孔令博 郭玉紅 付躍峰 李艷鵬 牛麗強(qiáng) 楊雪冬 姜 旭 劉佳瑩 劉清泉

(1 北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院，北京，100700； 2 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院，北京，100010)

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芪歸銀方對多重耐藥銅綠假單胞菌感染大鼠血清IL-1β水平的影響

孔令博1郭玉紅2付躍峰1李艷鵬1牛麗強(qiáng)1楊雪冬1姜 旭1劉佳瑩1劉清泉2

(1 北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院，北京，100700； 2 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院，北京，100010)

目的:探討芪歸銀方對多重耐藥銅綠假單胞菌感染大鼠血清IL-1β水平的影響。方法:將SD大鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、西藥對照組、芪歸銀方組、中西醫(yī)結(jié)合組5組，運(yùn)用ELISA檢測采用不同干預(yù)方法的各組大鼠血清IL-1β水平，比較各組之間的差異。結(jié)果:模型組大鼠血清IL-1β水平在各時(shí)間點(diǎn)均較空白組明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；西藥對照組、芪歸銀方組、中西醫(yī)結(jié)合組大鼠血清IL-1β水平在3 h、8 h、24 h較空白組明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；西藥對照組、芪歸銀方組、中西醫(yī)結(jié)合組大鼠血清IL-1β水平在72 h、5 d較空白組無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；西藥對照組大鼠血清IL-1β水平在72 h、5 d較模型組降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；扶正透邪方組大鼠血清IL-1β水平在24 h較模型組升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，在5 d較模型組降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；中西醫(yī)結(jié)合組大鼠血清IL-1β水平在24 h較模型組升高，在72 h、5 d較模型組降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。結(jié)論:與抗生素相比，芪歸銀方能夠在炎性反應(yīng)早期增強(qiáng)促炎遞質(zhì)的釋放，二者聯(lián)用則作用更明顯，有利于積極清除細(xì)菌及毒素，并隨著時(shí)間的推移，使促炎遞質(zhì)的釋放迅速下降，維持正常炎性反應(yīng)水平以免太長的過激炎性反應(yīng)不利于損傷的修復(fù)，充分體現(xiàn)了“陰平陽秘”“以平為期”的中醫(yī)理論。

扶正透邪；芪歸銀方；多重耐藥菌感染；炎性反應(yīng)因子；IL-1β

耐藥菌的高頻出現(xiàn)及其導(dǎo)致的高死亡率和沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，已經(jīng)成為國內(nèi)外倍受關(guān)注的重要公共衛(wèi)生問題。美國疾病控制與預(yù)防中心(Centers for Disease Control and Prevention，CDC)首次對耐藥細(xì)菌進(jìn)行分級，僅美國每年有超過200萬人感染耐藥細(xì)菌[1]。如何降低其發(fā)病率及死亡率已成為目前國內(nèi)外亟待解決的問題。中醫(yī)藥在感染性疾病中調(diào)節(jié)機(jī)體炎性反應(yīng)免疫和清除內(nèi)毒素等方面的作用已經(jīng)得到廣泛證實(shí)。在中醫(yī)理論的指導(dǎo)下運(yùn)用中藥同樣能夠?qū)⒖鼓退幖?xì)菌毒素與保護(hù)臟器組織、調(diào)節(jié)免疫紊亂相結(jié)合，促進(jìn)損傷組織的修復(fù)，阻斷微循環(huán)障礙的病理過程，進(jìn)而提高臨床抗耐藥菌感染的療效[2]。有學(xué)者認(rèn)為多重耐藥菌感染的發(fā)生與正虛邪伏、伺機(jī)而作、待時(shí)而發(fā)的伏邪致病特點(diǎn)如出一轍，治療上應(yīng)溫陽扶正、透邪外出[3]。有鑒于此，前期研究以具有代表性的多重耐藥銅綠假單胞菌為研究對象，證實(shí)了扶正透邪之芪歸銀方的體外抑菌作用及其與抗生素的協(xié)同抑菌作用[4-5]。在此基礎(chǔ)上，我們在本研究通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)對芪歸銀方干預(yù)多重耐藥銅綠假單胞菌感染炎性反應(yīng)的作用機(jī)制進(jìn)行了初步探索，具體報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 藥物 芪歸銀方(黃芪60 g、當(dāng)歸15 g、金銀花15 g、青蒿10 g、虎杖10 g)提取物(1.0 g/mL)，由北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院中藥研究室提供；注射用頭孢他啶，深圳致君制藥有限公司，產(chǎn)品批號E20100102。(大鼠給藥劑量按照70 kg成人用量的6.3倍計(jì)算)

