朱振元,賈長英,孫會輕

(天津科技大學食品工程與生物技術(shù)學院,天津 300457)

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蛹蟲草發(fā)酵大米的成分分析及體外抗氧化活性研究

朱振元,賈長英,孫會輕

(天津科技大學食品工程與生物技術(shù)學院,天津 300457)

蟲草米,水溶性非淀粉多糖,體外抗氧化,清除自由基

蛹蟲草(Cordycepsmilitaris)又名北冬蟲夏草,是我國傳統(tǒng)的中藥材之一。屬子囊菌門、子囊菌綱、肉座菌目、麥角菌科、蟲草屬[1]。蛹蟲草有蟲草素[2]、蟲草酸[3]、蟲草多糖、超氧化物歧化酶(SOD)[4]等多種活性物質(zhì),具有延緩衰老[5]、抗腫瘤[6]、提高免疫力[7]、改善腎臟功能等作用。從2009年開始,蛹蟲草被批準成為新資源食品進而被廣泛應(yīng)用于功能食品的研發(fā)[8],如蛹蟲草保健黃酒[9]、蛹蟲草保健茶飲料[10]、蛹蟲草功能性醬油[11]等。樸美子等[12]研究發(fā)酵蟲草米,即利用固態(tài)發(fā)酵技術(shù),將蟲草菌絲體加入大米,經(jīng)發(fā)酵得到含有蟲草功能性成分的蟲草米,并證明其具有一定免疫活性。但已有研究中對于蟲草米是否具有其它活性未有報道。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大米 市售;蛹蟲草菌株 實驗室保存;甘露醇、蟲草素、DPPH、三羥甲基氨基甲烷(Tris)均為分析純,購于sigma公司;高碘酸鈉、乙酸胺、冰醋酸、乙酰丙酮、L-鼠李糖、鐵氰化鉀、三氯乙酸、氯化鐵、硫酸亞鐵、水楊酸、雙氧水、鄰苯三酚、無水乙醇等試劑 均為分析純,購于天津北方天醫(yī)化學試劑廠。

GHX-9160B-1型隔水式恒溫培養(yǎng)箱 上海?，攲嶒炘O(shè)備有限公司;LS-B50L型立式壓力蒸汽滅菌器 上海華線醫(yī)用核子儀器有限公司;超凈工作臺 蘇凈集團安泰公司;ESJ2054型電子分析天平 沈陽龍騰電子稱量儀器有限公司;KQ-400KDB超聲波清洗儀 昆山市超聲儀器有限公司;TDL-5-A離心機 上海安亭科學儀器公司;Agilent 1260型高效液相色譜儀 美國安捷倫公司;SP-2102紫外分光光度計 上海光譜儀器有限公司。

1.2 蛹蟲草液體培養(yǎng)基的制備

液體培養(yǎng)基:葡萄糖4%,蛋白胨1%,KH2PO40.1%,MgSO40.1%,121 ℃滅菌25 min,備用;在無菌操作臺上,用接種針取1 mm2大小的蛹蟲草菌置于液體培養(yǎng)基,培養(yǎng)溫度25 ℃,搖床轉(zhuǎn)速150 r/min培養(yǎng)3 d。

1.3 大米發(fā)酵培養(yǎng)

取30 g大米裝入三角瓶,以料液比1∶1.2加水,121 ℃,滅菌25 min得大米培養(yǎng)基,以20 mL/100 g接種量加種子液,攪拌均勻,于22 ℃黑暗發(fā)酵9 d,再經(jīng)過光照轉(zhuǎn)色,每天光照12 h,一周后干燥處理。

1.4 營養(yǎng)和功能性成分測定

1.4.1 蟲草米中蟲草素含量測定 取蟲草米粉0.50 g,溶于30 mL蒸餾水中,超聲提取30 min,4000 r/min離心10 min,取上清液于50 ℃條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)1 h得待測樣。采用高效液相色譜法測定蟲草素含量[13]。

1.4.2 蟲草米中蟲草酸含量測定 取蟲草米粉0.50 g,置于50 mL三角燒瓶中,加25 mL蒸餾水,80 ℃水浴1 h,離心,將上清液轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中,殘渣重復(fù)提取一次,定容,備用。采用比色法測定蟲草酸含量[14]。

