劉寧，陳春山，時(shí)曉，杜迎春，何宏軒

(1.北京市水生野生動(dòng)植物救護(hù)中心，北京市鱘魚鮭鱒魚創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)，北京102100；2.中國科學(xué)院動(dòng)物研究所，北京100101)

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細(xì)鱗鮭細(xì)菌性敗血癥病原菌的分離鑒定及藥敏實(shí)驗(yàn)

劉寧1, 2，陳春山1，時(shí)曉1，杜迎春1，何宏軒2*

(1.北京市水生野生動(dòng)植物救護(hù)中心，北京市鱘魚鮭鱒魚創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)，北京102100；2.中國科學(xué)院動(dòng)物研究所，北京100101)

從21尾患病細(xì)鱗鮭Brachymystaxlenok體內(nèi)分離到1株致病菌，經(jīng)分離培養(yǎng)、生化鑒定、16S rDNA序列分析及人工感染實(shí)驗(yàn)，確定該病原菌為嗜水氣單胞菌Aeromonashydrophila。采用26種抗菌藥物進(jìn)行藥敏分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，分離菌株對氨芐西林、頭孢呋辛鈉、卡那霉素等10種抗生素敏感；對羧芐西林、頭孢噻肟、環(huán)丙沙星、新霉素等9種抗生素中度敏感；對大觀霉素、諾氟沙星、四環(huán)素等7種藥物耐受，為細(xì)鱗鮭細(xì)菌性疾病的防控提供了重要依據(jù)。

細(xì)鱗鮭；嗜水氣單胞菌；分離；鑒定；藥敏實(shí)驗(yàn)

細(xì)鱗鮭Brachymystaxlenok屬鮭形目Salmoniformes鮭科Salmonidae細(xì)鱗魚屬Brachymystax，是我國名貴的陸封型冷水性珍稀魚類(王所安，1989)，具有重要的生態(tài)、科研和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。近年來，由于生態(tài)環(huán)境惡化、人為干擾等因素的影響，細(xì)鱗鮭在我國的分布區(qū)域急劇縮小，種群數(shù)量銳減，1988年被列為國家Ⅱ級(jí)重點(diǎn)保護(hù)水生野生動(dòng)物，并被《中國瀕危動(dòng)物紅皮書》收錄(樂佩琦，陳宜瑜，1998)。

北京市水生野生動(dòng)植物救護(hù)中心養(yǎng)殖的細(xì)鱗鮭出現(xiàn)鰭條、頭部充血，眼球突出，死亡等現(xiàn)象。解剖后發(fā)現(xiàn)腹腔內(nèi)有積水，肝臟有出血點(diǎn)。在無菌環(huán)境下，從死亡的21尾細(xì)鱗鮭體內(nèi)分離得到一優(yōu)勢菌株，檢測率為100%，并將該菌命名為SS-2。經(jīng)生化鑒定、16S rDNA序列分析確定為嗜水氣單胞菌Aeromonashydrophila，用該菌感染健康細(xì)鱗鮭能夠引起其腹鰭基部出血、體表潰瘍等癥狀，與自然患病魚體癥狀一致，確定其為致病菌。本研究對該菌株進(jìn)行藥敏實(shí)驗(yàn)，為細(xì)鱗鮭細(xì)菌性疾病的防控技術(shù)研究奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)對象 患病細(xì)鱗鮭21尾，健康細(xì)鱗鮭24尾，體質(zhì)量15～18 g，體長10～12 cm，均取自北京市水生野生動(dòng)植物救護(hù)中心；陽性菌株嗜水氣單胞菌取自中國科學(xué)院動(dòng)物研究所野生動(dòng)物疫病實(shí)驗(yàn)室菌庫。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑與設(shè)備 胰蛋白胨大豆瓊脂(TSA)、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基購自北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司；PhoenixTM100全自動(dòng)細(xì)菌鑒定/藥敏分析儀(美國BD公司)；標(biāo)準(zhǔn)藥敏試紙購自中國食品藥品檢定研究院；DNA Marker DL2000購自寶生物工程(大連)有限公司；2×Taq PCR Master Mix和瓊脂糖凝膠回收試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司。室內(nèi)全封閉循環(huán)過濾水族箱(長115 cm×寬60 cm×高50 cm)采用自動(dòng)控溫裝置，水溫控制在15 ℃±1 ℃。

1.1.3 引物合成 采用細(xì)菌16S rDNA通用引物27F和1492R，引物序列為27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，1492R：5’-GGTTACCTTGTTACGA-CTT-3’，由北京六合華大基因科技股份有限公司合成。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 患病魚體的剖檢 無菌條件下按照從外到內(nèi)的原則，對具有典型病癥的細(xì)鱗鮭進(jìn)行臨床檢查。檢查體表、鰓、內(nèi)臟等有無病變。