1.2 動物 SD大鼠200只，雌雄各半，清潔級，體重200～220 g，購自中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心，合格證號SCXK-(軍)2007-004。正常光照條件下，食、水可自由攝取，室溫控制在18～22 ℃之間。

1.3 菌株 多重耐藥銅綠假單胞菌臨床分離株1643號，由首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽醫(yī)院細(xì)菌室提供。

1.4 試劑與設(shè)備 M-H瓊脂平板購自賽默飛世爾生物化學(xué)制品有限公司(批號：XWO1100301)，RPMI-1640培養(yǎng)基購自Sigma公司(批號：NXL0743)，Rat IL-1βELISA試劑盒(96t ZABFBZAA01)購自上海依科賽生物制品有限公司，西黃芪膠購自上海耐今實(shí)業(yè)有限公司(批號：C0016895)。

立式自動電熱壓力蒸汽滅菌器(ASTELL公司，型號：AMA440N)，恒溫培養(yǎng)箱(SAMYO公司，型號：SIM-F124)，渦混合器(Scientific Industries公司，型號：VORTEX-GENIE 2)，低溫高速離心機(jī)(上海愛丁堡生物科技發(fā)展有限公司，型號：Kendro Labofuge 400R)，微量天平(METTLER公司，型號：AE100)，酶標(biāo)分析儀(北京普朗新技術(shù)有限公司，型號：DNM-9602)。

1.5 制備菌懸液 將實(shí)驗(yàn)菌株接種于M-H瓊脂培養(yǎng)基活化，經(jīng)37 ℃恒溫培養(yǎng)18～24 h后，用生理鹽水洗脫菌落，離心，3 000 r/min，20 min，棄去上清，加入生理鹽水，混勻后吸出0.5 mL加入新的無菌試管中，加入適量生理鹽水，與比濁計(jì)進(jìn)行比濁，將菌液稀釋成24×108CFU/mL，用酶標(biāo)儀檢測OD值為0.675±0.005，再將其稀釋成0.48×108CFU/mL，作為實(shí)驗(yàn)菌懸液。

1.6 制備動物模型 SD大鼠常規(guī)飼養(yǎng)1周，室溫控制在18～22 ℃之間，自由獲取食、水，采血前禁食過夜。按照楊鈞等[6]報(bào)道的方法建立多重耐藥銅綠假單胞菌腹腔感染大鼠模型。具體方法如下：將多重耐藥銅綠假單胞菌菌液(以下簡稱菌液)同2.0%西黃芪膠1∶1混合后，腹腔注射。注射后自由進(jìn)食、飲水。

1.7 動物分組與處理 將SD大鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分為空白組、模型組、西藥對照組、芪歸銀方組、中西醫(yī)結(jié)合組，共5組?？瞻捉M給予蒸餾水灌胃2 mL；模型組腹腔注射菌液后(8 mL/kg)，即給予蒸餾水灌胃2 mL；西藥對照組腹腔注射菌液后(8 mL/kg)，即給予頭孢他啶，肌肉注射0.45 g/kg；芪歸銀方組腹腔注射菌液后(8 mL/kg)，即給予芪歸銀方提取物灌胃2 mL；中西醫(yī)結(jié)合組腹腔注射菌液后(8 mL/kg)，即給予芪歸銀方提取物灌胃2 mL，同時(shí)予頭孢他啶，肌肉注射0.45 g/kg。以上各組按時(shí)間點(diǎn)又分為腹腔注射后3 h、8 h、24 h、72 h和5 d組，每組各8只，各組按分組所示相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)，留取血及組織標(biāo)本。

