀細(xì)胞豐富；黏膜下層、肌層、漿膜層結(jié)構(gòu)清晰，未見炎性細(xì)胞浸潤。

造模后第1天，免疫復(fù)合組與化學(xué)組均有黏膜腺體壞死脫落，黏膜上皮細(xì)胞大片脫落、壞死，潰瘍面可見滲出物，大量腺細(xì)胞萎縮，黏膜淺層結(jié)構(gòu)消失、壞死；黏膜下層有充血、腫脹；肌層被破壞，部分肌纖維斷裂。免疫復(fù)合組潰瘍病變集中在黏膜肌層外，形成淺潰瘍，潰瘍邊緣腸腺細(xì)胞被破壞、排列紊亂，杯狀細(xì)胞明顯減少；黏膜下層有大量炎細(xì)胞浸潤?；瘜W(xué)組形成明顯深潰瘍，潰瘍深達(dá)黏膜下層，黏膜下層有炎細(xì)胞浸潤，血管及淋巴管擴(kuò)張。炎性反應(yīng)化學(xué)組較免疫復(fù)合組輕。

造模后第14天，2組均有不同程度的自愈傾向，免疫復(fù)合組黏膜上皮細(xì)胞被破壞，黏膜層局部有缺損，部分腺細(xì)胞萎縮，仍為淺潰瘍，黏膜層有炎細(xì)胞浸潤，局部伴有充血，潰瘍病灶處淋巴細(xì)胞聚集；黏膜下層仍有出血、腫脹，炎細(xì)胞聚集，程度較前為輕，靜脈充血嚴(yán)重，淋巴管擴(kuò)張，淋巴濾泡增多；有肉芽組織形成?；瘜W(xué)組黏膜上皮脫落，腺細(xì)胞排列紊亂，萎縮細(xì)胞減少，纖維結(jié)締組織和血管增生明顯，黏膜下層輕度充血，有少量炎性細(xì)胞浸潤。

造模后第56天，免疫復(fù)合組未完全自愈，黏膜層上皮細(xì)胞缺損、腺細(xì)胞缺失，腺細(xì)胞增生、擴(kuò)張，形成絨毛上皮，黏膜肌層仍有損傷；黏膜下層有炎細(xì)胞聚集，腫脹，血管壁充血、擴(kuò)張，淋巴管擴(kuò)張，淋巴濾泡增多；黏膜肌層增厚。化學(xué)組結(jié)腸組織結(jié)構(gòu)與正常無明顯差異。

附2種造模法光鏡下的病理照片，如圖1。

圖1 2種造模法光鏡下的病理照片

注：以上均為光鏡下100倍圖片。

4 討論

UC病變部位主要限于結(jié)腸黏膜與黏膜下層，以潰瘍與炎細(xì)胞浸潤為主，故對模型成功與否應(yīng)以此病理特征為判斷依據(jù)。本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)造模后于第1、14、56天3個時間段取材，以觀察大鼠不同病程階段的結(jié)腸病理變化。上述結(jié)果表明：在UC急性期化學(xué)法模型病變程度明顯重于免疫復(fù)合法模型，病變累及范圍較免疫復(fù)合法模型局限，僅累及黏膜層，化學(xué)法模型病變持續(xù)時間短，近14 d可自愈；免疫復(fù)合法模型病變范圍廣而深，由黏膜層到黏膜下層，可累及全結(jié)腸甚至回腸末段，病變持續(xù)時間長，可維持8周以上，仍可見結(jié)腸壁增厚及炎性反應(yīng)，急、慢性期的病理特征明顯。因此，免疫復(fù)合法造模病變持續(xù)時間長，潰瘍形成與炎性反應(yīng)均有體現(xiàn)，完整地詮釋了UC急慢性不同時期的病理變化，更符合臨床UC的病理要求。UC屬自身免疫性疾病，其發(fā)病機(jī)制雖尚不明確，但目前認(rèn)為其可能機(jī)制是在腸腔內(nèi)抗原誘導(dǎo)下遺傳易感患者免疫反應(yīng)過度激活引起的[6]。因此，本實(shí)驗(yàn)先利用家兔結(jié)腸黏膜蛋白異體抗原刺激，使實(shí)驗(yàn)大鼠腸道菌群失調(diào)，腸腔內(nèi)致病菌和條件致病菌增多，且腸黏膜通透性增加，導(dǎo)致腸腔內(nèi)細(xì)菌及/或細(xì)菌產(chǎn)物向黏膜固有層移位，引起免疫細(xì)胞的激活及炎性反應(yīng)[7]，再用化學(xué)誘導(dǎo)，TNBS是一種半抗原物質(zhì)，乙醇作為有機(jī)溶劑溶解腸黏膜表面的黏液，破壞腸黏膜屏障，使TNBS與腸組織大分子組織蛋白結(jié)合后成為完全抗原，導(dǎo)致針對腸黏膜的免疫反應(yīng)，從而誘導(dǎo)UC的發(fā)生[8]。這種復(fù)合造模方法的原理與UC的發(fā)病機(jī)制是基本相符的。