1.2.2 細(xì)菌的分離、純化 無菌條件下，用接種環(huán)蘸取病灶、鰓、肝、脾等病變部位，采用劃線法接種于TSA培養(yǎng)基上，28 ℃恒溫培養(yǎng)18～24 h，觀察細(xì)菌的生長狀況及菌落特征，挑選形態(tài)、色澤一致的優(yōu)勢菌落進(jìn)行純化，反復(fù)純化2次以獲得單菌落，4 ℃冷藏備用。

1.2.3 細(xì)菌的生化鑒定 首先對分離菌株SS-2進(jìn)行革蘭氏染色，根據(jù)染色結(jié)果選擇相應(yīng)的檢測板(陽性板-PID或陰性板-NID)，并在Phoenix肉湯試管上標(biāo)記好樣本號(hào)；其次，用無菌棉拭子蘸取分離菌株的新鮮純培養(yǎng)物，置于Phoenix肉湯試管中混懸，蓋上試管蓋顛倒混勻(避免產(chǎn)生氣泡)，再用PhoenixSpec比濁儀將濁度調(diào)至0.5～0.6；最后，將接種物沿填充端口倒入51孔檢測板中(確保每個(gè)孔都填滿)，蓋上檢測板密封蓋并在30 min內(nèi)上機(jī)檢測，8～12 h讀取檢測結(jié)果。

1.2.4 16S rDNA基因擴(kuò)增 以分離純化菌液、陽性對照菌液及陰性對照無菌肉湯作為模板，用50 μL反應(yīng)體系進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，其中引物濃度為10 μmol·L-1，反應(yīng)體系為：上、下游引物各2 μL，純化菌液2 μL，無菌水19 μL。PCR 反應(yīng)條件設(shè)置為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，30個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸7 min。通過瓊脂糖凝膠電泳對PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測，并對目的條帶進(jìn)行回收、測序。

1.2.5 人工感染實(shí)驗(yàn) 選取健康細(xì)鱗鮭24尾，分別飼養(yǎng)在2個(gè)水循環(huán)控溫水族箱內(nèi)，實(shí)驗(yàn)前暫養(yǎng)14 d以適應(yīng)環(huán)境。設(shè)實(shí)驗(yàn)組和對照組，每組12尾。根據(jù)相關(guān)資料(陳冬香，2010；朱成科等，2011；楊寧等，2014)和前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果，按照平板計(jì)數(shù)法制成每毫升108CFU的細(xì)菌懸液，通過背鰭基部注射方式進(jìn)行感染，注射劑量為0.2 mL，對照組注射0.2 mL無菌肉湯。以15 d作為實(shí)驗(yàn)周期，期間每天觀察受試細(xì)鱗鮭的活力、攝食、發(fā)病癥狀及死亡情況，并做好相關(guān)記錄。最后，對感染發(fā)病細(xì)鱗鮭進(jìn)行剖檢、細(xì)菌分離、PCR鑒定，確定分離細(xì)菌的致病性。

1.2.6 藥物敏感性實(shí)驗(yàn) 選取26種抗菌藥物，根據(jù)美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)(CLSI)推薦的K-B瓊脂法進(jìn)行，將培養(yǎng)24 h的菌液均勻涂布于檢測平板上，每個(gè)平板貼5張紙片，將平板倒置，28 ℃培養(yǎng)24 h，測量抑菌圈直徑，藥敏結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)按照CLSI(2005)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 病魚的臨床癥狀

病魚腹鰭、臀鰭基部及鰭條充血，肛門紅腫突出；上下頜、鰓蓋、眼眶周圍等整個(gè)頭部嚴(yán)重充血；腹腔內(nèi)有積水，肝臟、腎臟等內(nèi)臟器官顏色均較淡，且肝臟有出血點(diǎn)。

圖1 分離菌株SS-2的菌落形態(tài)(a)、革蘭氏染色(b)

2.2 菌落的形態(tài)特征與理化特性

分離菌株SS-2在TSA培養(yǎng)基28 ℃培養(yǎng)24 h，菌落長勢良好，呈圓形光滑、邊緣整齊、半透明或不透明，較隆起，未見水溶性棕色色素產(chǎn)生，有特殊氣味。經(jīng)革蘭氏染色為陰性短桿菌(圖1)。PhoenixTM100全自動(dòng)細(xì)菌鑒定系統(tǒng)結(jié)果顯示分離菌株SS-2為嗜水氣單胞菌Aeromonashydrophila(表1)，結(jié)合各項(xiàng)生理生化指標(biāo)與《伯杰氏細(xì)菌學(xué)手冊》等材料中所列的嗜水氣單胞菌基本吻合，僅在L-丙氨酸、賴氨酸脫羧酶反應(yīng)、蔗糖和阿拉伯糖的利用上存在差異。因此，初步將分離菌株SS-2鑒定為嗜水氣單胞菌。