1.8 大鼠血清IL-1β水平ELISA檢測方法 準(zhǔn)備工作：1)提前20 min從冰箱中取出試劑盒，以平衡至室溫。2)將濃縮洗滌液用雙蒸水稀釋(1∶20)。3)標(biāo)準(zhǔn)品：加入試劑稀釋液0.5 mL至凍干標(biāo)準(zhǔn)品中，靜置15 min，待其充分溶解后，輕輕混勻(濃度為2 000 pg/mL)。然后根據(jù)2 000、1 000、500、250、125、62.5、31.25、0 pg/mL濃度進(jìn)行稀釋。4)生物素化抗體工作液：使用前30 min用試劑稀釋液稀釋濃縮生物素化抗體(1∶100)配置成生物素化抗體工作液。5)酶結(jié)合物工作液：使用前30 min用試劑稀釋液稀釋濃縮酶結(jié)合物(1∶100)配置成酶結(jié)合物工作液，室溫避光放置。

洗滌方法：用自動洗板機(jī)，注入350 μL洗滌液，注入與吸出間隔20～30 s。洗板4次。

操作步驟：1)從已平衡至室溫的密封袋中取出試驗(yàn)所需板條。2)留空白孔。3)先按標(biāo)準(zhǔn)品稀釋方法加好標(biāo)準(zhǔn)品(100 μL/孔)，0 pg/mL孔加試劑稀釋液(Assay Diluent)100 μL；在每個(gè)樣本孔中加入50 μL試劑稀釋液(Assay Diluent)和50 μL樣本(此時(shí)樣本已做了1∶2倍稀釋，計(jì)算結(jié)果時(shí)樣本含量要乘以2)；隨后在樣本和標(biāo)準(zhǔn)孔中加入50 μL生物素化抗體工作液，用封板膠紙封住反應(yīng)孔。4)室溫(20～25 ℃)，使用微量振蕩儀(最低頻率，100 r/min)，孵育120 min。5)洗板5次。6)除空白孔外，加入酶結(jié)合物工作液(100 μL/孔)，用封板膠封住反應(yīng)孔。7)室溫(20～25 ℃)，使用微量振蕩儀(最低頻率，100 r/min)，孵育60 min。8)洗板5次。9)加入顯色底物(包括空白孔)100 μL/孔，室溫(22～25 ℃)，避光孵育10 min。10)加入終止液(包括空白孔)100 μL/孔，混勻后即刻測量OD450值(10 min內(nèi))。

結(jié)果判斷：1)每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品和標(biāo)本的OD值減去零孔的OD值。2)手工繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。以標(biāo)準(zhǔn)品濃度作橫坐標(biāo)，OD值作縱坐標(biāo)，以平滑線連接各標(biāo)準(zhǔn)品的坐標(biāo)點(diǎn)。通過標(biāo)本的OD值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出其濃度。3)若標(biāo)本OD值高于標(biāo)準(zhǔn)曲線上限，應(yīng)當(dāng)稀釋后重測，計(jì)算濃度時(shí)應(yīng)乘以稀釋倍數(shù)。

2 結(jié)果

模型組和各治療組大鼠血清IL-1β水平在感染后3 h已經(jīng)開始升高。各治療組大鼠血清IL-1β高峰較模型組延遲出現(xiàn)，72 h后模型組大鼠血清IL-1β維持在高于正常水平，而各治療組大鼠血清IL-1β則接近正常水平。

模型組大鼠血清IL-1β水平在各時(shí)間點(diǎn)均較空白組明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；西藥對照組、芪歸銀方組、中西醫(yī)結(jié)合組大鼠血清IL-1β水平在3 h、8 h、24 h較空白組明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；西藥對照組、芪歸銀方組、中西醫(yī)結(jié)合組大鼠血清IL-1β水平在72 h、5 d較空白組無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；西藥對照組大鼠血清IL-1β水平在72 h、5 d較模型組降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；扶正透邪方組大鼠血清IL-1β水平在24 h較模型組升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，在5 d較模型組降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；中西醫(yī)結(jié)合組大鼠血清IL-1β水平在24 h較模型組升高，在72 h、5 d較模型組降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見表1、圖1。