1.4.3 水溶性非淀粉多糖(SNSP)含量測定 蟲草米粉碎,按料液比1∶20加蒸餾水,80 ℃水浴2 h,4000 r/min離心10 min,收集上清液,重復(fù)三次,合并提取液,濃縮,得蟲草米提取液;以同種方法得普通大米提取液。

分別在蟲草米、大米提取液中加入50 IU/gα-淀粉酶,于95 ℃酶解15 min后冷卻至60 ℃,再按100 IU/g的添加量添加糖化酶,于60 ℃保溫1 h后冷卻、定容并離心。上清液加入5倍體積的無水乙醇,于4 ℃靜置過夜后離心,得到的沉淀用80%乙醇洗滌,重復(fù)3次。待揮干試劑后,沉淀用蒸餾水(50±1) ℃溶解,定容,得多糖溶液。采用苯酚-硫酸法測定多糖含量,以葡萄糖為標準(用0.9的系數(shù)校正)[15]。

1.4.4 淀粉含量測定 參照GB/T 5009.9-2008食品中淀粉的測定酶水解法。

1.5 抗氧化活性測定

1.5.1 樣品處理 蟲草米粉碎,按料液比1∶20加蒸餾水,60 ℃超聲2 h,提取三次,合并提取液,濃縮,得到濃度分別為1、2、3、4、5 mg/mL蟲草米提取液;以同種方法得普通大米提取液。

1.5.2 還原能力的測定 本實驗參考Oyaizu方法[16]并稍改動。將1 mL樣品加入到pH為6.6的2.5 mL磷酸緩沖液(0.2 mol·L-1)中,加質(zhì)量分數(shù)為1%的鐵氰化鉀溶液2.5 mL,混合物于50 ℃水浴20 min。然后加入質(zhì)量分數(shù)為10%的三氯乙酸2.5 mL,混合物4000 r·min-1離心10 min,吸取2.5 mL上清液,加入2.5 mL蒸餾水,再加入0.5 mL質(zhì)量分數(shù)為0.1%的氯化鐵溶液,混勻靜置10 min,以VC為陽性對照,在700 nm波長下測吸光度,以吸光度表示還原能力。

式中:A0為空白對照液的吸光值;Ax為樣品液吸光值。

1.5.4 羥自由基(·OH)清除率測定 由Fenton法產(chǎn)生·OH[18]。在試管中依次加入9 mmol·L-1FeSO42 mL,9 mmol·L-1水楊酸-乙醇溶液2 mL,待測液2 mL,8.8 mmol·L-1H2O22 mL,其中H2O2啟動整個反應(yīng)。37 ℃反應(yīng)30 min后,以蒸餾水為空白調(diào)零,在510 nm處測樣品吸光度,以維生素C做陽性對照,同時設(shè)空白對照。

式中:Ax為樣品液清除自由基吸光值;A0為空白對照的吸光值;Ax0為不加水楊酸時提取液自身的吸光度。

1.5.5 DPPH·清除率測定 采用Chen等的方法[19]并稍改動。取樣品液2 mL,加入2 mL 0.2 mmol·L-1的DPPH-乙醇溶液,室溫避光反應(yīng)30 min,在517 nm下測吸光度。同時測定2 mL DPPH溶液與2 mL溶劑混合后測定的吸光值A(chǔ)c及2 mL樣品與2 mL無水乙醇混合后的吸光值A(chǔ)b。

1.6 數(shù)據(jù)處理

每個實驗3次重復(fù),數(shù)據(jù)以平均值±標準差表示。采用SPSS17.0軟件對數(shù)據(jù)進行方差分析,差異顯著水平為p<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 蟲草固態(tài)發(fā)酵米形態(tài)

由圖1可知,接種蛹蟲草菌的大米培養(yǎng)基,在黑暗條件下培養(yǎng)7～8 d,白色菌絲布滿大米培養(yǎng)基,光照后,大米從白色逐漸轉(zhuǎn)成橘紅色。干燥處理后,得到色澤均勻,顆粒從外到內(nèi)皆呈橘紅色的蟲草米。干燥后稱重,每100 g大米經(jīng)蟲草菌發(fā)酵可得70.57 g蟲草米。

圖1 蟲草米干燥前后圖Fig.1 Appearance of Cordyceps militaris rice before and after drying

2.2 蟲草菌發(fā)酵前后大米成分變化

表1 蟲草米、普通大米營養(yǎng)成分比較(干基)

