索麗娟, 羅磊, 高學斌, 趙洪峰

(1.陜西省動物研究所，西安710032；2.陜西師范大學生命科學學院，西安710119)

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Cd2+處理后麻雀腦組織中糖皮質(zhì)激素受體和鹽皮質(zhì)激素受體表達變化

索麗娟1, 羅磊1, 高學斌1, 趙洪峰2*

(1.陜西省動物研究所，西安710032；2.陜西師范大學生命科學學院，西安710119)

目的 檢測在Cd2+處理后糖皮質(zhì)激素受體(GR)和鹽皮質(zhì)激素受體(MR)在麻雀Passermontanus腦組織中的表達變化。方法 6只麻雀隨機分成2組，每組3只。處理組飲水中添加500 μg·L-1Cd2+,對照組不添加。用ClustalW2將麻雀的GR和MR氨基酸序列與其他物種氨基酸序列進行相似性比對分析。采用Real-time PCR檢測基礎(chǔ)水平下麻雀各組織中GR和MR基因的表達水平。Cd2+處理后，測定GR和MR基因在腦組織中的表達變化。結(jié)果 麻雀與斑胸草雀Taeniopygiaguttata和原雞Gallusgallus的GR和MR氨基酸序列的相似性大于90%；GR和MR基因在麻雀肝臟、腸、心臟、眼球、腦、肺、肌肉、腎臟和性腺9個組織中均有表達；Cd2+處理后，處理組腦組織中GR和MR mRNA表達水平均上調(diào)，且顯著高于對照組(P<0.05)。結(jié)論 GR和MR在麻雀各組織中廣泛表達；推測GR和MR基因在Cd2+的應(yīng)激反應(yīng)中具有重要作用，具體作用還有待于進一步論證，同時該研究為野外工作提供了一定的實驗依據(jù)。

糖皮質(zhì)激素受體；鹽皮質(zhì)激素受體；麻雀;基因表達；應(yīng)激

鳥類是野生動物的一個重要類群，是食物鏈中的高級消費者。鳥類廣泛分布于不同生態(tài)環(huán)境以及生態(tài)環(huán)境中的不同生態(tài)位，生活史較為復雜，壽命較長，體溫高，代謝速率快，從環(huán)境中獲取物質(zhì)相對多，對自然環(huán)境變化較為敏感(Donaldetal.，2001；Gregoryetal.，2005)。另一方面，鳥類生理行為(內(nèi)分泌和組織發(fā)育)對于重金屬污染物有顯著的響應(yīng)(Janssensetal.，2003；Burger & Eichhorstetal.，2005，2007；Carereetal.，2010)，因而常被作為環(huán)境污染的代表性指示物種。

重金屬鎘(Cd)是動物體內(nèi)的非必需元素，屬于環(huán)境內(nèi)分泌干擾物，具有激素效應(yīng)，對生殖和內(nèi)分泌功能有較大的影響(Messner & Bernhard，2010)。隨著現(xiàn)代工農(nóng)業(yè)的發(fā)展，Cd2+被大量釋放，對環(huán)境造成了污染。通過測定鳥體組織(Burger & Eichhorst，2005；張丹等，2013；Luoetal.，2015)中重金屬的含量可以反映鳥類所處環(huán)境中的重金屬濃度。但該方法不足以反映重金屬污染的實際毒理效應(yīng)，所以本研究擬從分子水平上探討重金屬污染對鳥類的影響。

