林 斌,黃菊青,官雪芳,鄭 怡,徐慶賢,錢 蕾

(福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研究所,福建福州 350003)

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植物乳桿菌HLX37降膽固醇活性研究

林 斌,黃菊青,官雪芳,鄭 怡,徐慶賢,錢 蕾

(福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研究所,福建福州 350003)

HLX37是從福建南平地區(qū)農(nóng)戶自然發(fā)酵的酸乳中分離得到的一株植物乳桿菌,本文對(duì)該菌株的耐酸耐膽鹽能力和體內(nèi)外降膽固醇活性進(jìn)行研究。結(jié)果表明,HLX37菌株在pH為3.0和膽鹽濃度為3.0 g/L環(huán)境下培養(yǎng)4 h的存活率分別為59.1%±4.8%和48.2%±4.9%,且對(duì)添加膽鹽的MRS+CHOL培養(yǎng)基中膽固醇具有良好的降解能力(24 h和48 h降解率分別達(dá)37.33%±2.55%和44.72%±2.74%);連續(xù)灌胃HLX37發(fā)酵酸奶65 d可顯著降低高膽固醇血癥大鼠血清總膽固醇含量(p<0.05),而將該酸奶滅活后,其降膽固醇效果明顯下降(p<0.05),說(shuō)明HLX37活菌能夠降低高膽固醇血癥大鼠血清膽固醇水平。綜上,HLX37菌株在體內(nèi)外均顯示出良好的降膽固醇活性,具有較大潛力應(yīng)用于功能性發(fā)酵食品的生產(chǎn)中。

植物乳桿菌HLX37,酸奶,降膽固醇活性,酸耐受性,膽鹽耐受性

膽固醇作為必需的細(xì)胞膜物質(zhì),是膽酸合成的前體物質(zhì),在腸道脂滴的形成和吸收過(guò)程中發(fā)揮重要作用[1],但血清膽固醇含量過(guò)高容易誘發(fā)高血壓、冠心病、動(dòng)脈粥樣硬化等心血管疾病,這嚴(yán)重威脅著人類的健康[2]。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì),每年有1700萬(wàn)人死于心血管病,居全球死因之首,到2030年,死于心血管疾病的人數(shù)將達(dá)到每年2300萬(wàn)。研究表明,血清膽固醇含量每降低1%,人類患心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)下降2%[2]。因此,研發(fā)降低血清膽固醇的有效制劑成為當(dāng)前國(guó)內(nèi)外科學(xué)家關(guān)注的熱點(diǎn)。

乳酸菌是指一群能使糖類發(fā)酵產(chǎn)生乳酸的細(xì)菌總稱,其在自然界分布廣泛,從動(dòng)物和人類的口腔到直腸都有該菌的存在。大量研究表明,乳酸菌在體外和體內(nèi)均顯示出良好的降膽固醇活性[3-9],適量飲用含有乳酸菌的發(fā)酵乳可有效降低動(dòng)物血清的膽固醇水平[10]。本課題組前期從福建南平地區(qū)農(nóng)戶自然發(fā)酵的酸乳中獲得1株發(fā)酵性能優(yōu)良的乳酸菌,經(jīng)表型、生理生化和16S rDNA測(cè)序法鑒定為植物乳桿菌,并命名為L(zhǎng)actobacillusplantarumHLX37[11],尚未對(duì)其降膽固醇活性進(jìn)行研究。本文在前期研究工作的基礎(chǔ)上對(duì)HLX37菌株的耐酸耐膽鹽能力和體外降膽固醇活性進(jìn)行研究,并通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)考察HLX37發(fā)酵酸奶(未滅活和滅活兩種形式)對(duì)高膽固醇血癥大鼠的降膽固醇功效,旨在為HLX37功能性發(fā)酵食品的研發(fā)提供理論依據(jù)和實(shí)踐指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