表1 各組大鼠血清IL-1β水平的變化

注：與模型組相比較，*P<0.05，**P<0.01；與空白組相比較，△P<0.05，△△P<0.01。

圖1 各組大鼠血清IL-1β水平的變化

3 討論

炎性反應(yīng)是機(jī)體對損傷性傷害的一種防御性反應(yīng)，其對感染性疾病的發(fā)生、發(fā)展尤為重要。不同時(shí)期、不同作用炎性反應(yīng)因子的釋放和調(diào)節(jié)左右著感染性疾病的發(fā)生、發(fā)展過程。適度的炎性反應(yīng)對人體是有益的，但是持續(xù)的炎性反應(yīng)則會造成機(jī)體自身調(diào)節(jié)能力的失調(diào)，從而導(dǎo)致炎性反應(yīng)失控，發(fā)生級聯(lián)瀑布效應(yīng)，出現(xiàn)更為嚴(yán)重的自身損傷[7]。促炎因子與抗炎因子的不平衡是加重炎性反應(yīng)免疫紊亂的重要因素[8]。而這一點(diǎn)對多重耐藥菌感染的重要性更是尤為突出。眾所周知，抗生素能否有效治療細(xì)菌感染的關(guān)鍵在于其是否能夠有針對性的清除病原菌及其產(chǎn)生的內(nèi)毒素，使機(jī)體的炎性反應(yīng)得到有效控制。耐藥菌感染正是由于缺乏針對性的抗生素，而無法迅速、有效地控制炎性反應(yīng)，比普通細(xì)菌感染更易導(dǎo)致或加重機(jī)體炎性反應(yīng)的失衡，造成炎性反應(yīng)失控，加劇機(jī)體不可逆的炎性反應(yīng)損傷。因而，能否有效調(diào)控感染后機(jī)體的炎性反應(yīng)失衡，阻斷炎性反應(yīng)瀑布反應(yīng)對提高抗多重耐藥菌感染臨床療效和改善預(yù)后至關(guān)重要。而IL-1β是一種主要由巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的早期促炎性細(xì)胞因子，是體內(nèi)調(diào)節(jié)免疫和炎性反應(yīng)的中心遞質(zhì)，無論是在疾病引發(fā)的起始階段還是在炎性反應(yīng)發(fā)展的過程中，若是產(chǎn)生在不恰當(dāng)?shù)奈恢没蚴呛坎贿m當(dāng)都將對機(jī)體產(chǎn)生負(fù)面的效應(yīng)[9]。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為正邪斗爭的消長盛衰決定著疾病的發(fā)生、發(fā)展變化及其轉(zhuǎn)歸，扶正祛邪是中醫(yī)的基本治則之一，其目的在于恢復(fù)邪氣內(nèi)侵所導(dǎo)致的陰陽失衡狀態(tài)。本實(shí)驗(yàn)所選芪歸銀方中黃芪、當(dāng)歸補(bǔ)氣養(yǎng)血、培補(bǔ)元?dú)猓侵委熞驓庋蛔愣l(fā)熱的經(jīng)典方劑，加入金銀花清解氣分熱毒，透邪外出，青蒿清熱解毒，透達(dá)外邪，虎杖解毒散結(jié)，具有活血之功?？v觀全方，補(bǔ)氣養(yǎng)血以扶正，去除細(xì)菌產(chǎn)生耐藥的根本，清熱透達(dá)，以清除細(xì)菌，給邪以出路，達(dá)到祛邪的目的。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示西藥對照組、芪歸銀方組和中西醫(yī)結(jié)合組在炎性反應(yīng)早期均能夠明顯增加多重耐藥銅綠假單胞菌感染大鼠血清IL-1β的釋放。但值得注意的是，與抗生素相比，芪歸銀方能夠在炎性反應(yīng)早期增強(qiáng)促炎遞質(zhì)的釋放，二者聯(lián)用則作用更明顯，有利于積極清除細(xì)菌及毒素。而隨著時(shí)間的推移，芪歸銀方則能夠使促炎遞質(zhì)的釋放迅速下降，維持正常炎性反應(yīng)水平以免太長的過激炎性反應(yīng)不利于損傷的修復(fù)。研究結(jié)果顯示芪歸銀方具有適度調(diào)節(jié)炎性反應(yīng)，改善炎性反應(yīng)因子不適當(dāng)釋放對機(jī)體產(chǎn)生負(fù)面的效應(yīng)，充分體現(xiàn)了“陰平陽秘”“以平為期”的中醫(yī)理論。在合理使用抗生素的基礎(chǔ)上，針對多重耐藥菌感染的病機(jī)特點(diǎn)應(yīng)用扶正透邪之芪歸銀方，有利于阻斷炎性反應(yīng)瀑布反應(yīng)，促進(jìn)機(jī)體損傷的修復(fù)，極具提高抗多重耐藥菌感染臨床療效的潛力與優(yōu)勢，值得進(jìn)一步深入研究，從而為臨床治療多重耐藥菌感染提供可靠的實(shí)驗(yàn)證據(jù)和參考依據(jù)。