長期的Cd2+污染對鳥是一種慢性應(yīng)激刺激，Cd2+往往通過取食、飲水、呼吸等途徑在鳥體內(nèi)積累。鳥類應(yīng)激反應(yīng)的最早表現(xiàn)為糖皮質(zhì)激素(glucocorticoid，GC)濃度升高(Sapolskyetal.，2000；Romero，2004)。GC由腎上腺分泌，是下丘腦-垂體-腎上腺(hypothalamus-pituitary-adrenal，HPA)軸激活的終產(chǎn)物，同時可以負反饋調(diào)節(jié)HPA軸，抑制HPA軸的活性(Aguilera，1998)，也可以動員能量儲備，調(diào)節(jié)一系列激素的合成和作用，抑制免疫系統(tǒng)功能，并促進避害和自我維持行為(Wingfield & Kitaysky，2002；鄧瓊，2014)，其功能的發(fā)揮往往依賴糖皮質(zhì)激素受體(glucocorticoid receptors，GR)和鹽皮質(zhì)激素受體(mineralocorticoid receptors，MR)(Duetal.，2014)。GR和MR作為核受體可以調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄(基因組反應(yīng))(Oitzletal.，2010)，同時也可以介導快速的非基因組反應(yīng)(Groenewegetal.，2011，2012)。在脊椎動物中，GR和MR的核苷酸和氨基酸序列高度保守(Kwoketal.，2007；Okaetal.，2013)。斑胸草雀TaeniopygiaguttataGR和MR的部分DNA片段已經(jīng)被克隆(Hodgsonetal.，2007)，并成功預測出全長cDNA，且正確性已經(jīng)被表達序列標簽(expressed sequence tag)技術(shù)證實(Warrenetal.，2010)。

麻雀Passermontanus是一種常見的雜食性雀形目留鳥，數(shù)量龐大，分布廣泛，且易于獲取，實驗室飼養(yǎng)技術(shù)成熟，所以被選為本實驗的研究對象。首先，將麻雀的GR和MR氨基酸序列與其他物種的進行相似性比較；其次，通過Real-time PCR測定基礎(chǔ)水平下GR和MR基因在麻雀不同組織中的表達狀況；然后比較Cd2+處理前、后麻雀腦組織中GR和MR基因表達的變化。本研究旨在探討秦嶺水域附近麻雀體內(nèi)GR和MR基因表達水平變化能否作為監(jiān)測秦嶺水源涵養(yǎng)區(qū)重金屬污染的敏感標志物之一，并為其提供實踐基礎(chǔ)和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗對象 6只麻雀購于陜西省西安市朱雀路花鳥魚蟲市場，體質(zhì)量19.6～20.3 g，均健康無病，飼養(yǎng)在陜西師范大學生命科學學院動物實驗室。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機分成2組，每組3只。處理組飲水中含有500 μg·L-1Cd2+，對照組不添加Cd2+。實驗期間，麻雀可以自由取食飲水，食物(帶殼的谷子)充足，每日換水3次(早、中、晚)。

1.1.2 主要試劑 RNAiso Plus試劑盒(TaKaRa)，氯仿(天津市天力化學試劑有限公司)，異丙醇(天津市天力化學試劑有限公司)，無水乙醇(天津市天力化學試劑有限公司)，焦碳酸二乙酯(DEPC，Amresco)，瓊脂糖(Biowest Agarose)，F(xiàn)astQuant cDNA第一鏈合成試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司]，Taq酶(TaKaRa)，普通瓊脂糖凝膠回收試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司]，SYBR?PremixExTaqTMⅡ(TaKaRa)。

1.1.3 主要儀器 CFX96 TouchTM熒光定量PCR檢測儀(Bio-Rad)，高速冷凍離心機(Thermo)，Nanodrop分光光度計(Thermo)，凝膠成像分析系統(tǒng)(Bio-Rad)。

1.2 方法

1.2.1 總RNA提取 飼養(yǎng)15 d后處死麻雀，解剖取其肝臟、腸、心臟、眼球、腦、肺、肌肉、腎臟和性腺9個組織，液氮澆凍研磨。研磨后按RNAiso Plus試劑盒說明書提取麻雀各組織RNA。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA完整性。用Nanodrop分光光度計測定RNA樣品濃度和OD260/OD280值。樣品存于液氮中備用。

1.2.2 總RNA反轉(zhuǎn)錄 用DEPC水稀釋每個RNA樣品濃度至1 μg·μL-1。以此為模板按FastQuant cDNA第一鏈合成試劑盒說明書合成cDNA第一鏈。將反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 Real-time PCR反應(yīng)檢測體系

根據(jù)GenBank中報道的麻雀GR(登錄號：KJ414462.1)和MR(登錄號：KJ414463.1)基因序列，利用Primer 5設(shè)計引物，由上海華大基因科技有限公司合成(表1)。

