初 眾,胡美杰,徐 飛,譚樂和,趙 晶,張彥軍

(1.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院香料飲料研究所,海南萬寧 571533;2.黑龍江東方學(xué)院食品與環(huán)境工程學(xué)部,黑龍江哈爾濱 150086)

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響應(yīng)面法優(yōu)化酶法提取菠蘿蜜種子淀粉工藝

初 眾,胡美杰,徐 飛,譚樂和,趙 晶,張彥軍

(1.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院香料飲料研究所,海南萬寧 571533;2.黑龍江東方學(xué)院食品與環(huán)境工程學(xué)部,黑龍江哈爾濱 150086)

為確定酶法提取菠蘿蜜種子淀粉的最佳工藝條件,在單因素實驗的基礎(chǔ)上,選擇時間、溫度、料液比、加酶量為影響因素,以淀粉得率為響應(yīng)指標(biāo),利用中心組合實驗進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化實驗。結(jié)果表明,最佳提取工藝參數(shù)為:提取時間8 h,提取溫度62 ℃,液料比4∶1 mL/g,加酶量0.10%。菠蘿蜜種子淀粉提取率理論值為60.02%,實際驗證值為61.83%。擬合得到的模型與實際吻合良好,建立的提取工藝條件穩(wěn)定,為菠蘿蜜種子淀粉的工業(yè)化生產(chǎn)提供了理論依據(jù)。

菠蘿蜜種子,淀粉,響應(yīng)面法

菠蘿蜜(ArtocarpusheterophyllusLam)屬桑木本糧食作物。菠蘿蜜在世界上主要分布于東南亞國家,而國內(nèi)主要分布在廣東、廣西、海南、云南、福建和四川,其中以海南省種植最多[1]。中國菠蘿蜜種植面積1萬公頃左右。其中海南省菠蘿蜜種植面積0.66萬公頃左右,廣東省種植面積0.3萬公頃左右,其它省區(qū)多為零散種植,年產(chǎn)量約12萬噸[2-3]。

種子約占整個菠蘿蜜體積的1/3,呈橢圓形,大如板栗,其富含淀粉,約占干重的52%～58%,是有待開發(fā)利用的淀粉資源。果肉食用后剩下的種子被丟棄,無疑是淀粉資源的浪費[4]。目前關(guān)于菠蘿蜜種子淀粉的相關(guān)研究主要集中于其特性的研究[5-7],菠蘿蜜種子淀粉高效制備工藝的優(yōu)化研究未見報道。

響應(yīng)面法是利用合理的實驗設(shè)計,采用多元二次回歸方程擬合因素與響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系,通過對回歸方程的分析尋求最佳工藝參數(shù),解決多變量問題的一種統(tǒng)計方法[8]。它是數(shù)學(xué)方法與統(tǒng)計方法的相結(jié)合。RSM的主要優(yōu)點是它減少評估多個參數(shù)和它們之間的相互作用所需要的實驗的次數(shù),響應(yīng)面使得參數(shù)間的交互作用通過有限次實驗來評估成為可能[9-10]。

本課題前期實驗發(fā)現(xiàn)酶法制備菠蘿蜜種子淀粉中蛋白質(zhì)殘留量低。因此在前期實驗基礎(chǔ)上采用酶法提取菠蘿蜜種子淀粉。在單因素的基礎(chǔ)上采用響應(yīng)面法設(shè)計實驗對提取條件進(jìn)行優(yōu)化,以期獲得經(jīng)濟(jì)、科學(xué)的提取工藝條件。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

菠蘿蜜種子 由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院香料飲料研究所提供(馬來西亞Ⅰ號);Protex-7L(P7酶活200000 U/g)Novozyme公司;其它試劑 均為分析純。

