李 莎,白瑞櫻,曾道平,伍志權(quán),沈玉棟,徐振林,楊金易

(1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室,廣東省食品質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東廣州 510642;2.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)生理學(xué)與神經(jīng)生物學(xué)教研室,河南新鄉(xiāng) 453003;3.廣州萬聯(lián)生物科技有限公司,廣東廣州 510642;4.廣東匯信農(nóng)產(chǎn)品檢驗(yàn)有限公司,廣東佛山 528200)

?

李 莎,白瑞櫻,曾道平,伍志權(quán),沈玉棟,徐振林,楊金易

(1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室,廣東省食品質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東廣州 510642;2.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)生理學(xué)與神經(jīng)生物學(xué)教研室,河南新鄉(xiāng) 453003;3.廣州萬聯(lián)生物科技有限公司,廣東廣州 510642;4.廣東匯信農(nóng)產(chǎn)品檢驗(yàn)有限公司,廣東佛山 528200)

本研究采用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金溶液,并對(duì)β-興奮劑單克隆抗體進(jìn)行標(biāo)記。通過棋盤滴定法和單因素實(shí)驗(yàn)確定最佳的實(shí)驗(yàn)參數(shù),研制出能同時(shí)檢測(cè)多種β-興奮劑的膠體金免疫層析試紙條。結(jié)果表明,本方法對(duì)克倫特羅的靈敏度最高,檢測(cè)線性范圍(IC20～I(xiàn)C80)為0.31～4.52 μg/L,IC50為1.18 μg/L,檢出限(LOD,IC10)為0.14 μg/L,豬尿樣品無需處理,直接檢測(cè),單個(gè)樣品檢測(cè)時(shí)間只需8 min;與沙丁胺醇、馬布特羅、溴布特羅、氯丙那林、西馬特羅等β-興奮劑類藥物都有交叉,能實(shí)現(xiàn)β-興奮劑的多殘留檢測(cè)。對(duì)陰性豬尿的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)中,試紙條批內(nèi)實(shí)驗(yàn)回收率在83.6%～102.2%之間,試紙條批間實(shí)驗(yàn)回收率在84.2%～101.5%之間,且相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均在10%以內(nèi),與ELISA、HPLC/MS法的對(duì)比實(shí)驗(yàn)表明,該試紙條能應(yīng)用于豬尿中β-興奮劑多殘留的定量檢測(cè)。

膠體金,免疫層析試紙條,β-興奮劑,定量檢測(cè),多殘留檢測(cè)

β-興奮劑(β-agonist)全稱β-腎上腺素受體激動(dòng)劑(β-adrenoceptor agonist),是一類化學(xué)結(jié)構(gòu)和生理功能類似腎上腺素和去腎上腺素的苯乙胺類藥物[1]。β-興奮劑在臨床上常用于防治人、畜的支氣管痙攣和哮喘等病癥[2]。大劑量的β-興奮劑能影響營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)在動(dòng)物體內(nèi)的重新分配,加快脂肪的分解代謝,增加蛋白質(zhì)的合成,顯著提高瘦肉率[3]。因此,β-興奮劑曾被作為飼料添加劑廣泛用于畜牧生產(chǎn)中。β-興奮劑在動(dòng)物內(nèi)臟蓄積嚴(yán)重,能通過食物鏈進(jìn)入人體,使人出現(xiàn)心悸、頭暈、心律失常等癥狀,嚴(yán)重時(shí)甚至?xí)?dǎo)致死亡[4]。我國(guó)農(nóng)業(yè)部發(fā)布的第235號(hào)公告《動(dòng)物性食品中獸藥最高殘留限量》明確規(guī)定克倫特羅、沙丁胺醇、西馬特羅及其鹽、酯類不得檢出,第1519號(hào)公告《禁止在飼料和動(dòng)物飲水中使用的物質(zhì)》中馬布特羅、溴布特羅、氯丙那林也被列其中。目前用于β-興奮劑多殘留檢測(cè)的方法很多,包括氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)[5-6]、超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(UHPLC-MS)[7]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS/MS)[8]、酶聯(lián)免疫法(ELISA)[9]、化學(xué)發(fā)光法[10]、電化學(xué)傳感器[11-12]和其他新型檢測(cè)方法[13]等。雖然這些方法靈敏度高、特異性好、準(zhǔn)確度高,但是這些方法需要專業(yè)實(shí)驗(yàn)人員、大型實(shí)驗(yàn)儀器和繁瑣的樣品預(yù)處理。