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(2016-09-12收稿 責(zé)任編輯：洪志強(qiáng))

The Impact of Qiguiyin Decoction on IL-1β in Serum of Multi-drug Resistant Pseudomonas Aeruginosa Infected Rats

Kong Lingbo1, Guo Yuhong2,Fu Yuefeng1, Li Yanpeng1, Niu Liqiang1,Yang Xuedong1,Jiang Xu1,Liu Jiaying1,Liu Qingquan2

(1DongzhimenHospital,BeijingUniversityofChineseMedicine，Beijing100700,China;2BeijingHospitalofTCM,Beijing100010,China)

Objective:To explore the impact of qiguiyin decoction on IL-1β in serum of multi-drug resistant pseudomonas aeruginosa infection rats.Methods:SD rats were randomly divided into blank group, model group, western medicine control group, qiguiyin decoction group, and integrated Traditional Chinese Medicine and western medicine group. Level of IL-1β in rats was detected by ELISA, and then the differences between groups were compared.Results:The level of IL-1β in model group was significantly higher than that of blank group, with statistically significant difference (P<0.01). The levels of IL-1β in western medicine control group, qiguiyin decoction group, and integrated Traditional Chinese Medicine and western medicine group at 3 h、8 h、24 h were significantly higher than those of blank group, and the difference was statistically significant(P<0.01). The levels of IL-1β in western medicine control group, qiguiyin decoction group, and integrated Traditional Chinese Medicine and western medicine group at 72 h、5 d showed no statistically significant difference when comparing with those of blank group(P>0.05). The levels of IL-1β in control group at 72 h、5 d were lower than model group, the difference was statistically significant(P<0.01). The level of IL-1β in qiguiyin decoction group at 24 h was significantly higher than that of model group, and the difference was statistically significant(P<0.05). The level of IL-1β in qiguiyin decoction group at 5 d was lower than that of model group, and the difference was statistically significant(P<0.01). The level of IL-1β in integrated Traditional Chinese Medicine and western medicine group at 24 h was significantly higher than model group, and the difference was statistically significant(P<0.01). The level of IL-1β in integrated Traditional Chinese Medicine and western medicine group at 72 h、5 d were lower than model group, and the difference was statistically significant(P<0.01).Conclusion:Compared with antibiotics ,qiguiyin decoction increased the release of pro-inflammatory medium in early inflammatory response. The efficacy of antibiotics combined with qiguiyin decoction was more obvious, which removed bacteria and toxins while the release of pro-inflammatory medium dropping rapidly over time to keep normal inflammatory response level for repairing damage. And it indicated Chinese medicine theories, yin and yang in equilibrium, to achieve balance.

Fuzheng touxie;Qiguiyin Decoction;Multi-drug resistant pseudomonas aeruginosa infection; Inflammatory factor; Interleukin-1β

北京中醫(yī)藥大學(xué)基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)項(xiàng)目(編號：2015-JYB-JSMS057)；國家“十二五”科技重大專項(xiàng)(編號：2013ZX09102026)
并列第一作者：孔令博，男，副主任醫(yī)師，中醫(yī)急診與危重病方向；郭玉紅，女，副主任醫(yī)師，中西醫(yī)結(jié)合急診與危重病方向

R285.5

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2016.10.007