NDA701杜馬斯定氮儀 意大利VELP;DK-98-II電子調(diào)溫電爐 天津泰斯特儀器有限公司;AL104電子天平、MB45快速水分測定儀 梅特勒-托利多儀器有限公司;Scientz-18ND冷凍干燥機 寧波新芝生物科技股份有限公司;DHG-9625A電熱鼓風(fēng)干燥箱 上海—恒科學(xué)儀器有限公司;HHS-8S電熱恒溫水浴鍋 上海宜昌儀器紗篩廠;1024數(shù)顯恒溫水浴振蕩器 丹麥福斯;DLSB-5L/10低溫冷卻循環(huán)泵 鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司;SHB-ⅢS循環(huán)水式多用真空泵 鄭州長城科工貿(mào)有限公司;LXJ-IIB離心機 上海安亭科學(xué)儀器廠;80膠體磨 上?？苿跈C械廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 菠蘿蜜種子粉的制備 將新鮮的菠蘿蜜種子放入電熱鼓風(fēng)干燥箱內(nèi)烘干1.5 h,外皮略干內(nèi)皮濕潤時快速去皮,種子水洗后先用多功能磨漿機進(jìn)行粗磨,再用膠體磨研磨2 min。將漿液進(jìn)行抽濾,然后將沉淀真空冷凍干燥(冷井預(yù)冷30 min,然后將預(yù)凍好的淀粉(-40 ℃,3 h)放入冷凍干燥機中,抽真空至40 Pa以下,分2段。30 min升溫到0 ℃,保持1 h,再30 min升溫到50 ℃,保持10 h)。得到菠蘿蜜種子粉。

1.2.2 菠蘿蜜種子淀粉提取率的測定 菠蘿蜜種子淀粉提取率(%)=每克菠蘿蜜種子粉提取得到的淀粉質(zhì)量(干基)/每克菠蘿蜜種子中淀粉含量(干基)×100。

1.2.3 單因素實驗

1.2.3.1 溫度對酶法提取菠蘿蜜種子淀粉的影響 蒸餾水與菠蘿蜜種子粉以4∶1的比例混合,加入0.100%中性蛋白酶P7,置于恒溫水浴搖床上反應(yīng)8 h,溫度分別設(shè)置為40、50、60、70、80 ℃,反應(yīng)結(jié)束后過200目篩,濾渣在水洗過濾兩次,合并濾液離心(3000 r/min,5 min),刮去沉淀物上層褐色皮,沉淀水洗多次。將沉淀真空冷凍干燥(冷凍干燥條件如上),得到菠蘿蜜種子淀粉。

1.2.3.2 時間對酶法提取菠蘿蜜種子淀粉的影響 蒸餾水與菠蘿蜜種子粉以4∶1的比例混合,加入0.100%中性蛋白酶P7,置于恒溫水浴搖床上反應(yīng)8 h,溫度為60 ℃,反應(yīng)時間分別設(shè)置為4、6、8、10、12 h,相同操作如1.2.3.1,得到菠蘿蜜種子淀粉。

1.2.3.3 液料比對酶法提取菠蘿蜜種子淀粉的影響 蒸餾水與菠蘿蜜種子粉以4∶1的比例混合,加入0.100%中性蛋白酶P7,置于恒溫水浴搖床上反應(yīng)8 h,溫度為60 ℃,液料比分別設(shè)置為2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1 mL/g,相同操作如1.2.3.1,得到菠蘿蜜種子淀粉。

1.2.3.4 加酶量對菠蘿蜜種子淀粉提取率的影響 蒸餾水與菠蘿蜜種子粉以4∶1的比例混合,加酶量分別設(shè)置為0.050%、0.075%、0.100%、0.0125%、0.150%,置于恒溫水浴搖床上反應(yīng)8 h,溫度為60 ℃,相同操作如1.2.3.1,得到菠蘿蜜種子淀粉。

1.2.4 響應(yīng)面優(yōu)化實驗 在單因素實驗的基礎(chǔ)上,以時間、溫度、液料比、加酶量為自變量,進(jìn)行四因素五水平中心組合實驗設(shè)計。以菠蘿蜜種子淀粉提取率作為響應(yīng)值,利用Design-Expert 8.0.6軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,得出最佳的酶法提取菠蘿蜜種子淀粉工藝條件。實驗因素與水平編碼值見表1。

表1 實驗因素與水平編碼值

1.2.4 理化指標(biāo)的測定 水分含量的測定:快速水分測定儀;菠蘿蜜種子中淀粉含量的測定:GB/T 20378-2006淀粉含量測定[11];蛋白質(zhì)含量的測定:杜馬斯燃燒定氮儀[12];脂類含量的測定:索氏抽提法,GB/T 22427.3-2008淀粉總脂肪測定[13];灰分含量的測定:GB/T 22427.1-2008淀粉灰分測定[14]