膠體金免疫層析檢測(cè)技術(shù)(colloidal gold immunochromatographic assay,GICA)因其快速、方便,適用于現(xiàn)場(chǎng)篩查,被廣泛應(yīng)用于食品安全檢測(cè)中[14-17]。目前用于檢測(cè)β-興奮劑殘留的膠體金免疫層析檢測(cè)技術(shù)已經(jīng)很多[18-20],Zhang等建立了同時(shí)檢測(cè)克倫特羅和萊克多巴胺的膠體金免疫層析試紙條,兩者的靈敏度均為(0.1±0.01) ng/mL[18]。近年來關(guān)于免疫層析試紙條定量檢測(cè)的報(bào)道越來越多,其中使用T/C比值法來實(shí)現(xiàn)定量檢測(cè)是目前最常用的方法,該方法能夠在一定時(shí)間內(nèi)消除免疫反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的差異,縮短判讀時(shí)間[21-22]。本研究基于膠體金標(biāo)記β-興奮劑單克隆抗體,結(jié)合方便、快捷的免疫層析定量檢測(cè)技術(shù),建立了同時(shí)檢測(cè)豬尿中多種β-興奮劑殘留的膠體金免疫層析定量檢測(cè)方法,對(duì)于食品中快速篩查β-興奮劑具有重要參考價(jià)值和實(shí)際應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

克倫特羅、沙丁胺醇、萊克多巴胺 中國(guó)獸醫(yī)藥品檢查所;馬布特羅、溴布特羅、西馬特羅、氯丙那林、鹽酸腎上腺素、硫酸異丙腎上腺素及重酒石酸去甲腎上腺素 阿拉丁試劑;β-興奮劑單克隆抗體(31D11細(xì)胞株)、包被原(CL-BSA)、羊抗鼠 廣州優(yōu)抗多生物技術(shù)有限公司;氯金酸 美國(guó)Sigma公司;檸檬酸三鈉 廣州市化學(xué)試劑廠;牛血清白蛋白BSA 美國(guó)Sigma公司;硝酸纖維素膜 美國(guó)Whatan公司;玻璃纖維素膜 美國(guó)Ahlstrom公司;吸水紙、PVC底板 基因有限公司;其余試劑 均為國(guó)產(chǎn)分析純;β-興奮劑ELISA商業(yè)化試劑盒 廣州萬聯(lián)生物技術(shù)有限公司,陰性豬尿 由廣東溫氏食品集團(tuán)股份有限公司提供。

膠體金免疫層析讀數(shù)儀 南京微測(cè)生物科技有限公司;HGS 510劃膜噴金標(biāo)機(jī)、HGS 201高速切條機(jī) 杭州峰航科技有限公司;超低溫高速離心機(jī) 美國(guó)Eppenndorf公司;磁力攪拌器 德國(guó)IKA公司;S-520掃描電鏡 日本日立公司;NanoDrop 2000c微量紫外分光光度計(jì) 美國(guó)Thermo公司;DHG-9123A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海一恒科技有限公司;多功能酶標(biāo)儀 美國(guó)Thermo公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 膠體金溶液的制備 采用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金溶液[23]。在圓底燒瓶加入200 mL 0.01%的氯金酸溶液,燒至沸騰后迅速加入4 mL 1%檸檬酸三鈉水溶液,觀察溶液顏色,溶液由黃色變成灰色,后逐漸變成紅色,繼續(xù)攪拌加熱3 min,直至溶液的顏色穩(wěn)定后,關(guān)閉電源繼續(xù)攪拌5 min,靜置冷卻后轉(zhuǎn)移到玻璃瓶中,4 ℃冰箱保存,并采用透射電鏡鑒定質(zhì)量。

1.2.2 金標(biāo)抗體的制備 將10 mL膠體金溶液加入50 mL的具塞玻璃瓶中,加入80 μL 0.1 mol/L K2CO3調(diào)節(jié)膠體金溶液到最佳pH,放置于磁力攪拌器上攪拌均勻。再加入9.6 μL的β-興奮劑單克隆抗體至膠體金溶液中,室溫下攪拌30 min。再逐滴加入1/10體積的10% BSA封閉液來封閉多余的膠體金結(jié)合位點(diǎn),持續(xù)攪拌30 min。然后12000 r/min離心20 min,去除上清液,再加入復(fù)溶液將金標(biāo)抗體濃縮為原體積1/5,4 ℃保存待用。