植物乳桿菌HLX37 分離自福建南平地區(qū)農(nóng)戶自然發(fā)酵的酸乳,經(jīng)表型、生理生化和16S rDNA測(cè)序法鑒定為植物乳桿菌,命名為L(zhǎng)actobacillusplantarumHLX37,菌株保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(保藏編號(hào)為CGMCC NO:10632),實(shí)驗(yàn)前菌株在含20%(v/v)甘油的MRS培養(yǎng)基中,-80 ℃凍存;MRS+S培養(yǎng)基 在MRS液體培養(yǎng)基中添加1 g/L牛磺膽酸鈉;MRS+CHOL培養(yǎng)基 在MRS液體培養(yǎng)基中添加0.1 g/L膽固醇;MRS+CHOL+S培養(yǎng)基 在MRS液體培養(yǎng)基中添加0.1 g/L膽固醇和1 g/L?；悄懰徕c;清潔級(jí)健康雄性SD大鼠 體重150～170 g,許可證號(hào):SCXK(滬2007-0005),上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物責(zé)任有限公司;基礎(chǔ)飼料 福建省疾病控制與預(yù)防中心;高脂飼料 配方:56.9%基礎(chǔ)飼料+13%豬油+5%熟花生+2%麻油+20%蔗糖+3%膽固醇+0.1%膽酸鈉,除基礎(chǔ)飼料外的配料均為市售,委托福建省疾病控制與預(yù)防中心制備;膽固醇 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;?；悄懰徕c 上海源葉生物技術(shù)有限公司;巴氏鮮奶 福建長(zhǎng)富集團(tuán)有限公司;大鼠血清甘油三酯(TG)和總膽固醇(TC)試劑盒 南京建成生物工程研究所;冰乙酸、鄰苯二甲醛、硫酸、甲醇、氯仿等 均為分析純。

SW-CJ-1F潔凈工作臺(tái) 蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;GI54DW自動(dòng)高壓滅菌器 廈門致微儀器有限公司;SPX智能型生化培養(yǎng)箱 寧波江南儀器廠;Carry-50型紫外可見光分光光度計(jì) 美國(guó)Varian公司;Neofuge 15R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 香港力康發(fā)展公司;酸奶機(jī) 北京日創(chuàng)電器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 植物乳桿菌HLX37的耐酸耐膽鹽能力測(cè)定 將活化好的菌株制成懸液,取1.0 mL菌懸液分別接種至9.0 mL的 pH為2.0、2.5、3.0或膽鹽濃度為1.0、3.0和5.0 g/L的MRS液體培養(yǎng)基中,37 ℃厭氧培養(yǎng)4 h,分別在0 h和4 h平板計(jì)數(shù)法測(cè)定活菌數(shù),計(jì)算存活率(%)。

存活率(%)=(4 h的活菌數(shù)/0 h的活菌數(shù))×100

1.2.2 植物乳桿菌HLX37體外降膽固醇實(shí)驗(yàn) 菌株于MRS培養(yǎng)基中活化(37 ℃,24 h)3次后,按2%接種量分別接種到MRS、MRS+S、MRS+CHOL和MRS+CHOL+S液體培養(yǎng)基中,立刻取2 mL菌液離心(2000×g,15 min),參照Rudel和Morris的方法[12],測(cè)定各上清液OD560 nm(表示0 h時(shí)各培養(yǎng)基中的膽固醇含量),將各菌液于37 ℃下分別繼續(xù)培養(yǎng)6、12、24和48 h后,取2 mL菌液離心(2000×g,15 min),測(cè)定各上清液OD560 nm(表示6、12、24和48 h時(shí)各培養(yǎng)基中的膽固醇含量),將得到的菌體沉淀,用2 mL的0.1 mol/L磷酸鈉緩沖液(pH為7.0)洗滌沉淀,離心(2000×g,15 min),測(cè)定各上清液OD560 nm(表示沉淀洗滌液中的膽固醇含量);菌體再加入2 mL的0.1 mol/L磷酸鈉緩沖液(pH為7.0),置于超聲波破碎機(jī)中破碎50 s,靜置15 s,重復(fù)該操作15次,離心(2000×g,15 min),測(cè)定各上清液OD560 nm(表示菌體破碎液中膽固醇的含量)。菌株對(duì)培養(yǎng)基中膽固醇的脫除率按下式計(jì)算。