2.3 PCR擴(kuò)增結(jié)果

分離菌株SS-2擴(kuò)增后的16S rDNA序列條帶如圖2，其條帶位置與陽性對照條帶位置一致，為1 500 bp左右。將SS-2的16S rDNA序列遞交NCBI進(jìn)行BLAST比對分析，結(jié)果SS-2的基因序列與GenBank中的嗜水氣單胞菌(KF578015.1)具有較高的同源性。這與PhoenixTM100全自動(dòng)細(xì)菌鑒定系統(tǒng)鑒定的結(jié)果一致，即可確定分離菌株SS-2為嗜水氣單胞菌。

表1 分離菌株SS-2的生理生化鑒定結(jié)果

注： +示陽性, -示陰性, ND示未檢測到結(jié)果。

Notes： + positive, - negative, ND indicates there is no response to the test.

2.4 人工感染實(shí)驗(yàn)結(jié)果

實(shí)驗(yàn)組細(xì)鱗鮭1周內(nèi)開始發(fā)病，初期病魚游動(dòng)遲緩、精神沉郁，離群獨(dú)游，動(dòng)作緩慢或陣發(fā)性急游；隨著感染時(shí)間加長病魚出現(xiàn)背部體色發(fā)黑，眼睛及其周圍出血，腹鰭、臀鰭基部及肛門紅腫、充血，有的個(gè)體背鰭基部潰瘍；死亡個(gè)體鰓顏色變淡，腹部積水，肝臟、腎臟有出血點(diǎn)，與自然患病個(gè)體癥狀基本一致。發(fā)病及死亡數(shù)量隨感染時(shí)間持續(xù)增加，至感染中期(第7～9天)累計(jì)發(fā)病8尾，其中累計(jì)死亡5尾，至第15天實(shí)驗(yàn)結(jié)束，發(fā)病率為100%，僅存活1尾(圖3)。此外，死亡現(xiàn)象多出現(xiàn)在實(shí)驗(yàn)中后期，死亡率高達(dá)91.67%。通過對死亡個(gè)體的細(xì)菌分離、純化、PCR鑒定(圖2)，再次得到嗜水氣單胞菌。綜合上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，嗜水氣單胞菌是引起細(xì)鱗鮭發(fā)病的致病菌，由該致病菌引起的疾病癥狀符合細(xì)菌性敗血癥。注射無菌肉湯的對照組細(xì)鱗鮭進(jìn)食及活動(dòng)正常，未發(fā)病。

2.5 藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果

在26種常用抗菌藥物中，分離菌株SS-2對氨芐西林、頭孢呋辛鈉、卡那霉素等10種抗生素敏感；對羧芐西林、頭孢噻肟、環(huán)丙沙星、新霉素等9種抗生素中度敏感；對大觀霉素、諾氟沙星、四環(huán)素等7種藥物耐受(表2)。

圖2 分離菌株SS-2 16S rDNA PCR擴(kuò)增結(jié)果

M.D 2 000 Marker, 1.陰性對照, 2.嗜水氣單胞菌SS-2, 3.人工感染分離菌株, 4.陽性對照。

M.D 2 000 Marker, 1.Negative control, 2.AeromonashydrophilaSS-2, 3.Artificial infection strain, 4.Positive control.

圖3 人工感染實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3 討論

近年來，由于魚類養(yǎng)殖密度增大、水質(zhì)惡化等因素，各種細(xì)菌引起的疾病發(fā)病頻繁，其中已報(bào)道的魚類細(xì)菌性病原涉及氣單胞菌屬、弧菌屬、假單胞菌、愛德華氏菌屬等十幾屬的數(shù)十種(殷站，徐伯亥，1995；楊興麗,2001)。嗜水氣單胞菌在有的資料中也記作親水氣單胞菌，是一種廣泛存在于水體中可引起魚類及其他水生動(dòng)物多種病害的細(xì)菌。陳言峰等(2015)從寶石鱸Scortumbarcoo體內(nèi)分離出2株嗜水氣單胞菌，病魚表現(xiàn)為肝臟土黃色、肛門紅腫、腹部膨脹有積水，魚體表面潰爛部位少；梁利國和謝駿(2013)從青魚Mylopharyngodonpiceus體內(nèi)分離出嗜水氣單胞菌，病魚表現(xiàn)為腹部腫脹、肛門紅腫；此外，該菌也能引起草魚Ctenopharyngodonidellus、黃鱔Monopterusalbus、鰱魚Hypophthalmichthysmolitrix、鯉魚Cyprinuscarpio、泥鰍Misgurnusanguillicaudatus、鰻魚、團(tuán)頭魴Megalobramaamblgcephala等多種淡水養(yǎng)殖魚類發(fā)生細(xì)菌性敗血癥，在不同的文獻(xiàn)中也常根據(jù)病癥將其稱為暴發(fā)病、出血病、腹水病等(陳懷清，陸承平，1991；徐伯亥等，1993；張曉君等，2006；陳婷婷等，2014)，此菌致死率極高。

表2 分離菌株SS-2的藥物敏感性

注： R.耐藥, I.中度敏感, S.敏感。

Notes： R.drug resistance, I.moderately sensitive, S.sensitive.