1.2.3 膠體金免疫層析試紙條制備及參數(shù)的優(yōu)化 試紙條由金標(biāo)結(jié)合墊、硝酸纖維膜(NC膜)、樣品墊、吸水墊和底板(PVC)5部分組成。將金標(biāo)結(jié)合墊裁成4 mm的細(xì)條,將制備好的金標(biāo)結(jié)合物鋪?zhàn)⒃诮Y(jié)合墊上,置于37 ℃恒溫烘干,烘干后備用。將制備好的15 mm吸水墊、25 mm NC膜、4 mm金標(biāo)結(jié)合墊、18 mm樣品墊,由頂部依次粘于PVC板上,用切條機(jī)切成4 mm寬的試紙條裝入檢測(cè)卡中即完成試紙條的組裝。

表1 棋盤滴定優(yōu)化金標(biāo)稀釋倍數(shù)和CL-BSA噴涂濃度

通過棋盤滴定實(shí)驗(yàn)確定最優(yōu)的金標(biāo)抗體稀釋倍數(shù)和CL-BSA噴涂濃度,選取陰性樣本T、C線顯色正常,陽性樣本(c(CL)=1.5 μg/L)抑制率最高為最優(yōu)條件,并對(duì)膠體金免疫層析試紙條T、C線免疫反應(yīng)動(dòng)力學(xué)曲線進(jìn)行測(cè)定,步驟如下:將70 μL陰性質(zhì)控滴加在試紙條的加樣孔中,每隔1 min用膠體金免疫層析讀數(shù)儀讀取試紙條中T、C線的T、C值及T/C值,并追蹤記錄30 min。

1.2.4 膠體金免疫層析試紙條標(biāo)曲的建立 取陰性的豬尿樣品配制濃度分別為0、0.0156、0.0625、0.250、1.00、4.00、16.0、64.0 μg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液,用于試紙條檢測(cè),每個(gè)濃度重復(fù)檢測(cè)3次,8 min后用膠體金免疫層析讀數(shù)儀讀取試紙條T/C比值。以不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品的T/C為縱坐標(biāo),標(biāo)準(zhǔn)品濃度對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)做圖,采用Origin軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合,繪制試紙條競(jìng)爭(zhēng)抑制曲線,計(jì)算試紙條50%競(jìng)爭(zhēng)抑制率濃度以及確定試紙條檢測(cè)線性范圍。

1.2.5 交叉反應(yīng)率 以克倫特羅(CL)交叉反應(yīng)率(CR)為100%,采用1.2.4的方法分別繪制β-興奮劑化學(xué)結(jié)構(gòu)和生理功能的類似物的競(jìng)爭(zhēng)抑制曲線,通過公式(1)計(jì)算β-興奮劑類似物對(duì)CL的交叉反應(yīng)率:

式(1)

1.2.6 膠體金免疫層析試紙條方法評(píng)價(jià) 分別用批內(nèi)、批間試紙條的回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)來評(píng)價(jià)試紙條的精確度。批內(nèi)實(shí)驗(yàn)是使用同一批試紙條對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)(n=3),計(jì)算回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD);批間實(shí)驗(yàn)是使用不同批試紙條每隔5 d連續(xù)3次對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)(n=3),計(jì)算回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。

與商業(yè)化的ELISA進(jìn)行比較來驗(yàn)證膠體金試紙條的實(shí)用性。采用同一批試紙條以及商品化的β-興奮劑ELISA試劑盒同時(shí)檢測(cè)20份含有不同濃度CL的尿樣,計(jì)算CL的濃度,并比較膠體金免疫層析試紙條定量方法與ELISA試劑盒定量方法的相關(guān)性,采用與HPLC/MS進(jìn)行比較來驗(yàn)證膠體金試紙條的準(zhǔn)確性。采用同一批試紙條以及HPLC/MS同時(shí)檢測(cè)9份含有不同濃度CL的尿樣,計(jì)算CL的濃度,并比較膠體金免疫層析試紙條定量方法與HPLC/MS方法的相關(guān)性。