膽固醇脫除率(%)=(1-ODt)/OD0 h×100

式中,OD0 h為0 h時(shí)培養(yǎng)基上清液的OD560 nm(表示0 h時(shí)培養(yǎng)基中的膽固醇含量);ODt為6、12、24或48 h時(shí)培養(yǎng)基上清液的OD560 nm(表示6、12、24、48 h時(shí)培養(yǎng)基中的膽固醇含量)。

1.2.3 HLX37發(fā)酵酸奶制備方法 將巴氏鮮奶與超純水以7∶3比例混合成乳液,灌裝于玻璃瓶中,經(jīng)100 ℃水浴加熱30 min后,冷卻至室溫,置于超凈工作臺(tái),吸取HLX37菌液(菌液濃度2×106CFU/mL,接種體積1%)于上述乳液,充分混勻,經(jīng)37 ℃發(fā)酵12 h,得到HLX37發(fā)酵酸奶,測(cè)得其活菌數(shù)約為2×108CFU/mL。將HLX37發(fā)酵酸奶經(jīng)100 ℃水浴加熱30 min,得到滅活酸奶,測(cè)得活菌數(shù)基本為0。

1.2.4 植物乳桿菌HLX37體內(nèi)降膽固醇實(shí)驗(yàn) 40只清潔級(jí)健康雄性SD大鼠飼養(yǎng)于福建中醫(yī)藥大學(xué)研究室動(dòng)物房獨(dú)立送風(fēng)隔離系統(tǒng)IVC籠具中,室內(nèi)溫度為(24±3) ℃,濕度為50%±10%。動(dòng)物預(yù)飼養(yǎng)基礎(chǔ)飼料一周后,被隨機(jī)分為4組,每組10只,分組情況如表1所示。酸奶的給藥方式為灌胃(劑量:1 mL/100 g體重),每日1次(上午9:00),連續(xù)65 d。在末次給藥后,當(dāng)晚禁食不禁水,于次日上午通過(guò)下腔靜脈取血,分離血清,按試劑盒說(shuō)明書測(cè)定TG、TC含量。

表1 動(dòng)物分組

2 結(jié)果與討論

2.1 植物乳桿菌HLX37的耐酸耐膽鹽能力

已知人體胃部的pH范圍基本在2.0～3.0,微生物隨食物或唾液進(jìn)入胃部以后,大多數(shù)會(huì)被胃酸殺死,只有少數(shù)耐酸的微生物才能存活下來(lái)進(jìn)入小腸。小腸是人體膽固醇