1.2.5 統(tǒng)計分析 利用SPSS 21.0軟件計算和分析數(shù)據(jù)中的平均值、標(biāo)準(zhǔn)偏差和顯著性差異。顯著性差異達(dá)到95%的置信水平才會被考慮。所有數(shù)據(jù)均為三次實驗的平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 溫度對菠蘿蜜種子淀粉提取率的影響 不同溫度提取菠蘿蜜種子淀粉的結(jié)果見圖1。溫度對菠蘿蜜種子淀粉的提取率有明顯影響。溫度從40 ℃升高到60 ℃,菠蘿蜜種子淀粉的提取率逐漸上升。溫度繼續(xù)升高,菠蘿蜜種子淀粉的提取率呈下降趨勢。當(dāng)溫度控制在60 ℃時提取率達(dá)到最大值,其淀粉提取率為51.270%。且其效果明顯高于在其他溫度下所測得的菠蘿蜜種子淀粉的提取率。溫度是影響酶活得一個重要因素。產(chǎn)生這種變化原因可能是因為低于酶最適溫度時,酶活性受到抑制,溫度升高,酶反應(yīng)速度加快,而當(dāng)溫度再升高至超過酶的最適溫度時,蛋白酶逐漸開始變性,部分失去活性,降低了酶反應(yīng)速度[15],結(jié)果導(dǎo)致了蛋白質(zhì)酶解不完全,淀粉的提取率降低。綜合考慮酶特性及經(jīng)濟(jì)等因素,因此確定最適酶解溫度為60 ℃。

圖1 溫度對菠蘿蜜種子淀粉提取率的影響Fig.1 Effects of temperature on extractability of jackfruit seeds starch

2.1.2 時間對菠蘿蜜種子淀粉提取率的影響 不同時間提取菠蘿蜜種子淀粉的結(jié)果見圖2。隨著酶解時間的延長,菠蘿蜜種子淀粉的提取率顯著增加。8 h后,提取率趨于穩(wěn)定。隨著酶解時間延長,堿性蛋白酶使包繞淀粉的蛋白質(zhì)充分溶解,蛋白質(zhì)與淀粉不斷分離,從而提高菠蘿蜜種子淀粉的提取率,當(dāng)達(dá)到一定浸泡時間后,蛋白質(zhì)大部分被降解,與蛋白質(zhì)結(jié)合的淀粉幾乎全部被分離而提取出來,因而提取率趨于平穩(wěn),幾乎不再變化。即使再延長時間,淀粉提取率也不會再有較大變化,而且長時間的浸泡容易導(dǎo)致酶失活,同時淀粉顆粒的結(jié)構(gòu)變得疏松,而且漿水中微生物的活動也加劇,這些因素可能會對淀粉的提取率產(chǎn)生影響[16]。由于從8 h后趨于穩(wěn)定,綜合考慮產(chǎn)品成本等因素,提取時間應(yīng)選擇在8 h。

圖2 時間對菠蘿蜜種子淀粉提取率的影響Fig.2 Effects of time on extractability of jackfruit seeds starch

2.1.3 液料比對菠蘿蜜種子淀粉提取率的影響 不同提取菠蘿蜜種子淀粉的結(jié)果見圖3。隨著溶液中水量的增加,菠蘿蜜種子淀粉的提取率逐漸上升。料液比在4∶1時淀粉提取率最高為55.550%,繼續(xù)加水,淀粉提取率呈逐漸降低趨勢。溶液體積較小時,這可能是因為由于含水量低,底物與酶接觸不充分,導(dǎo)致得率較低;隨著含水量增加,底物與酶作用充分;繼續(xù)增加水量而底物含量不變,酶與底物的結(jié)合機率下降,使提取率減小[17]。綜合考慮產(chǎn)品成本等因素,因此確定液料比為4∶1。

圖3 液料比對菠蘿蜜種子淀粉提取率的影響Fig.3 Effects of water to jackfruit seeds starch ratio on extractability of jackfruit seeds starch