2 結(jié)果與分析

2.1 膠體金質(zhì)量鑒定

制備的膠體金采用透射電子顯微鏡表征,如圖1所示,制備的膠體金顆粒呈圓形、大小均一,隨機(jī)挑選20個(gè)膠體金顆粒,計(jì)算平均值為18 nm。

圖1 膠體金透射電鏡圖(80 k)Fig.1 TEM image of colloidal gold particles(80 k)

2.2 膠體金免疫層析試紙條參數(shù)的優(yōu)化

金標(biāo)抗體的稀釋倍數(shù)和CL-BSA噴涂濃度會(huì)影響試紙條T、C線深淺以及試紙條檢測(cè)靈敏度。本實(shí)驗(yàn)通過棋盤滴定法優(yōu)化CL-BSA噴涂濃度和金標(biāo)抗體的稀釋倍數(shù),使試紙條的陰性顯色和檢測(cè)靈敏度最佳。如表1可以得出,隨著CL-BSA濃度增加和金標(biāo)抗體稀釋倍數(shù)的減小,T、C線的讀數(shù)逐漸增加,且抑制率下降。由表1可知,第5、6、9組抑制率相差不大,從中選取抑制率較高且讀數(shù)較大的一組——當(dāng)金標(biāo)抗體稀釋倍數(shù)為1.5倍,CL-BSA噴涂濃度為0.68 mg/mL時(shí),試紙條在克倫特羅(CL)的標(biāo)品濃度為1.5 ng/mL時(shí)的抑制率達(dá)到55.42%,且試紙條T、C線的讀數(shù)相對(duì)較強(qiáng),選此條件進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

膠體金免疫層析試紙條反應(yīng)時(shí)間的確定是試紙條定量檢測(cè)的前提。試紙條上T、C讀數(shù)隨時(shí)間的變化可以間接反映免疫學(xué)中抗原抗體的動(dòng)態(tài)反應(yīng)過程。本實(shí)驗(yàn)用膠體金免疫層析讀數(shù)儀每隔1 min記錄試紙條T、C和T/C比值,追蹤記錄30 min。如圖2可知,在30 min內(nèi)T、C線的讀數(shù)隨著時(shí)間延長(zhǎng)不斷升高,22 min后趨于穩(wěn)定;但T/C比值在8 min之后就趨于穩(wěn)定,且隨后8～30 min無明顯變化,表明T/C值的定量方法能夠在一定時(shí)間內(nèi)消除免疫反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的差異,縮短判讀時(shí)間。因此,膠體金免疫層析試紙條定量檢測(cè)時(shí)間為8 min。

圖2 膠體金免疫層析試紙條T、C線免疫反應(yīng)動(dòng)力學(xué)曲線的測(cè)定Fig.2 The determination of the kinetic reaction curve of test line and control line of Colloidal gold immunochromatographic strip

2.3 膠體金免疫層析試紙條標(biāo)曲的建立

為了減少樣品基質(zhì)的干擾,本實(shí)驗(yàn)直接在陰性豬尿中添加CL標(biāo)準(zhǔn)品,用來配置CL系列標(biāo)準(zhǔn)樣品,建立膠體金免疫層析試紙條的標(biāo)準(zhǔn)曲線,見圖3。

表2 交叉反應(yīng)測(cè)定結(jié)果

表3 膠體金免疫層析試紙條的精密度和準(zhǔn)確度

在最佳的優(yōu)化條件下建立GICA的標(biāo)準(zhǔn)曲線的檢測(cè)線性范圍為(IC20～I(xiàn)C80)為0.31～4.52 μg/L,50%競(jìng)爭(zhēng)抑制率濃度(IC50)為1.18 μg/L,檢出限(IC10)為0.14 μg/L。

圖3 克倫特羅膠體金免疫層析試紙條競(jìng)爭(zhēng)抑制曲線Fig.3 Standard curve for CL by Colloidal gold immunochromatographic strip

2.4 交叉反應(yīng)