表2 植物乳桿菌HLX37的耐酸耐膽鹽能力

合成和吸收的重要場(chǎng)所,同時(shí)也是乳酸菌發(fā)揮其降膽固醇作用的主要部位,但腸道內(nèi)的膽鹽(濃度范圍0.3～3 g/L)對(duì)微生物的生長(zhǎng)也具有一定的抑制作用。因此,乳酸菌要在體內(nèi)發(fā)揮降膽固醇功效,要求其能夠耐受胃腸道的低pH和小腸中的膽汁鹽等逆境。本研究對(duì)HLX37菌株的耐酸耐膽鹽能力進(jìn)行考察,結(jié)果顯示,HLX37菌株在pH為2.0時(shí)基本不能生長(zhǎng),而在pH為2.5或3.0時(shí)能夠生長(zhǎng),且其4 h存活率達(dá)到50%以上,分別為56.8%±5.7%和59.1%±4.8%(表2)。同時(shí),HLX37菌株在1.0、3.0和5.0 g/L膽鹽濃度下的4 h存活率分別達(dá)79.7%±6.2%、48.2%±4.9%和3.9%±0.6%(表2)。目前,雖有不少研究者成功篩選出具有降膽固醇活性的植物乳桿菌,但不同實(shí)驗(yàn)條件下所獲菌株的耐酸耐膽鹽活性存在一定的差異。例如,靳志強(qiáng)等[13]從開菲爾粒(Kefir grains)發(fā)酵乳飲料中分離到一株具有降膽固醇作用的植物乳桿菌H13,發(fā)現(xiàn)其在pH為3.0條件下的2 h存活率在10%左右,4 h存活率在1%左右,而Huang等[3]從西藏開菲爾粒發(fā)酵乳中分離得到的膽固醇降解菌(植物乳桿菌Lp27)在pH為3.0條件下的4 h存活率接近90%,在3.0 g/L膽鹽濃度下的4 h存活率在30%左右。Hou等[14]從奶酪、泡菜和酸奶中分離得到若干株具有降膽固醇活性的植物乳桿菌(GL-03、GL-AA、GL-02、ZP-W、ZP-05、ZP-Z、ZP-04、YS-09和YS-11),發(fā)現(xiàn)它們?cè)?.0 g/L膽鹽濃度下的6 h存活率均在68%以上。本研究中,HLX37菌株在pH為3.0條件下的4 h存活率接近60%,在3.0 g/L膽鹽濃度下的4 h存活率接近50%。與上述植物乳桿菌相比,HLX37菌株顯示出不錯(cuò)的耐酸耐膽鹽能力,說(shuō)明其能夠順利通過(guò)胃酸環(huán)境到達(dá)腸內(nèi)并在腸內(nèi)存活。

2.2 植物乳桿菌HLX37的體外降膽固醇能力

2.2.1 植物乳桿菌HLX37對(duì)不同培養(yǎng)基中膽固醇的降解能力 在評(píng)價(jià)乳酸菌體外降膽固醇活性的實(shí)驗(yàn)中,目前大部分學(xué)者主要研究乳酸菌對(duì)MRS培養(yǎng)基中外源添加的膽固醇的降解作用,較少考察菌株對(duì)MRS培養(yǎng)基自身膽固醇的脫除作用。本研究同時(shí)考察了HLX37菌株對(duì)MRS、MRS+S、MRS+CHOL和MRS+CHOL+S培養(yǎng)基中膽固醇的降解能力,結(jié)果如圖1所示。由圖1可看出,HLX37菌株對(duì)各培養(yǎng)基中的膽固醇均具有降解作用,且隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),菌株對(duì)膽固醇的脫除率逐漸升高。與膽固醇含量較低的培養(yǎng)基(MRS或MRS+S)相比,菌株對(duì)MRS+CHOL和MRS+CHOL+S培養(yǎng)基中膽固醇的降解能力明顯更高,說(shuō)明培養(yǎng)基的膽固醇濃度會(huì)影響菌株對(duì)膽固醇的脫除能力,且在一定范圍內(nèi)培養(yǎng)基中的膽固醇含量更高,菌株對(duì)膽固醇的降解效果更好。此外,實(shí)驗(yàn)結(jié)果還發(fā)現(xiàn),添加膽鹽可促進(jìn)菌株對(duì)MRS或MRS+CHOL培養(yǎng)基中膽固醇的降解(菌株對(duì)MRS+S中的膽固醇降解率高于MRS,對(duì)MRS+CHOL+S中的膽固醇降解率高于MRS+CHOL)。當(dāng)HLX37菌株與MRS+CHOL和MRS+CHOL+S培養(yǎng)基共孵育48 h后,其對(duì)膽固醇的降解率分別達(dá)39.05%±2.94%和44.72%±2.74%(圖1),說(shuō)明該菌株在體外具有很強(qiáng)的降膽固醇能力。