利用CFX96 TouchTM熒光定量PCR檢測儀對各基因的表達情況進行檢測，反應(yīng)體系如下：0.5 μL 20 μmol·μL-1的上、下游引物，1 μL反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，12.5 μL SYBR?PremixExTaqTMⅡ，10.5 μL ddH2O。反應(yīng)條件為95 ℃30 s；95 ℃5 s，56 ℃30 s，72 ℃30 s，35個循環(huán)；在最后1個循環(huán)結(jié)束后做熔解曲線，溫度65 ℃～95 ℃。同一樣品重復3個反應(yīng)。結(jié)果采用2-△Ct和2-△△Ct法進行相對表達分析，以β-actin作為內(nèi)參基因?qū)Y(jié)果進行標準化。

表1 實驗引物的相關(guān)信息

1.4 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果

2.1 麻雀GR和MR氨基酸序列相似性分析

在美國國立生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)中獲得8個物種GR和MR的氨基酸序列，采用ClustalW2進行相似性分析(表2)。結(jié)果表明，麻雀與斑胸草雀、原雞Gallusgallus的氨基酸序列相似性較高，均高于90%，與斑馬魚Daniorerio的相似性最低，僅為54.70%。

2.2 GR和MR基因在基礎(chǔ)水平各組織的表達分析

采用Real-time PCR檢測到GR和MR mRNA在麻雀各組織中均有表達，其在心臟和肌肉中的相對表達量高于其他組織，肝臟、眼球、腦和肺次之，腸、腎臟和性腺較低。腦中的相對表達量與其他各組織相比，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(圖1)。

表2 麻雀與其他8個物種糖皮質(zhì)激素受體和鹽皮質(zhì)激素受體氨基酸序列的比對

圖1 在麻雀不同組織中糖皮質(zhì)激素受體(GR)和鹽皮質(zhì)激素受體(MR) mRNA的相對表達量(結(jié)果用2-△Ct分析)

2.3 Cd2+對麻雀腦組織GR和MR基因表達的影響

在飲水中加入500 μg·L-1Cd2+15 d后，處理組麻雀腦組織中GR和MR mRNA的表達水平均上調(diào)，且顯著高于對照組(P<0.05)(圖2)。

圖2 Cd2+對麻雀腦組織中糖皮質(zhì)激素受體(GR)和鹽皮質(zhì)激素受體(MR) mRNA表達量的影響 (結(jié)果用2-△△Ct分析)

3 討論

GR和MR因參與GC的下游調(diào)控而備受關(guān)注。ClustalW2分析結(jié)果表明，麻雀的GR和MR氨基酸序列與其他鳥類、魚類、兩棲類、爬行類和哺乳類存在相似性。與斑胸草雀的相似性最高，這與它們同屬于雀形目是相對應(yīng)的。另外，有研究表明，GR和MR在家麻雀P.domesticus和斑胸草雀中廣譜表達并且參與應(yīng)激反應(yīng)(Schmidtetal.，2010；Lattin & Romero，2014)，推測麻雀的GR和MR基因也具有類似的分布特征和功能。

對麻雀基礎(chǔ)水平下GR和MR基因的組織表達分析是研究這2個基因功能的重要基礎(chǔ)工作。本實驗隨后測定了麻雀不同組織中GR和MR mRNA的相對表達量。Real-time PCR結(jié)果分析顯示，GR和MR在麻雀的9個組織中均有表達，與家麻雀(Lattinetal.，2012)和斑胸草雀(Schmidtetal.，2010)的研究結(jié)果類似，且在肌肉、心臟中表達較高?？傮w來說，在具有代謝功能的組織中GR和MR表達相對較高，如肝臟是糖異生的主要場所，腎臟是第二場所，肌肉中可以產(chǎn)生糖異生的底物——氨基酸，這些組織可能參與應(yīng)激反應(yīng)時的能量動員。