β-興奮劑是一類化學(xué)結(jié)構(gòu)和生理功能類似的苯乙胺類衍生物。以CL的交叉反應(yīng)率(CR)為100%,本實(shí)驗(yàn)測(cè)定了10種結(jié)構(gòu)功能類似的β-興奮劑的交叉反應(yīng)率。如表2,沙丁胺醇、馬布特羅、溴布特羅、氯丙那林、西馬特羅對(duì)克倫特羅都有交叉率。說明此種方法可以對(duì)β-興奮劑進(jìn)行多殘留檢測(cè)。

2.5 膠體金免疫層析試紙條方法評(píng)價(jià)

選取CL、SAL兩種標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行添加回收實(shí)驗(yàn),分別測(cè)量回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)對(duì)膠體金免疫層析試紙條進(jìn)行方法評(píng)價(jià)。在陰性的豬尿中分別添加不同濃度的CL、SAL標(biāo)準(zhǔn)品,用膠體金免疫層析試紙條進(jìn)行檢測(cè),以膠體金免疫層析試紙條批內(nèi)、批間的回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)來評(píng)價(jià)該方法的準(zhǔn)確性和精確度。結(jié)果如表3所示,當(dāng)CL的加標(biāo)濃度為0.5、1.5、3 μg/L時(shí),試紙條的批內(nèi)回收率為91.8%、94.4%、97.2%,批間回收率為84.2%、91.2%、102.3%;當(dāng)SAL加標(biāo)濃度為1.0、2.0、4.0 μg/L時(shí),試紙條的批內(nèi)回收率為83.6%、84.2%、102.2%,批間回收率為86.7%、96.2%、101.5%,且試紙條批內(nèi)、批間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)都小于10%。以上結(jié)果表明,該方法具有良好的回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD),能夠應(yīng)用于β-興奮劑多殘留的定量檢測(cè)中。

2.6 與ELISA試劑盒比較

將膠體金免疫層析試紙條與商業(yè)化的ELISA試劑盒進(jìn)行比較,對(duì)膠體金免疫層析試紙條的實(shí)用性進(jìn)行評(píng)價(jià)。在20份陰性豬尿中添加一系列1.0～3.0 μg/L的CL,采用同一批試紙條和ELISA試劑盒進(jìn)行檢測(cè),分別計(jì)算CL的含量。由圖4可知,兩種方法的線性相關(guān)方程為y=0.9759x+0.1283,R2=0.9647,表明這兩種方法有較好的相似性。且與商業(yè)化的ELISA試劑盒相比,膠體金免疫層析試紙條操作簡(jiǎn)單,檢測(cè)時(shí)間短,能夠更好的應(yīng)用于實(shí)際樣品的篩查中。

圖4 GICA與ELISA方法的比較Fig.4 Methodology comparison between the GICA and ELISA methods

2.7 與HPLC/MS方法的比較

將膠體金免疫層析試紙條與HPLC/MS方法進(jìn)行比較,進(jìn)一步對(duì)膠體金免疫層析試紙條的準(zhǔn)確性進(jìn)行評(píng)價(jià)。在3份陰性豬尿中分別添加0.5、1.5、3.0μg/L的CL,采用同一批試紙條和HPLC/MS方法進(jìn)行檢測(cè),分別計(jì)算CL的含量。由圖5可知,兩種方法的線性相關(guān)方程為y=1.1509x-0.0552,R2=0.9643,表明這兩種方法有較好的相似性,說明該研究研制的試紙條檢測(cè)方法準(zhǔn)確可靠。

圖5 GICA與HPLC/MS方法的比較Fig.5 Methodology comparison between the GICA and HPLC/MS methods

3 結(jié)論

本研究成功建立了豬尿中β-興奮劑多殘留的膠體金免疫層析技術(shù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,該方法結(jié)合T/C定量檢測(cè)方法,對(duì)豬尿中克倫特羅的檢測(cè)范圍在0.31～4.52 μg/L,豬尿樣品無需處理,直接檢測(cè),檢測(cè)時(shí)間只需8 min;且與沙丁胺醇、馬布特羅、溴布特羅、氯丙那林、西馬特羅等β-興奮劑類藥物都有交叉,能實(shí)現(xiàn)β-興奮劑的多殘留檢測(cè)。將本實(shí)驗(yàn)研制的試紙條和ELSA、HPLC/MS同時(shí)對(duì)豬尿樣品進(jìn)行檢測(cè),該方法與ELISA、HPLC/MS結(jié)果基本相符,說明該方法有較好的準(zhǔn)確性和實(shí)用性。

[1]汪慧蓉.β-興奮劑克倫特羅、沙丁胺醇的免疫檢測(cè)方法研究[D]. 西安:西北大學(xué),2006.