圖1 植物乳桿菌HLX37對(duì)不同培養(yǎng)基中膽固醇的降解能力Fig.1 Cholesterol removal by Lactobacillus plantarum HLX37 in different mediums注:MRS+S培養(yǎng)基(添加1 g/L?；悄懰徕c);MRS+CHOL(添加0.1 g/L膽固醇);MRS+CHOL+S培養(yǎng)基(添加0.1 g/L膽固醇和1 g/L?；悄懰徕c)。

2.2.2 不同介質(zhì)中膽固醇的分布比例 關(guān)于乳酸菌體外降膽固醇的作用機(jī)制至今尚無(wú)定論,主要有兩種觀點(diǎn)。第一種觀點(diǎn)為共沉淀作用[15]:有些乳酸菌含有膽鹽水解酶,可將共軛態(tài)的膽鹽水解為膽酸和氨基酸殘基,由于膽酸在pH低于5時(shí)很難溶解,膽固醇和游離態(tài)的膽酸共沉淀,從而降低膽固醇含量。第二種觀點(diǎn)為吸收和吸附作用[16-17]:乳酸菌不僅可以直接吸收膽固醇,還可將膽固醇吸附到菌體細(xì)胞表面。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),HLX37菌株對(duì)添加膽鹽培養(yǎng)基中的膽固醇表現(xiàn)出更強(qiáng)的降解作用(圖2),說(shuō)明添加膽鹽對(duì)菌株的降膽固醇能力起促進(jìn)作用,因此推測(cè)共沉淀作用可能是HLX37菌株降解膽固醇的機(jī)制之一。進(jìn)一步對(duì)不同培養(yǎng)時(shí)間下培養(yǎng)基內(nèi)不同介質(zhì)(上清液、沉淀洗滌液和菌體破碎液)中的膽固醇比例進(jìn)行計(jì)算,結(jié)果如圖2所示。由圖2可看出,隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加,上清液中膽固醇含量逐漸降低,相應(yīng)沉淀中的膽固醇含量變化不大,而菌體細(xì)胞中的膽固醇含量則呈逐漸增加趨勢(shì)。說(shuō)明HLX37菌株對(duì)膽固醇具有一定的吸收作用。綜合以上結(jié)果,本研究推測(cè)HLX37菌株的體外降膽固醇作用可能與共沉淀作用和菌體吸收均有一定的關(guān)系。

圖2 膽固醇在不同培養(yǎng)基中上清液、沉淀和菌體細(xì)胞內(nèi)的分布比例Fig.2 Percentage of cholesterol in supernatant,deposit and cells注:A:MRS培養(yǎng)基;B:MRS+S培養(yǎng)基(添加1 g/L牛磺膽酸鈉);C:MRS+CHOL(添加0.1 g/L膽固醇);D:MRS+CHOL+S培養(yǎng)基(添加0.1 g/L膽固醇和1 g/L?；悄懰徕c)。

2.3 植物乳桿菌HLX37的體內(nèi)降膽固醇能力

簡(jiǎn)單通過(guò)體外模型而缺乏實(shí)際的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)觀察,還是未能明確HLX37菌株是否具有降膽固醇能力。本研究進(jìn)一步采用整體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)考察了HLX37菌株對(duì)高膽固醇血癥大鼠血清膽固醇的調(diào)節(jié)作用,結(jié)果見表3?？梢钥闯?與正常對(duì)照組相比,高脂模型組大鼠血清TG和TC含量均較高,其中TC含量較正常組高出55.8%,差異顯著(p<0.05),說(shuō)明高膽固醇血癥大鼠造模成功。與高脂模型組相比,酸奶組和滅活酸奶組大鼠血清TG含量有所下降,但差異均不顯著(p>0.05);酸奶組大鼠血清TC含量顯著下降(p<0.05),下降幅度達(dá)23.3%,而滅活酸奶組大鼠血清TC含量?jī)H是略微下降,且差異不顯著(p>0.05),說(shuō)明發(fā)揮降膽固醇作用的主要成分為HLX37活菌本身。同時(shí),實(shí)驗(yàn)結(jié)果還發(fā)現(xiàn),酸奶組大鼠血清TC含量與正常對(duì)照組相比差異不顯著(p>0.05),說(shuō)明HLX37菌株對(duì)高脂飲食喂養(yǎng)大鼠血清膽固醇的下調(diào)作用較為突出,基本能夠?qū)⑵浠謴?fù)至正常水平。