其他的造模方法主要有免疫法[9]、復(fù)合法[10-11]、化學(xué)物質(zhì)誘導(dǎo)法[12]、基因修飾模型和自發(fā)性動物模型[6]?；瘜W(xué)刺激法操作簡單，成功率高，與臨床上UC的致病因素差異大，且模型自愈性極強(qiáng)，慢性期表現(xiàn)不如免疫復(fù)合法，與臨床UC病程表現(xiàn)不太一致。現(xiàn)普遍運(yùn)用免疫復(fù)合法建立并獲取穩(wěn)定UC模型，目前公認(rèn)TNBS劑量在100 mg/kg時模型最為穩(wěn)定[13]，對乙醇濃度有文獻(xiàn)報(bào)道50%為最佳，故TNBS灌腸劑量為100 mg/kg+50%乙醇。免疫法蛋白抗原劑量通常為8 mg。本實(shí)驗(yàn)又在以下幾個方面做了改進(jìn)：1)其他免疫法造模實(shí)驗(yàn)中，多間隔2周給予兔腸黏膜制備的抗原乳化液(含抗原8 mg)共免疫2次[14]。本實(shí)驗(yàn)每隔1周注射一次抗原乳化液，共注射3次，抗原刺激頻次加大，更加突顯免疫損傷的致病作用。2)通常實(shí)驗(yàn)取家兔結(jié)腸黏膜制成組織勻漿為4 ℃離心，速度3500 r/min，離心時間30 min，而本實(shí)驗(yàn)4 ℃12 000 r/min離心15 min，充分離心使抗原蛋白更細(xì)小，易被吸收并引發(fā)免疫反應(yīng)。3)本實(shí)驗(yàn)灌腸時未使用傳統(tǒng)的硅膠管，而用灌胃針代替，灌胃針可重復(fù)使用，口徑又較硅膠管小，同時質(zhì)地較硬，經(jīng)石蠟潤滑后容易插入肛門；與注射器連接緊密，灌腸過程中溢流量小，方便灌腸操作[15]，又可以減少人為機(jī)械損傷。

因此，本實(shí)驗(yàn)注重免疫損傷對UC發(fā)病及病理的影響，在以往實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上稍加技術(shù)改進(jìn)，從而獲取了持續(xù)而穩(wěn)定的、更符合人類UC發(fā)病機(jī)制的理想動物模型。

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(2015-12-22收稿 責(zé)任編輯：張文婷)

Discussion on Establishment of Experimental Rats Model with Ulcerative Colitis by Immune Complex Method

Chang Mengran, Lin Yan, Li Wenjing, Zhao Chengbowen, Wang Hongbin

(SchoolofBasicMedicalSciences,BeijingUniversityofChinesemedicine,Beijing100029,China)

Objective: To screen an optimal ulcerative colitis animal model more close to the pathogenesis of human body by analysis of the strength and weakness between the immune complex method and the chemical method for establishing an experimental rat model. Methods: Wistar rats were randomly divided into normal group, immune complex group and chemical group. Rats in immune complex group are injected with antigen emulsion (including 8 mg variant antigen) once a week in the first three weeks. In the fourth week, the rats in the immune complex group and those in the chemical group were coloclystered by TNBS (2, 4, 6-trinitrobenzenesulfonic acid sol, 100 mg/kg) and 50% alcohol. Colon samples from the three groups were taken at the 1 st, 14th and 56th day respectively and symptom, sign and pathological reaction of the three groups after modeling were compared. Results: Compared with the normal group, rats in the immune complex group and chemical group had typical ulcerative colitis symptoms at the 1 st day, like loose stool, ulcer, inflammatory reaction, while the submucosa inflammatory reaction of rats in the immune complex group was stronger than that of the chemical group lasting for eight weeks. The ulcer in the chemical group was more severe than that of the immune complex group, but submucosa inflammatory reaction weaker, with less duration and self-cures two weeks later. Conclusion: The immune complex model is the optical ulcerative colitis one, for stable performance, easily repeated, and long duration and the ulcerative colitis pathogenesis in rat model is much more close to that of human body.

Immune complex method; Chemical method; Ulcerative colitis; Rats model

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(編號：81202682)——基于線粒體能量代謝探討潰瘍性結(jié)腸炎脾虛為本的病理基礎(chǔ)

R574.62；R285.5

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2016.10.041