2.1.4 加酶量對菠蘿蜜種子淀粉提取率的影響 不同加酶量提取菠蘿蜜種子淀粉的結(jié)果見圖4。在一定范圍內(nèi),菠蘿蜜種子淀粉的提取率隨著酶用量的增加而升高,當(dāng)酶用量為0.100%時,提取率最高,之后增加中性蛋白酶的用量,提取率反而開始下降?？赡艿脑蚴钱?dāng)酶濃度較低時,隨著酶用量的升高,酶與底物的接觸面積增大,有助于蛋白質(zhì)的酶解,菠蘿蜜種子淀粉提取率提高。但當(dāng)酶濃度達(dá)到過飽和時,酶與底物產(chǎn)生競爭,對蛋白酶產(chǎn)生一定的抑制作用,一部分酶分子沒有與底物接觸的機會,導(dǎo)致蛋白質(zhì)酶解率降低,淀粉提取率下降[18]。因此,選擇加酶量0.100%為宜。

圖4 加酶量對菠蘿蜜種子淀粉提取率的影響Fig.4 Effects of enzyme on extractability of jackfruit seeds starch

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化實驗

2.2.1 中心復(fù)合實驗設(shè)計及結(jié)果分析 中心復(fù)合實驗設(shè)計與結(jié)果見表2。

表2 中心復(fù)合實驗設(shè)計與結(jié)果

2.2.2 回歸模型方差分析 利用Design-Expert 8.0.6軟件對表2數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多元回歸擬合,得到提取率y對自變量X1、X2、X3和X4的二次多項回歸方程:

提取率=-367.45643+4.51515X1+46.96964X2+2108.71950X3+19.59065X4-0.12763X1X2-7.40000X1X3-0.059188X1X4-52.95000X2X3-0.021921X12-4.03214X22-6147.42857X32-0.82491X42對上述回歸模型進(jìn)行方差分析,見表3。

由表3可知,該模型的p<0.0001<0.01,說明實驗選用的二次多項模型極其顯著,失擬項p=0.2809>0.05,模型失擬項不顯著。模型復(fù)相關(guān)系數(shù)R2=0.9488,說明明因變量與4個自變量之間的線性關(guān)系顯著。由F檢驗可得回歸模型中各因素對淀粉提取率影響的重要性依次為:加酶量>溫度>時間>料液比。此模型可以用來進(jìn)行響應(yīng)值的預(yù)測。模型中一次項X1、X3與X4極顯著,X2顯著;交互項X1X2、X1X3、X1X4與X2X3顯著;二次項X12、X22、X32、X42均極顯著。變異系數(shù)(CV)反應(yīng)模型的置信度,CV值越小,模型的置信度越高。若CV值大于10,說明模型不能較好的反應(yīng)真實值,不可以用二次多項回歸方程分析響應(yīng)值的變化。該模型的變異系數(shù)CV=4.44說明該模型可以較好的用來分析響應(yīng)值的變化。

2.2.3 響應(yīng)面分析 響應(yīng)面法是優(yōu)化存在多因素影響實驗條件的尋優(yōu)方法,通過固定數(shù)量的實驗次數(shù)可以連續(xù)的對實驗因素進(jìn)行分析,并得到直觀的3D曲線圖進(jìn)而評價各因素間的交互作用[19]。分別將模型中其他2個因素固定在0水平,繪制溫度和液料比、溫度和加酶量、溫度和時間以及料液比和加酶量對菠蘿蜜種子淀粉提取率的相互影響三維曲面圖,如圖5所示,從圖上可知等高線為橢圓形,這表明兩因素交互作用顯著,這與模型方差分析結(jié)果一致。

表3 回歸模型方差分析表

圖a反映的是因素A(溫度, ℃)和因素B(料液比,mL/g)對淀粉提取率的交互影響。隨著溫度和液料比的升高,菠蘿蜜種子淀粉提取效果先升高后降低。在55～65 ℃與3.5∶1～4.5∶1 mL/g范圍內(nèi),存在淀粉提取率的極值。圖b反映的是因素A(溫度, ℃)和因素C(加酶量,%)對淀粉提取率的交互影響。從圖中可以看出溫度和加酶量對淀粉提取率影響較大。在55～65 ℃與0.08～0.10%范圍內(nèi),存在淀粉提取率的極值。圖c反映的是因素A(溫度, ℃)和因素D(時間,h)對淀粉提取率的交互影響。在55～65 ℃與7～8.5 h范圍內(nèi),存在淀粉提取率的極值。圖d反映的是因素B(料液比,mL/g)和因素C(加酶量,%)對淀粉提取率的交互影響。其響應(yīng)面相對較陡,表明加酶量和液料比對菠蘿蜜種子淀粉提取效果的影響較大。在3.5∶1～4.5∶1 mL/g與0.08～0.10%范圍內(nèi),存在淀粉提取率的極值。所有4個影響因素中酶添加量是最顯著的影響因素,其次是反應(yīng)溫度、料液比和反應(yīng)時間。