[2]Kips J C,Pauwels R A. Long-acting inhaled beta2-agonist therapy in asthma[J]. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine,2001,164(6):923-932.

[3]Mersmann H J. Overview of the effects of beta-adrenergic receptor agonists on animal growth including mechanisms of action[J]. Journal of Animal Science,1998,76(1):160-172.

[4]Salpeter S R,Buckley N S,Ormiston T M,et al. Meta-analysis:Effect of long-acting beta-agonists on severe asthma exacerbations and asthma-related deaths[J]. Annals of Internal Medicine,2006,144(12):904-912.

[5]Wang L,Li Y,Zhou Y,et al. Determination of Fourβ2-Agonists in Meat,Liver and Kidney by GC-MS with Dual Internal Standards[J]. Chromatographia,2010,71(7-8):737-739.

[6]Bocca B,Fiori M,Cartoni C,et al. Simultaneous determination of zilpaterol and other beta agonists in calf eye by gas chromatography/tandem mass spectrometry[J]. Journal of AOAC International,2003,86(1):8-14.

[7]Wang L,Pu R C,Wang X X,et al. Multiresidue Determination ofβ2-Agonists Including Phenylethanolamine A in Animal-Derived Food by Ultra-High Performance Liquid Chromatography/Tandem Mass Spectrometry[J]. Journal of Chromatographic Science,2015,53(6):925-931.

[8]Wang L,Zeng Z,Wang X,et al. Multiresidue analysis of nine beta-agonists in animal muscles by LC-MS/MS based on a new polymer cartridge for sample cleanup[J]. Journal of Separation Science,2013,36(11):1843-1852.

[9]Ren X,Zhang F,Chen F,et al. Development of a sensitive monoclonal antibody-based ELISA for the detection of clenbuterol in animal tissues[J]. Food and Agricultural Immunology,2009,20(PII 9168559194):333-344.

[10]Wu Y,Xu F,Jiang H,et al. Determination of Salbutamol,Clenbuterol,and Brombuterol in Urine by a Highly Sensitive Chemiluminescence Enzyme Immunoassay[J]. Analytical Letters,2014,47(16):2761-2773.

[11]Lin X,Ni Y,Kokot S. A novel electrochemical sensor for the analysis ofβ-agonists:The poly(acid chrome blue K)/graphene oxide-nafion/glassy carbon electrode[J]. Journal of Hazardous Materials,2013,260:508-517.

[12]Wang H,Zhang Y,Li H,et al. A silver-palladium alloy nanoparticle-based electrochemical biosensor for simultaneous detection of ractopamine,clenbuterol and salbutamol[J]. Biosensors and Bioelectronics,2013,49:14-19.

[13]Chen X,Luo Y,Shi B,et al. Chemiluminescence diminishment on a paper-based analytical device:high throughput determination of beta-agonists in swine hair[J]. Analytical Methods,2014,6(24):9684-9690.

[14]謝雪欽.免疫層析試紙條標(biāo)記探針研究進(jìn)展[J]. 食品安全質(zhì)量檢測(cè)學(xué)報(bào),2014(7):2138-2145.

[15]謝艷君,楊英,孔維軍,等. 基于不同納米材料的側(cè)流免疫層析技術(shù)在真菌毒素檢測(cè)中的應(yīng)用[J]. 分析化學(xué),2015(4):618-628.

[16]徐超蓮,賴衛(wèi)華,劉道峰. 膠體金免疫層析法檢測(cè)食品中天然存在的危害物質(zhì)的研究進(jìn)展[J]. 食品科學(xué),2014(5):257-261.

[17]張道宏,李培武,張奇,等. 污染糧油食品的主要真菌毒素及膠體金免疫層析技術(shù)在快速檢測(cè)中的應(yīng)用[J]. 中國(guó)油料作物學(xué)報(bào),2010(4):577-582.

[18]Zhang M,Wang M,Chen Z,et al. Development of a colloidal gold-based lateral-flow immunoassay for the rapid simultaneous detection of clenbuterol and ractopamine in swine urine[J]. Analytical and Bioanalytical Chemistry,2009,395(8):2591-2599.