應(yīng)激反應(yīng)中，GC的濃度會隨著機體生理、環(huán)境和社會等因素的變化而變化(Lattinetal.，2012)。GC通過與GR和MR結(jié)合發(fā)揮生物學效應(yīng)，并且這2種受體與GC的親和力不同。MR與GC的親和力高于GR，低水平GC優(yōu)先與MR結(jié)合，高水平GC優(yōu)先與GR結(jié)合(Oitzletal.，2010)。高水平的GC與GR結(jié)合之后，GR被激活，GR-GC復合物進入細胞核內(nèi)，對下游促炎轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮轉(zhuǎn)錄抑制的調(diào)節(jié)作用，進而達到抗炎的效應(yīng)(de Kloetetal.，2005)。另外，在代謝性組織(肌肉、肝臟、脂肪等)中GR-GC可以與GC應(yīng)答元件結(jié)合，促進參與糖異生、蛋白分解和脂肪分解相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄表達(Poletietal.，2015)。哺乳動物大腦富含GR和MR，而GR和MR共同參與HPA軸的負反饋調(diào)節(jié) (Rozeboometal.，2007；Oitzletal.，2010)。在應(yīng)激反應(yīng)中，大腦中的MR主要負責維持神經(jīng)元的完整性和穩(wěn)定性(Oitzletal.，2010)，GR通過抑制HPA的過度反應(yīng)使GC恢復到基礎(chǔ)水平(Tasker & Herman，2011)。為了解Cd2+處理后，麻雀腦組織中GR和MR的表達變化，本實驗在麻雀飲水中添加500 μg·μL-1Cd2+15 d后，對其腦組織中MR和GR mRNA表達水平進行檢測，結(jié)果顯示GR和MR mRNA表達水平均顯著上調(diào)。有研究表明，MR過表達的雄性轉(zhuǎn)基因小鼠腦組織中的GC水平低于正常小鼠，由此可見，MR過表達可能會降低GC水平(Kanatsouetal.，2015)。綜上所述，推測上調(diào)的MR和GR mRNA都有可能降低GC濃度并使其恢復到正常的水平。隨著時間的延長，GC是否會恢復到正常水平，長時間Cd2+刺激是否會引起大腦的病理變化，還有待進一步研究。

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Expression of Glucocorticoid Receptors and Mineralocorticoid Receptors in the Brain ofPassermontanusafter Cadmium Treatment

SUO Lijuan1, LUO Lei1, GAO Xuebin1, ZHAO Hongfeng2*

(1.Shaanxi Institute of Zoology, Xi’an 710032, China; 2.College of Life Science, Shaanxi Normal University, Xi’an 710119, China)

Objective The expression levels of glucocorticoid receptors (GR) and mineralocorticoid receptors (MR) were measured in the brain ofPassermontanusafter cadmium treatment.Method SixP.montanuswere randomly divided into 2 groups.Treatment group was fed with water of 500 μg·L-1Cd2+.Alignment of amino acid sequence of GR and MR was performed using the ClustalW2.Real-time PCR was performed to study the baseline expression levels of GR and MR among different tissues.Finally, the expressions of GR and MR were determined in the brain ofP.montanusafter cadmium treatment.Result The result of amino acid sequence alignment showed that the GR and MR ofP.montanushad high similarity withTaeniopygiaguttataandGallusgallus(>90%).Real-time PCR results showed that the GR and MR expressed in all of nine detected organs and tissues.Compared with the control, the expression levels of GR and MR were significantly up-regulated after cadmium treatment (P<0.05).Conclusion The GR and MR were widely expressed in tissues ofP.montanus.GR and MR might play a significant role under the cadmium stress.This research provided the experimental evidence for fieldwork.

glucocorticoid receptors; mineralocorticoid receptors;Passermontanus; gene expression; stress

2015-11-05 接受日期：2016-03-02 基金項目：陜西省科學院重大項目(2013K-01); 國家自然科學基金項目(31372201)

索麗娟(1985—), 女, 碩士, 研究實習員, 研究方向： 秦嶺水源涵養(yǎng)區(qū)水質(zhì)污染對鳥類毒性效應(yīng), E-mail：slj1030@163.com

*通信作者Corresponding author，男, 副教授, E-mail：zhaohf@snnu.edu.cn

10.11984/j.issn.1000-7083.20150346

Q786; Q959.7

A

1000-7083(2016)03-0409-05