圖5 兩顯著交互效應(yīng)對提取率的影響Fig.5 Response surface plots showing the efects of interactions of time/temperature/enzyme or substrate ratio with water to solid ratio on the yield of jackfruit seeds starch

2.2.4 驗證實驗 由Design-Expert 8.0.6軟件分析可知,最大響應(yīng)值對應(yīng)的因素條件為:時間8.29 h,溫度62.33 ℃,液料比4.05∶1 mL/g,加酶量0.10%,淀粉提取率預(yù)測值為60.02%?？紤]到實際操作中的條件控制,對上述工藝參數(shù)進(jìn)一步改進(jìn)為:時間8 h,溫度62 ℃,液料比4∶1 mL/g,加酶量0.10%。在此工藝條件下,進(jìn)行3次驗證實驗,測得淀粉的提取率為61.83%,與理論預(yù)測值較為接近,且與模型預(yù)測值僅偏差1.81%,表明該模型對淀粉的提取工藝條件優(yōu)化是可行的。

2.2.5 主要成分分析 由表5可知,在最佳工藝條件基礎(chǔ)下提取的菠蘿蜜種子淀粉的水分含量為5.25%,蛋白質(zhì)含量為0.98%,脂肪為0.29%,灰分為0.13%。蛋白質(zhì)、脂肪均高于馬鈴薯淀粉和玉米淀粉,水分小于馬鈴薯淀粉和玉米淀粉,符合淀粉標(biāo)準(zhǔn)。灰分介于馬鈴薯淀粉和玉米淀粉之間。

表5 菠蘿蜜種子粉與淀粉主要成分的對比

注:同一列相同字母代表p<0.05水平無顯著性差異。3 結(jié)論

在單因素實驗的基礎(chǔ)上,采用響應(yīng)面法對菠蘿蜜種子淀粉提取工藝進(jìn)行優(yōu)化得出最佳工藝條件為:時間8 h,溫度62 ℃,液料比4∶1 mL/g,加酶量0.10%。菠蘿蜜種子淀粉提取率理論值為60.02%。實際驗證值為61.83%。兩者較接近,此工藝參數(shù)可為菠蘿蜜種子淀粉工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

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Optimization of enzymatic extraction technology condition of starch from Jackfruit seed using response surface methodology

CHU Zhong1,HU Mei-jie1,2,XU Fei1,TAN Le-he1,ZHAO Jing2,ZHANG Yan-jun1,*

(1.Spice and Beverage Research Institute,CATAS,Wanning 571533,China;2.Department of Food and Environmental,East University of Heilongjiang,Harbin 150086,China)

In order to obtain the maximum starch extraction,four main variables were studied based on the results of a single-factor tests including time,extraction temperature,ratio of liquid to solid and enzyme amount. A central composite design(CCD)was employed to optimize the combination of time,extraction temperature,ratio of liquid to solid and enzyme amount. This resulted in the optimal condition in regards of time,reaction temperature,ratio of solid to liquid and enzyme amount at 8 h,62 ℃,4∶1 mL/g,and 0.10%,respectively. Under the optimal condition,the starch extraction was 60.02%,which was in good agreement with the value of 61.83% predicted by the model. The established extraction technology conditions were stable for jackfruit seed starch and it can provide theory basis for industrialized production of jackfruit seed starch.

Jackfruit;starch;response surface methodology

2016-03-23

初眾(1981-)，男，碩士，助理研究員，研究方向：食品加工與貯藏，E-mail：cz809@163.com。

*通訊作者:張彥軍(1982-)，男，博士研究生，副研究員，研究方向：熱帶作物加工，E-mail：zhangyanjun0305@163.com。

國家自然科學(xué)基金資助項目(31501403)。

TS

A

1002-0306(2016)20-0000-00

10.13386/j.issn1002-0306.2016.20.000