[19]李超輝,羅薇,徐波,等. 膠體金免疫層析試紙條定量檢測(cè)豬尿中克倫特羅[J]. 食品科學(xué),2013,34(12):114-118.

[20]姜金慶,楊雪峰,王自良,等. 克倫特羅和萊克多巴胺多殘留膠體金免疫層析試紙條的研制[J]. 畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào),2013(1):87-94.

[21]Duan H,Chen X,Xu W,et al. Quantum-DoT submicrobead-based immunochromatographic assay for quantitative and sensitive detection of zearalenone[J]. Talanta,2015,132:126-131.

[22]Ren M,Xu H,Huang X,et al. Immunochromatographic Assay for Ultrasensitive Detection of Aflatoxin B1 in Maize by Highly Luminescent Quantum Dot Beads[J]. ACS Applied Materials & Interfaces,2014,6(16):14215-14222.

[23]曾文亮,楊金易,王弘,等. 苯甲酸免疫膠體金快速檢測(cè)試紙條的研制[J]. 食品工業(yè)科技,2013(16):70-74.

Investigation of colloidal gold immunochromatographic strip for quantitative determination of variety ofβ-agonists in swine urine

LI Sha1,BAI Rui-ying2,ZENG Dao-ping3,WU Zhi-quan4,SHEN Yu-dong1,*,XU Zhen-lin1,YANG Jin-yi1,*

(1.Laboratory of Quality and Safety Risk Assessment in Agricultural Products Preservation Ministry of Agriculture,Guangdong Provincial Key Laboratory of Food Quality and Safety,College of Food Science,South China Agriculture University,Guangzhou 510642,China;2.Department of Physiology and Neurobiology,Xinxiang Medical University,Xinxiang 453003,China;3.Guangzhou Wanlian Biological Technology Co.,Ltd.,Guangzhou 510642,China;4.Guangdong Huixin Agricultural product Inspection Co.,Ltd.,Foshan 528200,China)

In this study,the colloidal gold was obtained by reducing gold chloride with sodium citrate. Then,the colloidal gold and beta-agonists monoclonal antibody was conjugated. By optimized experimental parameters with chessboard titration method and single factor experiment,a method for Colloidal gold immunochromatographic quantitative detection of variety of beta-agonists in swine urine was established. The results showed that the method exhibited dynamic linear range(IC20～I(xiàn)C80)for the detection of clenbuterol(CL)from 0.31 μg/L to 4.52 μg/L,with the median inhibitory concentration(IC50)of 1.18 μg/L,the limit of detection(LOD,IC10)was 0.14 μg/L. Samples were detected directly without treatment,the detection time was only 8 min for each sample. The result showed that the developed method had cross reaction rate with salbutamol,mabuterol,brombuterol,cimaterol,clorprenaline and other beta-agonists,which could achieve multiresidue determination of beta-agonists. In the negative swine urine sample standard addition recovery experiment,the recoveries for intra-assay ranged from 83.6% to 102.2% and inter-assay ranged from 84.2% to 101.5%,and the relative standard deviation of intra-assay and inter-assay were both less than 10%. The comparison experiment with ELISA and HPLC/MS tests showed that the test strip could be used in the multiresidue determination of beta-agonists in swine urine.

colloidal gold;immunochromatographic test strip;beta-agonists;quantitative detection;multiresidue determination

2016-05-04

李莎(1990-),女,在讀碩士研究生,研究方向:食品質(zhì)量與安全,E-mail:lisha199007@163.com。

廣州市珠江科技新星專項(xiàng)(2013J2200080);國(guó)家星火計(jì)劃項(xiàng)目(2012GA780001,2013GA780035);廣東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(S2013030013338);NSFC-廣東聯(lián)合基金項(xiàng)目(U1301214);國(guó)家科技支持計(jì)劃課題(2012BAD31B0302);廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2012A020100002);廣州市科技計(jì)劃項(xiàng)目(2014J4200015)。

TS207.3

A

1002-0306(2016)20-0000-00

10.13386/j.issn1002-0306.2016.20.000

*通訊作者:沈玉棟(19 -),

楊金易(1979-),男,博士,副研究員,研究方向:食品質(zhì)量與安全,E-mail:yjy361@163.com。