本研究中細(xì)鱗鮭也出現(xiàn)類似敗血癥的癥狀，從發(fā)病魚體內(nèi)分離得到菌株SS-2，經(jīng)過對其形態(tài)學(xué)、生理生化特征及16S rDNA基因序列分析，鑒定為嗜水氣單胞菌。通過人工感染實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步證實(shí)細(xì)鱗鮭腹鰭、臀鰭及眼睛充血或出血死亡等是由嗜水氣單胞菌引起。通過藥物敏感性實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，該菌株對26種藥物中絕大多數(shù)符合《漁用藥物使用準(zhǔn)則》的抗菌藥物具有敏感性(10種敏感，9種中度敏感)，僅有7種藥物表現(xiàn)出耐藥性，耐藥范圍相對較小。因此，在對感染嗜水氣單胞菌的細(xì)鱗鮭用藥治療過程中應(yīng)注重藥物的選取和用量，避免盲目用藥。另外，人工感染實(shí)驗(yàn)表明，健康細(xì)鱗鮭從感染細(xì)菌到出現(xiàn)癥狀需1周左右時(shí)間，從發(fā)病到死亡也需1周左右的時(shí)間，在這一時(shí)間段內(nèi)采取用藥防治措施對治愈疾病、降低死亡率具有重要意義。

細(xì)鱗鮭是中華人民共和國農(nóng)業(yè)部在東北、西北、華北地區(qū)進(jìn)行生態(tài)修復(fù)增殖放流的珍稀魚類，是近幾年推廣養(yǎng)殖的冷水魚新品種，發(fā)病率很低。經(jīng)過調(diào)研，近幾年在黑龍江、吉林、陜西等地養(yǎng)殖場相繼出現(xiàn)的苗種不明原因死亡現(xiàn)象，癥狀基本與本實(shí)驗(yàn)病魚相同，由于細(xì)鱗鮭對藥物敏感性較強(qiáng)，治療效果不佳會(huì)造成一定經(jīng)濟(jì)損失。該致病菌的檢出，提醒養(yǎng)殖單位要對細(xì)鱗鮭疾病預(yù)防引起高度重視。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在細(xì)鱗鮭發(fā)病1周內(nèi)，采取內(nèi)服和水體消毒方法，可以取得較好的治療效果，而且細(xì)鱗鮭對上述實(shí)驗(yàn)藥物未產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)。

陳冬香. 2010. 斑點(diǎn)叉尾鮰細(xì)菌性敗血癥病原的分離、鑒定與病理學(xué)觀察[D]. 長沙: 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué).

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Isolation, Identification and Antimicrobial Sensitivity of Pathogen fromBrachymystaxlenokwith Septicemia

LIU Ning1, 2, CHEN Chunshan1, SHI Xiao1, DU Yingchun1, HE Hongxuan2*

(1.Beijing Aquatic Wildlife Rescue and Conservation Center, Innovative Team Sturgeon and Trout, Beijing 102100, China;2.Institute of Zoology, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100101, China)

A pathogenic bacterium was isolated from 21 diseasedBrachymystaxlenok.Through morphological, biochemical identification and 16S rDNA sequence analysis as well as animal experiments, the bacterium was identified asAeromonashydrophila.Drug susceptibility test of 26 kinds of drugs showed that, the strain was sensitive to 10 kinds of antibiotics including ampicillin, cefuroxime sodium, kanamycin, etc., moderately sensitive to carbenicillin, cefotaxime, ciprofloxacin, neomycin, etc., but resistant to 7 kinds of antibiotics including spectinomycin, norfloxacin and tetracycline, etc.The results provided a basis for bacterial diseases surveillance ofB.lenok.

Brachymystaxlenok;Aeromonashydrophila; isolation; identification; drug susceptibility test

2016-01-12 接受日期：2016-04-13

北京市農(nóng)業(yè)局科技項(xiàng)目(20140118)；北京市鱘魚鮭鱒魚創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目(SCGWZJ 20141102-2)

劉寧(1986—)，女，碩士，專業(yè)方向：水生野生動(dòng)物馴養(yǎng)繁殖, E-mail：annening@163.com

*通信作者Corresponding author，男，研究員，研究方向：野生動(dòng)物疫病，E-mail：hehx@ioz.ac.cn

10.11984/j.issn.1000-7083.20160018

S941.12

A

1000-7083(2016)03-0435-05