注:-代表未檢出。

由表1可以看出,經(jīng)蛹蟲草菌發(fā)酵大米后得到的蟲草米含有蟲草特有的功能性成分蟲草酸、蟲草素,且含量分別為18.07、8.76 mg/g。未經(jīng)蟲草菌發(fā)酵的普通大米淀粉含量高達70.43%,水溶性非淀粉多糖(SNSP)含量只有0.80%,而發(fā)酵后的蟲草米中淀粉含量降低到40.43%,SNSP含量明顯提高,達到8.39%。說明蟲草菌在固態(tài)發(fā)酵條件下可有效的利用并降解大米中的淀粉,以致蟲草米中淀粉含量大大降低,SNSP含量顯著升高,提高了大米淀粉的消化吸收率和營養(yǎng)價值[20]。

2.3 蟲草米的還原能力

還原力的強弱是測定物質(zhì)抗氧化性的重要指標。由圖2可知,蟲草米與普通大米提取液隨著濃度增加還原能力逐漸增強,雖然前者的還原能力始終高于后者,但和維生素C相比,還原能力仍有顯著差異。濃度為3 mg/mL時,蟲草米提取液、普通大米提取液的吸光度值分別為0.293、0.140,當濃度高于3 mg/mL時,蟲草米提取液的還原能力顯著(p<0.05)高于普通大米提取液的還原能力。蟲草米中SNSP含量的增加可能與其還原能力的增強有關(guān)。

圖2 VC、蟲草米、普通大米還原能力Fig.2 Reducing power of VC,Cordyceps militaris rice and ordinary rice

圖3 VC、蟲草米、普通大米對·的清除效果Fig.3 Scavenging activities of VC,Cordyceps militaris riceand ordinary rice against superoxide anion free radicals

2.5 蟲草米對·OH的清除能力

羥自由基是目前所知活性氧中對生物體毒性最強,危害最大的一種自由基[22]。對羥基自由基的清除能力也是物質(zhì)抗氧化的重要指標之一。如圖4所示,普通大米提取液對·OH的清除能力隨著濃度的增加幾乎沒有變化,但是蟲草米提取液對·OH的清除能力隨濃度的增加緩慢上升,且與提取液濃度呈正相關(guān)。提取液濃度為5 mg/mL時,蟲草米提取液、普通大米提取液對·OH的清除率分別為38%、14.5%,蟲草米提取液對·OH的清除能力顯著(p<0.05)高于普通大米。

圖4 VC、蟲草米、普通大米對·OH的清除效果Fig.4 Scavenging activities of VC,Cordyceps militaris rice and ordinary rice against hydroxyl free radicals

2.6 蟲草米對DPPH自由基的清除能力

DPPH·在有機溶劑中是一種很穩(wěn)定的自由基,廣泛用于抗氧化劑評價體系中[23]。如圖5所示,與VC標準液對DPPH·的清除能力不同,蟲草米提取液和普通大米提取液對DPPH·的清除率與濃度之間存在明顯量效關(guān)系。隨著蟲草米及大米提取液濃度的增加,清除率增加很明顯,且前者對DPPH·的清除能力始終顯著(p<0.05)高于后者。提取液濃度為5 mg/mL時,蟲草米提取液、普通大米提取液對DPPH·的清除率分別為79.1%、30.10%,說明蟲草米提取液對DPPH·有較好的清除能力。

圖5 VC、蟲草米、普通大米對DPPH自由基的清除效果Fig.5 Scavenging activities of VC,Cordyceps militaris riceand ordinary rice against DPPH free radicals

3 結(jié)論

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Study on compositions and antioxidant activities of fermented rice byCordycepsmilitaris

ZHU Zhen-yuan,JIA Chang-ying,SUN Hui-qing

(College of Food Engineering and Biotechnology,Tianjin University of Science and Technology,Tianjin 300457,China)

Cordycepsmilitarisrice;SNSP;antioxidationinvitro;scavenging free radical

2016-04-11

朱振元(1969-),男,博士,教授,研究方向:生物資源與功能食品,E-mail:zhyuanzhu@tust.edu.cn。

國家星火計劃重點項目(2015GA610001);天津市東麗區(qū)科技型中小企業(yè)發(fā)展專項基金產(chǎn)學研合作項目。

TS218

A

1002-0306(2016)20-0000-00

10.13386/j.issn1002-0306.2016.20.000