表3 各組大鼠血清TG和TC含量

注:同一列中不同字母表示差異顯著(p<0.05)。

3 結(jié)論

本研究結(jié)果表明,從福建南平地區(qū)農(nóng)戶自然發(fā)酵的酸乳中分離得到的植物乳桿菌HLX37具有較強(qiáng)的耐酸耐膽鹽能力,在pH為3.0和膽鹽濃度為3.0 g/L環(huán)境下培養(yǎng)4 h的存活率分別為59.1%±4.8%和48.2%±4.9%。在體內(nèi)外均顯示出良好的降膽固醇活性,對(duì)添加膽鹽的MRS+CHOL培養(yǎng)基中膽固醇24 h和48 h降解率分別達(dá)37.33%±2.55%和44.72%±2.74%;連續(xù)灌胃HLX37發(fā)酵酸奶65 d可顯著降低高膽固醇血癥大鼠血清總膽固醇含量(p<0.05),而將該酸奶滅活后,其降膽固醇效果明顯下降(p<0.05),說(shuō)明HLX37活菌能夠降低高膽固醇血癥大鼠血清膽固醇水平。鑒于微生物降膽固醇方法具有高效、安全、成本低等特點(diǎn),本研究認(rèn)為該菌株具有較大潛力應(yīng)用于功能性發(fā)酵食品的生產(chǎn)中。

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Cholesterol-lowering activity ofLactobacillusplantarumHLX37:invitroandinvivostudies

LIN Bin,HUANG Ju-qing,GUAN Xue-fang,ZHENG Yi,XU Qing-xian,QIAN Lei

(Institute of Agricultural Engineering and Technology,Fujian Academy of Agricultural Sciences,Fuzhou 350003,China)

LactobacillusplantarumHLX37 is a new lactic acid bacteria strain isolated from the naturally fermented yogurt prepared by local dairy farmer in Nanping City(Fujian,China). In this paper,the tolerance capacity of HLX37 to acid or bile salt stresses and its cholesterol-lowering activity bothinvitroandinvivowere investigated. The result ofinvitrostudy showed that HLX37 could survive after 4 h of incubation in MRS medium at pH3.0 or 3.0 g/L of bile salt,with the survival rates being 59.1%±4.8% and 48.2%±4.9%,respectively. HLX37 could reduce the cholesterol content by 37.33%±2.55% and 44.72%±2.74% after 24 h and 48 h of incubations in MRS medium supplemented with cholesterol and bile salt. Theinvivoexperiment demonstrated that intragastric administration of HLX37-fermented yogurt for consecutive 65 days could significantly decrease the serum level of total cholesterol in hypercholesterolaemic rats(p<0.05),while the heat-inactivated HLX37-fermented yogurt did not possess the ability. This indicated that only the active HLX37 strain had the capacity to lower serum cholesterol in hypercholesterolemic rats. In conclusion,HLX37 exhibited a good cholesterol-lowering activity bothinvitroandinvivo,it may have great potentiality to be applied in the production of functional fermented foods.

LactobacillusplantarumHLX37;yogurt;cholesterol-lowering activity;acid resistance;bile resistance

2016-02-17

林斌(1964-)，男，博士，研究員，主要從事微生物方面的研究，E-mail：linbin591@126.com。

福建自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2013J01103)；福建省財(cái)政廳教育科研專項(xiàng)(閩財(cái)指[2014]0680號(hào))。

TS252.5

A

1002-0306(2016)20-0000-00

10.13386/j.issn1002-0306.2016.20.000